使用甲羟戊酸作为底物的3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生产方法

使用甲羟戊酸作为底物的3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生产方法
【专利摘要】本发明描述了通过生物方法生成3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。更具体而言，描述了用于从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。
【专利说明】使用甲羟戊酸作为底物的3-甲基丁-3-烯-1-醇的酶促生 产方法
[0001] 本发明涉及使用甲羟戊酸作为底物并将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的 生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法。此外，本发明涉及生产异戊二烯的方法，所述方法包 括使用甲羟戊酸作为底物并通过脱羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇的 生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法，并且还包括将生产的3-甲基丁 -3-烯-1-醇转化为 异戊二烯的步骤。
[0002] 本发明也涉及生产异戊醇的方法，所述方法包括使用甲羟戊酸作为底物并通过脱 羧作用步骤将其酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法， 并且还包括将生产的3-甲基丁 -3-烯-1-醇转化为异戊醇的步骤。
[0003] 3-甲基丁-3-烯-1-醇对应式C5H1(l0。它能够用于生产异戊烯醇，异戊烯醇用于 香料或在制药工业中作为构件使用，例如在柠檬醛、维生素 A和维生素 E的生产中。它是通 过异丁烯和甲醛的缩合，生成3-甲基丁 -3-烯-1-醇进一步被异构化为异戊烯醇化学生产 的。
[0004] 目前用于生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇的生物学路线涉及甲羟戊酸途径：生产甲羟 戊酸，然后二磷酸化，然后脱羧-脱水至焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-1-醇酯，并最后两次脱磷 酸至3-甲基丁 -3-烯-1-醇（美国专利申请20080092829)。
[0005] 3-甲基丁 -3-烯-1-醇能够被转化为异戊二烯，异戊二烯是轮胎工业的关键化合 物，并且也在粘合剂中有许多应用。它是使用若干种路线化学地生产的：
[0006] -从油中萃取蒸馏（C5馏分）
[0007] -异戊烯脱氢
[0008] -异戊烷的双脱氢
[0009] _异丁稀和甲醒反应 [0010]-丙酮和乙炔的反应
[0011] -丙烯二聚化
[0012] W0 2009/076676报道了至异戊二烯的代谢途径。途径基于甲羟戊酸途径的下游中 间体，即焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-1-醇酯或焦磷酸异戊烯醇酯的脱磷酸-脱水。此方法的 缺点是要求经历整个甲羟戊酸途径：甲羟戊酸双磷酸化，然后脱羧-脱水至焦磷酸3-甲基 丁 -3-烯-1-醇酯，再异构化为焦磷酸异戊烯醇酯，并最后双脱磷酸/脱水至异戊二烯。
[0013] 异戊醇是非常重要的化学制品，通常用作脂肪、油、树脂和生物碱的溶剂。在香料 工业中，例如在用于香皂和化妆品香料的水杨酸异戊醇酯的制造中存在对异戊醇的需求。 它也用于磷酸的制造。此外，它用于拟除虫菊酯的合成。生产异戊醇的商业方法包括杂醇 油的分馏、烷烃的氯化和随后的水解以生产异构体的混合物以及正丁烯的低压羰基合成或 加氢甲酰基化，然后氢化获得的异戊醛。
[0014] W0 2011/076261描述了使用具有脱羧酶活性的酶通过甲羟戊酸的酶促转化生产 3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。尽管在W0 2011/076261中描述的方法允许通过酶促转化 甲羟戊酸生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇，对于改善，特别是关于方法的效率方面从而使得其 适于工业目的仍然有需求。本发明解决了这方面的需求。
[0015] 因此，在第一个方面，本发明涉及从甲羟戊酸生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的 方法。特别地，本发明涉及从甲羟戊酸经过生物过程，特别是酶促过程生产3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的方法，在所述酶促过程中组合两种类型的酶以增加生产速率的效率。更 具体而言，本发明涉及生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法，其特征在于其包括通过
[0016] (i)具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶；和
[0017] (ii)与第一种酶不同并且具有将所述甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的第二种酶
[0018] 将甲羟戊酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇。
[0019] 本发明也涉及至少两种酶的用途，其中一种酶选自如上所述的（i)并且另一种酶 选自如上所述的（ii)，或生产所述酶的组合的微生物的用途，用于从甲羟戊酸生产3-甲基 丁-3-烯-1-醇。
[0020] 本发明也涉及生物，优选地微生物，其生产至少两种酶，其中一种酶选自如上所述 的（i)并且另一种酶选自如上所述的（ii)。
[0021] 术语"甲羟戊酸"包含甲羟戊酸和甲羟戊酸的阴离子，所述阴离子是生物介质中的 主要形式。甲羟戊酸是生产萜和类固醇的被称为甲羟戊酸途径的生物合成途径中的前体。 甲羟戊酸是焦磷酸3-甲基丁 -3-烯-1-醇酯的主要前体，后者反过来是所有类萜的基础。 在图1中显示甲羟戊酸的结构式。甲羟戊酸（3, 5-二羟基-5-甲基戊酸）是手性的并且以 两种对映异构体，R和S存在。在本发明中术语"甲羟戊酸"涵盖两种手性形式，尽管两种形 式之一，例如R形式，是天然地主要生产的形式，
[0022] 在本发明的背景中术语3-甲基丁-3-烯-1-醇（isoprenol)包含对应式C5H 1(l0的 化合物。isoprenol的IUPAC名称为3-甲基丁-3-烯-1-醇。3-甲基丁-3-烯-1-醇的异 名是，例如，2-甲基-1-丁烯-4-醇、3-丁烯-1-醇-3-甲基、3-异戊烯基醇、3-甲基-3-丁 烯-1-醇、异丁烯基甲醇、异丙烯基乙醇和甲代烯丙基甲醇。
[0023] 如以上所提及的，W0 2011/076261描述了使用具有脱羧酶活性的酶通过甲羟戊酸 的酶促转化生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法。已经在W0 2011/076261中描述了一般 而言，通过具有脱羧酶活性的酶，例如甲羟戊酸二磷酸（MDP)脱羧酶（E. C. 4. 1. 1. 33)的甲 羟戊酸向3-甲基丁-3-烯-1-醇的转化，通过甲羟戊酸向甲羟戊酸3-磷酸的转化，后者然 后脱磷酸/脱羧以产生3-甲基丁 -3-烯-1-醇而进行。在图2中描述了使用甲羟戊酸二 磷酸通过MDP脱羧酶进行的通用反应。在甲羟戊酸二磷酸脱羧酶与其天然底物甲羟戊酸 5_二磷酸的天然反应的情况中，反应的第一步，即磷酸化步骤，导致不稳定的中间体（3-膦 氧基-3-甲基-5-二磷酸戊酸；见图2A)。甲羟戊酸5-二磷酸的磷酸化因此协助反应的 第二步，即磷酸（脱磷酸作用）和C0 2(脱羧作用）的协调的释放以生产异戊烯基二磷酸 (Byres等人.，J. Mol. Biol. 371 (2007)，540-553)。由于反应的两步是由相同的酶催化的， 假定当使用甲羟戊酸作为底物时反应将经历相同的机理并且也将涉及不稳地的中间体，所 述中间体立即通过第二反应步骤被酶转化。这也由Dhe-Paganon等人支持（Biochemistry 1994, 33, 13355-13362)，其描述了用酵母甲羟戊酸二磷酸脱羧酶实施的关于其作用机理和 受氟化的化合物抑制的机理的实验。作者得出结论即甲羟戊酸二磷酸的C 3-羟基被ATP磷 酸化，生成p-Mev-pp，其电离，留下C3上的碳正离子，迅速地后接脱羧作用。因此，理解是由 甲羟戊酸二磷酸脱羧酶催化的反应的中间体被酶立即转化为终产物。
