检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量pcr方法及其特异引物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了检测血液中弓形虫的双重荧光定量PCR检测方法及其特异引物，通过加入两种特异性引物，六步反应检测弓形虫，具体是：1）提取弓形虫RH株基因组模板；2）利用两种特异引物对分别进行Touch-downPCR扩增；3）制备重组质粒PUM-T-ITS-1和PUM-T-529bp；4）标准曲线的建立；5）标准曲线的绘制；6）溶解曲线的绘制。本发明借助反应程序溶解曲线Tm值的特异性和稳定性，选择弓形虫基因组高度保守的ITS-1序列和529bp重复序列两段序列为靶基因，建立检测弓形虫的双重SYBRGreenⅠreal-timePCR方法，该双重染料法荧光定量PCR与探针法相比，既可减少高昂的成本，又可减少因染料法导致非特异性扩增和检测体系不稳定等因素造成的漏检现象。
【专利说明】检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法及其特异引物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种利用荧光定量PCR技术检测病原的方法，具体涉及检测血液中弓形虫的双重荧光定量PCR检测方法及其特异引物。
【背景技术】
[0002]弓形虫是一种人畜共患的原虫，其主要在人畜孕期感染，能通过胎盘或产道引起宫内感染，导致流产、死胎或胎儿生长迟缓、先天畸形、新生儿期感染及婴、幼儿生长发育障碍。我国每年约有26，000个弓形虫病毒感染患儿出生，平均每小时就有3个，弓形虫已经严重威胁到人畜的健康，弓形虫不仅可以在水生和陆生动物中可以检测出还能够在蔬菜中检测出弓形虫，因此建立一种可靠，敏感的检测方法势在必行。
[0003]荧光定量PCR，即SYBRGree I real-timePCR，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。其具有高特异性，高灵敏性，低污染和实时监测的特点，在检测病原的方面有一种不可替代的优势。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供检测血液中弓形虫的双重荧光定量PCR检测方法及其特异引物。
[0005]为实现上述目的，本发明采用以下的技术方案:
[0006]两种检测弓形虫感染的特异引物对，
[0007]利用ITS-1序列设计第一种特异引物对，所述第一种特异引物对为:
[0008]上游:5'-ACAGCGAAGGGGCTCAAT-3'；
[0009]下游:5'-AGCAATCTGAAAGCACATCG-3'；
[0010]利用529bp序列设计第二种特异引物对，所述第二种特异引物对为:
[0011]上游:5'-AGCCACAGAAGGGACAGAAGT-3'；
[0012]下游:5'-GTCTCTTTTTCCACCCTCCAG-3'。
[0013]529bp序列和ITS-1序列为弓形虫基因组中高度保守的序列，适宜用来设计特异引物对。
[0014]采用权利要求1所述的两种特异引物对检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，所述双重荧光定量PCR方法包括以下步骤:
[0015]I)提取弓形虫RH株的基因组模板；
[0016]2)利用两种特异引物对分别进行Touch-down PCR扩增；
[0017]3)分别回收步骤2)扩增的目的片段，将其连接到PUM-T载体并转化到大肠杆菌中；在36-38°C、100-200rpm/min条件下将大肠杆菌摇培过夜，用质粒回收试剂盒提取经过夜培养的大肠杆菌菌液，即得到两种重组质粒，分别对两种重组质粒进行基因测序，得到重组质粒 PUM-T-1TS-1 和 PUM-T-529bp ；
[0018]4)标准曲线的建立，将步骤3)获得的PUM-T-1TS-1和PUM_T_529bp重组质粒作为标准品，经紫外分光光度计测定两种标准品的0D260值，经以下公式计算得到标准品的拷贝数:
[0019]质粒拷贝数=质粒浓度X阿氏常数/质粒的分子量
[0020]5)标准曲线的绘制，将获得的两种标准品分别稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的CT值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的CT值为纵坐标，以PUM-T-1TS-1和PUM-T-529bp作为标准品分别作标准曲线；
[0021]6)溶解曲线的绘制，取步骤I)提取的RH株弓形虫DNA作为模板，分别对两种特异引物对进行双重荧光定量PCR反应；对反应后产物采用ABI7500software v2.0.5进行分析。
[0022]所述步骤6)的双重荧光定量PCR反应，其反应条件为:95°C，30S ;95°C，5S ；60°C,30S ；40个循环。
[0023]所述步骤6)的双重荧光定量PCR反应，
[0024]其反应体系为:SYBR Premix Dimer Eraser (2 X) 10 μ L，荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3μ L (0.2 μ L-0.5 μ L), ROX II 0.4 μ L，补充灭菌水至反应总体系为20 μ L。
[0025]所述步骤6)溶解曲线的绘制时，双重荧光定量PCR反应条件为:95°C，15S ；60°C,Imin ;95°C，30S。
