植物活体基因导入装置制造方法
【专利摘要】本实用新型公开了植物活体基因导入装置，适用性广、操作简便、转染效率高。其技术方案为：本实用新型依据植物细胞生物物理学及植物形态学理论，采用微电子技术、计算机技术和生物工程技术结合设计的电脉冲导入装置，该装置包括电脉冲发生器和电脉冲导入组件组成。相较于现有技术，本实用新型的应用电脉冲技术将基因直接导入到植物活体中，操作简单快速，同时本实用新型是一种物理方式导入，所以对植物的种类没有限制，适用性广。
【专利说明】植物活体基因导入装置
【技术领域】
[0001]本实用新型涉及一种基于电脉冲技术的植物活体基因导入装置，尤其涉及将DNA、RNA、siRNA和其他各种核酸物质直接导入植物活体中的装置。
【背景技术】
[0002]目前植物转基因的方法主要分为三类，一、载体介导的转化方法，包括农杆菌介导法及病毒介导法；二、直接导入法，包括基因枪、脂质体法、电击法、显微注射法等；三、种质系统法，包括花粉管通道法、浸泡转染法、胚囊子房注射法等。
[0003]其中应用最广泛的方法是农杆菌介导法，该方法首先将外源基因转入农杆菌中，然后再通过农杆菌侵染靶组织，从而将外源基因携带入植物细胞中。该方法的缺点是操作步骤繁琐，转染效率低，而且主要对双子叶植物有效，对大多数单子叶植物无效。
[0004]病毒介导法因为采用病毒作为载体，其安全性目前仍存在很大的争议。
[0005]基因枪法能够直接将基因导入植物细胞中，但其只能导入表层细胞，而且操作过程繁琐，因此很难获得转基因植物，更多的用于瞬时表达的检测；显微注射法需要昂贵的设备，对操作人员的技术要求很高；而且以上方法基本都是对离体植物组织进行操作。
[0006]种质系统法是对活体植物进行操作，但其受植物花期的限制，操作时间非常受限，而且需要在外界环境下进行，工作量非常大，获得转基因的效率却很低。
[0007]以上几种植物转基因技术适用面窄、操作繁琐。
实用新型内容
[0008]本实用新型的目的在于提供了一种植物活体基因导入装置，适用性广、操作简便、转染效率高。
[0009]本实用新型的技术方案为:本实用新型揭示了一种植物活体基因导入装置，包括电脉冲发生器和电脉冲导入组件，其中电脉冲发生器进一步包括电源模块、脉冲参数选择和实施模块、脉冲发生模块、信息反馈模块、存储模块、信息传输模块以及微控制器，其中:
[0010]电源模块用于提供电脉冲发生的能量；
[0011]脉冲参数选择和实施模块根据脉冲波的反馈信息调整下一个电脉冲的参数，以保持靶部位每次收到的脉冲能量恒定；
[0012]脉冲发生模块发出两组电脉冲，第一组电脉冲将植物细胞壁击穿，第二组电脉冲改变细胞膜的结构，使细胞膜产生可逆的孔道；
[0013]信息反馈模块检测电脉冲导入部位的阻抗并反馈至脉冲参数选择和实施模块；
[0014]存储模块用于存储基因导入记录；
[0015]信息传输模块用于本机与上位机的信息交互，实现上位机对本机的指导；
[0016]微控制器用于控制各个模块的运作；
[0017]电脉冲导入组件连接电脉冲发生器，用于将电脉冲发生器发出的电脉冲传输到植物的待导入部位中。[0018]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，脉冲发生模块发出的第一组电脉冲是指数波或方波，第二组电脉冲是方波，每组内的若干个脉冲波是恒能量电脉冲，每个脉冲能量为0.005J - 130J,电压为5 - 500V,每组脉冲个数为I 一 20个，频率为I 一60Hz。
[0019]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，电脉冲导入组件是针式电极、片状电极、或片针结合电极。
[0020]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，针式电极由基座、连接器和电极组成，电极为数根导电电针，电针以平行排列等距的方式安装在基座中，电针的数目为2 — 8根，直径为0.1mm 一 0.45mm,电针的尾端通过导线与连接器连接，连接器通过导线或者直接与电脉冲发生器的输出端连接。