[0024] 然而，已经令人惊讶地发现，当使用甲羟戊酸作为底物时，反应的中间体，即甲羟 戊酸3-磷酸，并不是不稳定的而是瞬间积累（见实施例3)。特别地，已经发现中间体并不 是立即被酶转化而是被释放并因此作为将其转化为终产物的另一个酶的底物可获得。此 夕卜，已经发现不同的脱羧酶，特别是甲羟戊酸二磷酸脱羧酶以不同的效率催化上述两个步 骤，即一些脱羧酶以高于其他脱羧酶的效率催化第一步并且一些脱羧酶显示对第二步，即 脱羧作用步骤的偏好。由于此以及中间体甲羟戊酸3-磷酸并不是不稳定的而是瞬间积累 的事实，现已经发现通过组合分别对反应的第一和第二步骤显示高催化活性的酶，能够极 大地增加如W0 2011/076261中所描述的甲羟戊酸向3-甲基丁 -3-烯-1-醇转化的效率。 因此，本发明特别涉及用于在从甲羟戊酸酶促生产3-甲基丁-3-烯-1-醇中实现更高效率 的方法，即用于改善此类酶促生产的效率的方法。
[0025] 术语"具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的酶"意为能够将甲羟戊酸 磷酸化为甲羟戊酸3-磷酸的酶。磷酰基团优选地来自ATP分子。
[0026] 活性可以，例如，如随附的实施例，特别是实施例2中描述的那样测量。因此一种 可能性是用甲羟戊酸和ATP孵育各个酶并测量ADP的生产（其反映了甲羟戊酸3-磷酸的 生产）。用于测量ADP的生产的测定法是本领域技术人员已知的。这些方法之一是实施例 2中描述的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶测定法。在这种情况下，测定法测量NADH的吸收率在 340nm处降低，这与ADP量成比例。备选地，可以通过直接测量生产的甲羟戊酸3-磷酸，例 如通过质谱法来测量活性。此类测定法在实施例3中描述。在优选的实施方案中术语"具 有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的酶"意为可以将甲羟戊酸和ATP转化为甲羟 戊酸3-磷酸和ADP的酶。甚至更优选地，此类酶可以以10mM或更低的K M，例如以5mM或更 低的KM，优选地ImM或更低，和甚至更优选0. ImM或更低的KM催化将甲羟戊酸转化为甲羟戊 酸3-磷酸的反应，优选地将甲羟戊酸和ATP转化为甲羟戊酸3-磷酸和ADP的反应。在特 别优选的实施方案中，此类酶可以以至少〇. 2^1的kMt，优选地以至少0. δ?Γ1的kMt，特别优 选地以至少1. (^1的keat，更优选地至少2. Of的keat和甚至更优选地以至少5. Of的kcat 催化将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的反应，优选地将甲羟戊酸和ATP转化为甲羟戊酸 3_磷酸和ADP的反应。
[0027] 在特别优选的实施方案中，将甲羟戊酸和ATP转化为甲羟戊酸3-磷酸和ADP的能 力是在如实施例2中描述的或如实施例3中描述的测定法中测量的。
[0028] 术语"具有将所述甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的酶"意 为催化这样的反应的酶，在所述反应中有甲羟戊酸3-磷酸的脱羧作用和脱磷酸作用从而 生成3-甲基丁-3-烯-1-醇。
[0029] 此活性可以，例如，如随附的实施例，特别是实施例4或5中描述的那样测量。因 此一种可能性是实施组合的酶测定法，其中在允许通过嗜酸热原体（Th. acidophilum)甲 羟戊酸二磷酸脱羧酶的L200E突变体（SEQ ID N0:16)将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸 并且原则上允许甲羟戊酸3-磷酸脱羧作用和脱磷酸作用成为3-甲基丁-3-烯-1-醇并检 测3-甲基丁-3-烯-1-醇生产（例如通过气相色谱）的条件下，将嗜酸热原体甲羟戊酸二 磷酸脱羧酶的L200E突变体（SEQ ID N0:16)与甲羟戊酸和与各个酶孵育。在优选的实施 方案中此类测定法是在如实施例4或5中描述的测定法条件下进行的。在另外的优选的实 施方案中术语"具有将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的酶"意为 这样的酶，其能够在此类测定法中导致与通过在此类测定法中使用嗜酸热原体甲羟戊酸二 磷酸脱羧酶的L200E突变体（SEQ ID N0:16)与来自缓症链球菌（S.mitis)的甲羟戊酸脱 羧酶（SEQ ID N0:10)的组合可以获得的3-甲基丁-3-烯-1-醇生产相比至少一半高，更 优选地同样高的3-甲基丁 -3-烯-1-醇生产。
[0030] 在特别优选的实施方案中，在如实施例4或5中描述的测定法中测量生产3-甲基 丁 -3_烯-1-醇的能力。
[0031] 在一个优选的实施方案中，以上（i)和（ii)中提及的酶，是被NCBI或等同的引擎 认定为具有C0G3407结构域的酶。
[0032] 在根据本发明的方法的优选的实施方案中，具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸 3_磷酸的活性的第一种酶（i)选自由以下组成的组 ：
[0033] (A)包含如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 1中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的 活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至 少一样1? ;
[0034] (B)包含如SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:2中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的 活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至 少一样1? ;
[0035] (C)包含如SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:3中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的 活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至 少一样1? ;
[0036] (D)包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:4中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的 活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至 少一样商；和
[0037] (E)包含如SEQ ID N0:16中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:16中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸 的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:16中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性 至少一样高。
[0038] SEQ ID NO: 1 显不来自 Picrophilus torridus DSM 9790 的酶的氨基酸序列 (GenBank 登录号 AAT43941 ;Swissprot/TrEMBL 登录号 Q6KZB1)。