[0026]本发明所用药品均购于试剂公司。
[0027]本发明后文中出现的双重SYBRGreen I real-time PCR反应，即双重荧光定量PCR反应。
[0028]本发明设计real-time PCR的特异引物对所用软件为Primer5.0。
[0029]本发明检测血液中的弓形虫具有较高的敏感性，最低可以检测到弓形虫速殖子的DNA浓度为6fg/ μ L，并且同时检测2个核酸片段，提高检出率，避免因检测I个核酸片段时由于非特异性的出现导致检出灵敏性降低和假阴性或假阳性的出现，因此可以推广应用。
[0030]本发明借助反应程序溶解曲线Tm值的特异性和稳定性，选择弓形虫基因组高度保守的ITS-1序列和529bp重复序列两段序列为靶基因，建立检测弓形虫的双重SYBRGreenI real-time PCR方法，该双重染料法荧光定量PCR与探针法相比，既可减少高昂的成本，又可减少因染料法导致非特异性扩增和检测体系不稳定等因素造成的漏检现象。
【专利附图】
【附图说明】
[0031]图1 为本发明 SYBRGreen I real-timePCR 标准曲线；
[0032]图2为本发明SYBRGreen I real-timePCR的溶解曲线；
[0033]图3 为本发明 529bp 和 ITS-1 双重 SYBRGreen I real-timePCR 溶解曲线；
[0034]图4为本发明529bp和ITS-1双重SYBRGree I real-timePCR敏感性试验结果；
[0035]图5为本发明中529bp SYBRGree I real-timePCR敏感性试验结果；
[0036]图6为本发明中ITS-1SYBRGree I real-timePCR敏感性试验结果。【具体实施方式】
[0037] 本发明两种检测弓形虫感染的特异引物对，
[0038]利用ITS-1序列设计第一种特异引物对，所述第一种特异引物对为:
[0039]上游:5'-ACAGCGAAGGGGCTCAAT-3'；
[0040]下游:5'-AGCAATCTGAAAGCACATCG-3'；
[0041]利用529bp序列设计第二种特异引物对，所述第二种特异引物对为:
[0042]上游:5'-AGCCACAGAAGGGACAGAAGT-3'；
[0043]下游:5'-GTCTCTTTTTCCACCCTCCAG-3'。
[0044]采用权利要求1所述的两种特异引物对检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，所述双重荧光定量PCR方法包括以下步骤:
[0045]I)提取弓形虫RH株的基因组模板；
[0046]2)利用两种特异引物对分别进行Touch-down PCR扩增；
[0047]3)分别回收步骤2)扩增的目的片段，将其连接到PUM-T载体并转化到大肠杆菌中；在36-38°C、100-200rpm/min条件下将大肠杆菌摇培过夜，用质粒回收试剂盒提取经过夜培养的大肠杆菌菌液，即得到两种重组质粒，分别对两种重组质粒进行基因测序，得到重组质粒 PUM-T-1TS-1 和 PUM-T-529bp ；
[0048]4)标准曲线的建立，将步骤3)获得的PUM-T-1TS-1和PUM_T_529bp重组质粒作为标准品，经紫外分光光度计测定两种标准品的0D260值，经以下公式计算得到标准品的拷贝数:
[0049]质粒拷贝数=质粒浓度X阿氏常数/质粒的分子量
[0050]5)标准曲线的绘制，将获得的两种标准品分别稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的CT值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的CT值为纵坐标，以PUM-T-1TS-1和PUM-T-529bp作为标准品分别作标准曲线；
[0051]6)溶解曲线的绘制，取步骤I)提取的RH株弓形虫DNA作为模板，分别对两种特异引物对进行双重荧光定量PCR反应；对反应后产物采用ABI7500software v2.0.5进行分析。
[0052]所述步骤6)的双重荧光定量PCR反应，其反应条件为:95°C，30S ;95°C，5S ；60°C,30S ；40个循环。
[0053]所述步骤6)的双重荧光定量PCR反应，
[0054]其反应体系为:SYBR Premix Dimer Eraser (2 X) 10 μ L，荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3μ L (0.2 μ L-0.5 μ L), ROX II 0.4 μ L，补充灭菌水至反应总体系为20 μ L。
[0055]所述步骤6)溶解曲线的绘制时，双重荧光定量PCR反应条件为:95°C，15S ；60°C,Imin ;95°C，30S。
[0056]实施例1标准品的制备
[0057]提取弓形虫RH株的全基因组为模板,应用表1中的特异性引物进行Touch-downPCR扩增，回收目的片段连接到PUM-T载体并转化到大肠杆菌中，在37°C、150rpm/min摇培过夜后的菌液用质粒回收试剂盒提取重组质粒并送往宝生物公司进行测序，测序的预期片段大小分别为 302bp (ITS-1)和 529bp (529bp);将获得的 PUM-T-1TS-1 和 PUM_T_529bp 重组质粒作为标准品，经紫外分光光度计测定两种重组质粒(标准品)0D260值分别为0.027和
0.041 ;经以下公式:
[0058]质粒拷贝数=质粒浓度X阿氏常数/质粒的分子量，
[0059]计算得到标准品的拷贝数分别为1.23X1011copies/y L和1.73X lOllcopies/μ L，然后进行2个标准品标准曲线的绘制和溶解曲线的绘制。