[0021]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，片状电极由基座、连接器和电极组成，电极为两片导电片，该导电片的形状包括平面、凸面、或凹面，该两片导电片分别固定在镊型基座的两个夹子上，电极通过导线与连接器连接，连接器通过导线或直接与电脉冲发生器的输出端相连。
[0022]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，片针结合电极由基座、连接器和电极组成，电极为数个电针和一块导电片，电针的直径为0.lmm-0.45mm，数量为1_8个；导电片的形状包括平面、凸面、或凹面，电针和导电片分别固定在镊型基座的两个夹子上，电极通过导线与连接器连接，连接器通过导线或直接与电脉冲发生器输出端相连。
[0023]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，电脉冲导入组件的电极由导电材料制成。
[0024]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，欲导入基因或其它预处理物质涂抹在电极上。
[0025]根据本实用新型的植物活体基因导入装置的一实施例，装置先将基因注射到植物的待导入部位再施加电脉冲，或者先进行电脉冲再将基因注射到待导入部位，或者基因注射和电脉冲导入同时进行。
[0026]本实用新型对比现有技术有如下的有益效果:本实用新型的方案是依据植物细胞生物物理学及植物形态学理论，采用微电子技术、计算机技术和生物工程技术结合设计的电脉冲导入装置。该装置包括电脉冲发生器和电脉冲导入组件组成。相较于现有技术，本实用新型的应用电脉冲技术将基因直接导入到植物活体中，操作简单快速，同时本实用新型是一种物理方式导入，所以对植物的种类没有限制，适用性广。
【专利附图】
【附图说明】
[0027]图1示出了本实用新型的植物活体基因导入装置的实施例的原理图。
[0028]图2A、2B示出了本实用新型的电源模块的原理图。
[0029]图3A、3B示出了本实用新型的装置的电气原理图。
[0030]图4示出了本实用新型的装置的控制原理图。
[0031]图5A — 5C示出了本实用新型的装置的使用流程图。
[0032]图6A — 6F示出了本实用新型的装置的电脉冲导入组件结构的图。
[0033]图7示出了本实用新型明的电脉冲发生器和电脉冲导入组件的连接图。【具体实施方式】
[0034]下面结合附图和实施例对本实用新型作进一步的描述。
[0035]图1示出了本实用新型的植物活体基因导入装置的实施例的原理。请参见图1，本实施例的装置包括电脉冲发生器10和电脉冲导入组件12。其中电脉冲发生器10进一步包括电源模块100、脉冲参数选择和实施模块101、脉冲发生模块102、信息反馈模块103、存储模块104、信息传输模块105以及微控制器106。
[0036]这些模块之间的连接关系如图1所示，电源模块100的输出端连接微控制器106，脉冲参数选择和实施模块101的输入端连接微控制器106，其输出端连接脉冲发生模块102。信息传输模块105、存储模块104和信息反馈模块103分别和微控制器106建立双向的数据连接。脉冲发生模块102的输出端连接电脉冲导入组件12，电脉冲导入组件12的输出端连接信息反馈模块103。
[0037]脉冲发生模块102发出两组电脉冲，第一组电脉冲将植物细胞壁击穿，第二组电脉冲改变细胞壁的结构，使细胞壁产生可逆的孔道。第一组电脉冲是指数波或方波，第二组电脉冲是方波，每组内的若干个脉冲波是恒能量电脉冲，每个脉冲能量为0.005J - 130J,电压为5 - 500V，每组脉冲个数为I 一 20个，频率为I 一 60Hz。较佳的能量是52mJ、156mJ、466mJ,电压为36V，脉冲个数为6个，频率为IHz ;或者较佳的能量是576mJ，电压为60V，脉冲个数为6个，频率为IHz。
[0038]信息反馈模块103检测导入部位的电流并经由微控制器106反馈至脉冲参数选择和实施模块101。脉冲参数选择和实施模块101根据脉冲波的反馈信息调整下一个电脉冲的参数，以保持靶部位每次收到的脉冲能量恒定。
[0039]存储模块104用于存储基因导入记录。