[0039] SEQ ID N0:2显示来自嗜酸热原体的酶（GenBank登录号CACIM26 ;Swissprot/ TrEMBL登录号Q9HIN1)的氨基酸序列。
[0040] SEQ ID N0:3显示来自火山热原体（Thermoplasma volcanium)的酶的氨基酸序列 (GenBank 登录号 BAB59465 ;Swissprot/TrEMBL 登录号 Q97BY2)。
[0041] SEQ ID N0:4 显不来自 Ferroplasma acidarmanus ferl 的酶的氨基酸序列 (GenBank 登录号 ZP_05571615)。
[0042] SEQ ID N0:16显示SEQ ID N0:2中显示的来自嗜酸热原体的酶的氨基酸序列 (GenBank 登录号 CAC12426 ;Swissprot/TrEMBL 登录号 Q9HIN1)，其中 200 位的亮氨酸（Leu) 谷氨酸（Glu)取代。
[0043] 在根据本发明的方法的另外的优选的实施方案中，具有将甲羟戊酸3-磷酸转化 为3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的第二种酶（ii)选自由以下组成的组：
[0044] (a)包含如SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:5中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0045] (b)包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:6中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0046] (c)包含如SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:7中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0047] (d)包含如SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:8中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0048] (e)包含如SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:9中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0049] (f)包含如SEQ ID N0:10中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:10中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:10中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0050] (g)包含如SEQ ID N0:11中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:11中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:11中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0051] (h)包含如SEQ ID N0:12中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:12中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:12中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0052] (i)包含如SEQ ID N0:13中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:13中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:13中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0053] (j)包含如SEQ ID N0:14中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:14中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:14中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0054] (k)包含如SEQ ID N0:15中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:15中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:15中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0055] (1)包含如SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:17中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0056] (m)包含如SEQ ID N0:18中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:18中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:18中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0057] (η)包含如SEQ ID N0:19中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:19中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:19中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0058] (〇)包含如SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:20中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；
[0059] (p)包含如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:21中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；和
[0060] (q)包含如SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:22中 所示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高。
[0061] SEQ ID N0:5显示了从格氏链球菌（Streptococcus gordonii)克隆的酶的氨基 酸序列。SEQ ID N0:6显示了来自格氏链球菌Challis菌株CH1亚株的酶的氨基酸序列 (GenBank 登录号 AAT43941 ;Swissprot/TrEMBL 登录号 A8UU9)。SEQ ID N0:7 显示了来自 婴儿链球菌婴儿亚种（Streptococcus infantarius subsp infantarius)ATCC BAA-102 的 酶的氨基酸序列（GenBank 登录号 EDT48420. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登录号 B1SCG0)。SEQ ID N0:8显不了盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum)的氨基酸序列（GenBank登录 号 EAL68476.1;Swissprot/TrEMBL 登录号 Q54YQ9)。SEQ ID N0:9 显示了来自德氏乳酸 杆菌（Lactobacillus delbrueckii)的酶的氨基酸序列（GenBank 登录号 CAI97800.1; Swissprot/TrEMBL登录号QlGAB2)。SEQIDN0:10显示了来自缓症链球菌（菌株B6)的酶 的氨基酸序列（GenBank登录号CBJ22986. 1)。SEQ ID NO: 11显示了来自解没食子酸链球菌 (Streptococcus gallolyticus)UCN34 的酶的氨基酸序列（GenBank 登录号 CBI13757. 1)。 SEQ ID N0:12显不了来自血链球菌（Streptococcus sanguinis)SK36的酶的氨基酸序列 (GenBank登录号ABN43791.DOSEQ ID N0:13显示了来自链球菌属物种M143的酶的氨基酸 序列（GenBank 登录号 EFA24040.1)。SEQ ID NO: 14 显不了来自猪链球菌（Streptococcus suis)89/1591 的酶的氨基酸序列（GenBank 登录号 EEF63672.1)。SEQ ID N0:15 显示了 来自唾液链球菌SK126 (streptococcus salivarius)的酶的氨基酸序列（GenBank登录号 EEK09252)〇
[0062] SEQ ID N0:17显不了马氏甲烧八叠球菌（Methanosarcina mazei)的氨基酸序列 (GenBank 登录号 AAM31457. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登录号 Q8PW40)。SEQ ID N0:18 显示了 Sulfolobus tokodaii 的氨基酸序列（GenBank登录号BAK54434. 1 ;Swissprot/TrEMBL登录 号 F9VNS6)。SEQ ID NO: 19 显不了肺炎链球菌（Streptococcus pneumonia)的氨基酸序列 (GenBank 登录号 EDT95457.1;Swissprot/TrEMBL 登录号 B2DRT0)。SEQ ID N0:20 显示了 Chloroflexus aggregans 的氨基酸序列（GenBank 登录号 ACL26234. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登录号B8G8V9)。SEQIDN0:21显不了氨基酸序列Natromonaspharaonis(GenBank登录 号CAI48881.1 ;Swissprot/TrEMBL登录号Q3ISK5)。SEQIDN0:22显示了氨基酸序列酿酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae) (GenBank 登录号 CAA66158. 1 ;Swissprot/TrEMBL 登录 号 P32377)。
[0063] 在根据本发明的方法的优选的实施方案中，第一种酶（i)如以上（E)中所定义并 且第二种酶（ii)如上述（a)或（b)中所定义，甚至更优选地第二种酶如上述（f)、（η)或 (q)中所定义。如实施例中所示出的，这些酶的组合特别有效率地生产根据本发明的3-甲 基丁 _3_烯-1-醇化合物。
[0064] 在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，具有将甲羟戊酸3-磷酸转化 为3-甲基丁-3-烯-1-醇的活性的第二种酶（ii)选自下表中列出的蛋白质中的任意一 种或选自包含与此类蛋白质的氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并显示将甲羟戊酸 3_磷酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与所述蛋白质的对应的活 性至少一样高。
[0065] 表 1
[0066]
【权利要求】
1. 生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇的方法，所述方法特征在于其包括通过 (i) 具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶；和 (ii) 与第一种酶不同并且具有将所述甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇 的活性的第二种酶 将甲羟戊酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇。
2. 权利要求1的方法，其中 (i) 具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶选自由以下组成的组： (A) 包含如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 1中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ; (B) 包含如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO:2中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ; (C) 包含如SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO:3中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ; (D) 包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:4中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ;和 (E) 包含如SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 16中所示 氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活 性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少 一样高。
3. 权利要求1或2的方法，其中 (ii) 具有将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的第二种酶选自由 以下组成的组： (a) 包含如SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:5中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (b) 包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:6中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (c) 包含如SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:7中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (d) 包含如SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:8中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (e) 包含如SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:9中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (f) 包含如SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 10中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (g) 