[0040]电源模块100用于提供电脉冲发生的能量。电源模块100提供合适的脉冲电压和波形等导入参数。图2A、2B示出了电源模块的原理，图2A示出了直流电源的一种实施方式，电池组经由电压处理模块分为5 - 500V和(DC5V，DC3.3V)两路，其中5 — 500V这一路用于驱动电脉冲信号，而(DC5V，DC3.3V)这一路用于系统控制。图2B示出了交流电源的一种实施方式，220V交流电通过电压隔离、电源滤波之后，第一路经过电压处理之后形成5 —500V的驱动电压，第二路经过变压处理和电压处理之后形成5V和3.3V的系统控制电压。进一步请参见图3A，对应于图2A，5 - 500V的驱动电压作用于负载，负载的信息再经由反馈检测反馈至系统控制部分。请参见图3B，对应于图2B，驱动电压作用于负载，负载处的信息再经由反馈检测反馈至系统控制部分。
[0041]微控制器106用于控制各个模块的运作。微控制器的对各个模块的运作控制如图4所示，系统电压控制模块(5V，3.3V)提供系统电压给微控制器。微控制器控制显示器、键盘、时钟、数据存储管理。微控制器通过电压控制模块控制脉冲驱动的合适电压(5 -500V),由脉冲驱动模块作用于负载。反馈检测模块在负载上实施电阻检测，并将反馈信息回传至微控制器。
[0042]电脉冲导入组件12连接电脉冲发生器10，用于将电脉冲发生器10发出的电脉冲传输到植物的待导入部位中。
[0043]本实用新型的装置的工作原理为:通过升压电路及降压电路等技术设计产生合适的脉冲电压、波形等导入参数，通过一定能量的电脉冲冲击，达到瞬间打开细胞壁及细胞膜通道的作用，使基因等物质快速进入细胞膜内，并进而进入细胞核内，增加外源基因与细胞核内染色体的同源重组，从而提高基因转染的效率。通过设定的通路完成能量、脉宽、频率等参数的选择。通过反馈电路收集反馈信息，对发出的脉冲参数进行调整。通过记忆功能，实现基因导入记录的保存，通过信息传输模块实现本机与上位机的信息交换以及对使用者的在线指导。
[0044]本实用新型的装置的作用原理为:本实用新型特定的参数可以将外源基因通过电场作用，导入植物活体组织的细胞中。设计施加的能量值对导入产生影响。能量过低或过高都会影响外源基因的导入。能量过低时，无法造成细胞壁及细胞膜表面结构的改变，因而外源基因不能进入细胞内。能量过高时，局部组织积聚过多热量，造成细胞的死亡或组织失去功能。此时，即使外源基因导入细胞，也无法进行正常的转染。本实用新型的参数可以有效提高外源基因进入植物活体细胞，提高转染效率。
[0045]本实用新型的装置的运行顺序(即基因导入方式)如图5A - 5C所示有三种，可以如图5A所示的先将基因注射到植物的待导入部位再施加电脉冲，或者如图5B所示的先进行电脉冲再将基因注射到植物的待导入部位，或者如图5C所示的基因注射和电脉冲导入同时进行。
[0046]电脉冲导入组件12是各种形状的电极，根据待导入植物活体部位的不同选择不同的形状的电极，以使电极能与植物组织紧密接触，同时能够将电脉冲信号传输到合适的部位。待导入部位是叶片，可以选择片状电极；待导入部位是茎、根，可以选择针式电极、片状电极或片针结合电极；待导入部位是子叶节，可以选择一面平、一面凸起的电极；待导入部位是花，可以选择针式电极、片状电极或片针结合电极。
[0047]如图6A所示，针式电极由基座2a、连接器2b和电极2c组成，电极为数根导电电针，电针以平行排列等距的方式安装在基座中，电针的数目为2 — 8根，直径为0.1mm-
0.45mm,电针的尾端通过导线与连接器2b连接，连接器2b通过导线或者直接与电脉冲发生器的输出端连接。
[0048]如图6B所示，片状电极由基座3a、连接器3b和电极3c组成，电极3c为两片导电片，该导电片为平面、凸面、凹面或其它形状，分别固定在镊型基座3a的两个夹子上，电极3c通过导线与连接器3b连接，连接器3b通过导线或直接与电脉冲发生器相连。
[0049]如图6F所示，片针结合电极由基座4a、连接器4b和电极4c组成，电极4c为数个电针和一块导电片，电针的直径为0.lmm-0.45mm，数量为1-8个；导电片为平面、凸面、凹面或其它形状。电针和导电片分别固定在镊型基座4a的两个夹子上，电极4c通过导线与连接器4b连接，连接器4b通过导线或直接与电脉冲发生器相连。
[0050]图6A示出了针式电极的结构，图6B、6C、6D、6E和6F分别示出了各种片状电极及片针结合电极的结构。图7示出了电脉冲导入组件和电脉冲发生器的连接，电脉冲导入组件的连接器72和电脉冲发生器70的输出端71相连，可以通过导线连接，也可以直接连接。