包含如SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 11中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (h) 包含如SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 12中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:12中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (i) 包含如SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 13中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (j) 包含如SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 14中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (k) 包含如SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 15中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:15中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (l) 包含如SEQ ID NO: 17中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 17中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (m)包含如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 18中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (η)包含如SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 19中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (〇)包含如SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:20中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (P)包含如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:21中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；和 (q)包含如SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:22中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高。
4. 权利要求1至3中任一项的方法，所述方法特征在于转化步骤是在体外，在无细胞系 统中实施的。
5. 权利要求1至3中任一项的方法，所述方法特征在于在存在生产如权利要求1的（i) 和（ii)中定义的所述酶的微生物的条件下实施方法。
6. 权利要求4的方法，所述方法由使用生产如权利要求1的（i)和（ii)中定义的所述 酶的多细胞生物表征。
7. 组合物，包含 (a) 甲羟戊酸；和 (b) 至少两种酶，其中一种酶选自⑴并且另一种酶选自（ii)，其中⑴和（ii)如下： (i) 具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶；和 (ii) 与第一种酶不同并且具有将所述甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇 的活性的第二种酶。
8. 组合物，包含 (a) 甲羟戊酸；和 (b) 生产至少两种酶的多细胞生物或微生物，其中一种酶选自（i)并且另一种酶选自 (ii)，其中⑴和（ii)如下： (i) 具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶；和 (ii) 与第一种酶不同并且具有将所述甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇 的活性的第二种酶。
9. 至少两种酶的组合的用途，其中一种酶选自以下的（i)并且另一种酶选自以下的 (ii)，或权利要求7或8的组合物的用途或如权利要求8中定义的微生物的用途，用于从甲 羟戊酸生产3-甲基丁 -3-烯-1-醇， 其中⑴和（ii)如下： (i) 具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶；和 (ii) 与第一种酶不同并且具有将所述甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇 的活性的第二种酶。
10. 权利要求7或8的组合物或权利要求9的用途，其中 (i) 具有将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性的第一种酶选自由以下组成的组 (A) 包含如SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 1中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 1中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ; (B) 包含如SEQ ID NO:2中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO:2中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:2中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ; (C) 包含如SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO:3中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:3中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ; (D) 包含如SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:4中所示氨 基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活性 的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:4中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少一 样1? ;和 (E) 包含如SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 16中所示 氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸转化为甲羟戊酸3-磷酸的活 性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 16中所示氨基酸序列的蛋白质的对应的活性至少 一样高。