[0051]上述实施例是提供给本领域普通技术人员来实现和使用本实用新型的，本领域普通技术人员可在不脱离本实用新型的发明思想的情况下，对上述实施例做出种种修改或变化，因而本实用新型的保护范围并不被上述实施例所限，而应该是符合权利要求书所提到的创新性特征的最大范围。
【权利要求】
1.一种植物活体基因导入装置，包括电脉冲发生器和电脉冲导入组件，其特征在于，电脉冲发生器进一步包括电源模块、脉冲参数选择和实施模块、脉冲发生模块、信息反馈模块、存储模块、信息传输模块以及微控制器，其中: 电源模块用于提供电脉冲发生的能量； 脉冲参数选择和实施模块根据脉冲波的反馈信息调整下一个电脉冲的参数，以保持靶部位每次收到的脉冲能量恒定； 脉冲发生模块发出两组电脉冲，第一组电脉冲将植物细胞壁击穿，第二组电脉冲改变细胞膜的结构，使细胞膜产生可逆的孔道； 信息反馈模块检测电脉冲导入部位的阻抗并反馈至脉冲参数选择和实施模块； 存储模块用于存储基因导入记录； 信息传输模块用于本机与上位机的信息交互，实现上位机对本机的指导； 微控制器用于控制各个模块的运作； 电脉冲导入组件连接电脉冲发生器，用于将电脉冲发生器发出的电脉冲传输到植物的待导入部位中。
2.根据权利要求1所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，脉冲发生模块发出的第一组电脉冲是指数波或方波，第二组电脉冲是方波，每组内的若干个脉冲波是恒能量电脉冲，每个脉冲能量为0.005J - 130J,电压为5 - 500V,每组脉冲个数为I 一 20个，频率为 I — 60Hz。
3.根据权利要求1所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，电脉冲导入组件是针式电极、片状电极、或片针结合电极。
4.根据权利要求3所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，针式电极由基座、连接器和电极组成，电极为数根导电电针，电针以平行排列等距的方式安装在基座中，电针的数目为2 — 8根，直径为0.1mm 一 0.45mm,电针的尾端通过导线与连接器连接，连接器通过导线或者直接与电脉冲发生器的输出端连接。
5.根据权利要求3所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，片状电极由基座、连接器和电极组成，电极为两片导电片，该导电片的形状包括平面、凸面、或凹面，该两片导电片分别固定在镊型基座的两个夹子上，电极通过导线与连接器连接，连接器通过导线或直接与电脉冲发生器的输出端相连。
6.根据权利要求3所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，片针结合电极由基座、连接器和电极组成，电极为数个电针和一块导电片，电针的直径为0.lmm-0.45mm，数量为1-8个；导电片的形状包括平面、凸面、或凹面，电针和导电片分别固定在镊型基座的两个夹子上，电极通过导线与连接器连接，连接器通过导线或直接与电脉冲发生器输出端相连。
7.根据权利要求5所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，电脉冲导入组件的电极由导电材料制成。
8.根据权利要求4-6中任一项所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，欲导入基因或其它预处理物质涂抹在电极上。
9.根据权利要求1一 7中任一项所述的植物活体基因导入装置，其特征在于，装置先将基因注射到植物的待导入部位再施加电脉冲，或者先进行电脉冲再将基因注射到待导入部位，或者基因注射和电脉冲导入同时进行。
【文档编号】C12M1/42GK203498390SQ201320598650
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年9月25日 优先权日:2013年9月25日
【发明者】陈车生, 陈丽晔 申请人:上海塔瑞莎生物技术有限公司