11. 权利要求7,8,或10的组合物或权利要求9或10的用途，其中 (ii) 具有将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基丁 -3-烯-1-醇的活性的第二种酶选自由 以下组成的组： (a) 包含如SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:5中所示 氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示与将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性具有SEQ ID N0:5中所示氨基酸序列的蛋白质 的对应的活性至少一样高； (b) 包含如SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:6中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:6中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (C)包含如SEQ ID N0:7中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:7中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO:7中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (d) 包含如SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:8中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:8中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (e) 包含如SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:9中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:9中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (f) 包含如SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 10中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 10中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (g) 包含如SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 11中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 11中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (h) 包含如SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 12中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 12中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (i) 包含如SEQ ID NO: 13中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 13中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:13中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (j) 包含如SEQ ID NO: 14中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 14中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:14中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (k) 包含如SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 15中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁 -3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 15中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (l) 包含如SEQ ID NO: 17中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 17中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:17中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (m)包含如SEQ ID NO: 18中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 18中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:18中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (η)包含如SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID NO: 19中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID NO: 19中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (〇)包含如SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:20中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:20中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高； (P)包含如SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:21中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:21中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高；和 (q)包含如SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白质或包含与SEQ ID N0:22中所 示氨基酸序列至少15%相同的氨基酸序列并且显示将甲羟戊酸3-磷酸转化为3-甲基 丁-3-烯-1-醇的活性的蛋白质，所述活性与具有SEQ ID N0:22中所示氨基酸序列的蛋白 质的对应的活性至少一样高。
12. 生产3-甲基丁-3-烯-1-醇的方法，所述方法包括通过使用酶将甲羟戊酸3-磷酸 酶促转化为3-甲基丁-3-烯-1-醇的步骤，所述酶可以经由脱羧作用和脱磷酸作用催化转 化。
13. 权利要求1至6中任一项的方法或权利要求12的方法，所述方法特征在于使用 ATP、dATP、ADP、AMP，非ATP的NTP或dNTP作为共底物实施方法。
14. 从甲羟戊酸生产异戊二烯的方法，所述方法包括权利要求1至6、12或13中任一项 的方法，并还包括将生产的3-甲基丁 -3-烯-1-醇转化为异戊二烯的步骤。
15. 从甲羟戊酸生产异戊醇的方法，所述方法包括权利要求1至6、12或13中任一项的 方法，并还包括将生产的3-甲基丁 -3-烯-1-醇转化为异戊醇的步骤。
【文档编号】C12P5/00GK104245945SQ201380018861
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2013年4月4日 优先权日:2012年4月5日
【发明者】M·德勒库特, M·阿尼斯莫瓦, P·马利埃 申请人:环球生物能源, 财富科学家股份有限公司