[0060]如图1所示，PUM-T-1TS-1和PUM_T_529bp构建的2个标准品的相关系数(R2)均为0.998，扩增效率均为96.724%，标准曲线比较理想(图1 )，标准品扩增片段Tm值分别是79.38±0.5 °C和85.57±0.5 °C (图2)，并作为以弓形虫DNA和样品DNA进行SYBRGreen I real-timePCR溶解曲线的阳性对照Tm值。
[0061]实施例2双重SYBRGreen I real-time PCR溶解曲线的绘制
[0062]取弓形虫的DNAl μ L作为模板，通过表1中real-time PCR的特异性引物进行双重SYBRGreen I real-time PCR 反应。反应体系为:SYBR Premix Dimer Eraser (2 X) 10 μ L,荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3 μ L(0.2 μ L-0.5 μ L)，ROX II 0.4 μ L，反应总体系为20μ L。反应条件:95°C 30S ；95°C 5S、60°C 30S，40个循环，溶解曲线程序设定:95°C 15S,60°C lmin，95°C (1%)30S。采用 ABI7500software v2.0.5 进行分析。
[0063]如图2、3所示，扩增后结果显示(图3):当CT值≤40，溶解曲线有2个特异性峰值对应的ITS-l、529bp扩增片段的Tm值分别为78.85°C和85.0I °C，并且在阳性对照(标准品)Tm值范围之内(图2)。
[0064]实施例3双重SYBRGreen I real-time PCR特异性试验
[0065]以弓形虫RH株的全基因组和猪等孢球虫全基因组为模板，进行双重SYBRGreen I real-time PCR,同时设无模板的阴性对照，分析双重SYBRGreenI real-time PCR的特异性。通过表1中real-time PCR的特异性引物进行双重SYBRGreen I real-time PCR 反应。反应体系为:SYBR Premix Dimer Eraser (2 X) 10 μ L,荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3 μ L(0.2 μ L-0.5 μ L)，ROX II 0.4 μ L，反应总体系为20μ L。反应条件:95°C 30S ；95°C 5S、60°C 30S，40个循环，溶解曲线程序设定:95°C 15S,60°C lmin，95°C (1%)30S。采用 ABI7500software v2.0.5 进行分析。
[0066]试验结果表明，弓形虫RH株全基因组呈现阳性信号，猪等孢球虫全基因组为阴性信号，如图3所示，溶解曲线有2个特异性峰值对应的ITS-l、529bp扩增片段的Tm值分别为78.85°C和85.01°C并且在阳性对照(标准品)Tm值范围之内(图2)，以猪等孢球虫全基因组为模板的阴性对照没有扩增。
[0067]实施例4双重SYBRGreen I real-time PCR敏感性试验
[0068]以弓形虫RH株的全基因组为模板，虫株DNA的模板量从6ng/ μ L~0.06fg/ μ L倍比稀释后进行双重SYBRGreen I Real-time PCR，确定能够检出弓形虫的最低DNA浓度。
[0069]试验结果表明，如图4所示，溶解曲线出现3个溶解曲线峰值分别是78.88 V、85.01 1:和73.98°C，其中78.88 °C为ITS-1基因的峰值，85.01 V为529bp的峰值，而73.98°C为非特异性扩增的溶解曲线峰值(图5)。
[0070]敏感性试验表明，双重SYBRGreen I real-time PCR试验(图4)和单一SYBRGreen I real-time PCR试验(图5、6)最低能够检出的弓形虫DNA浓度均为6fg/μ L。从图5中看出，当弓形虫DNA模板浓度低于60pg/μ L时在扩增529bp时会产生Tm值为73.98°C的非特异性扩增片段，并且随着弓形虫DNA浓度降低，非特异性扩增片段峰值增高(图 4)。
[0071]实施例5双重SYBRGreen I real-time PCR重复性试验
[0072]以弓形虫RH株的全基因组为模板，按照1:10进行倍比稀释，取不同稀释梯度的DNA进行荧光定量PCR的批内，批间重复性试验，根据Tm值的不同计算Tm值批内、批间的变异系数。
[0073]如表1所示，重复性试验结果表明，双重SYBRGreen I荧光定量PCR批内试验Tm变异系数较小，范围在0.00%-0.13% ;批间试验Tm值变异系数也较小，范围在0.08%-0.17%，表明检测体系稳定。
[0074]表1为529bp和ITS-1双重SYBRGreen I荧光定量PCR批内、批间重复性试验(n=3)结果
[0075]表1
【权利要求】
1.两种检测弓形虫感染的特异引物对，其特征在于: 利用ITS-1序列设计第一种特异引物对，所述第一种特异引物对为: 上游:5' -ACAGCGAAGGGGCTCAAT-3'； 下游:5' -AGCAATCTGAAAGCACATCG-3'； 利用529bp序列设计第二种特异引物对，所述第二种特异引物对为: 上游:5, -AGCCACAGAAGGGACAGAAGT-3'； 下游:5' -GTCTCTTTTTCCACCCTCCAG-3'。
2.采用权利要求1所述的两种特异引物对检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于:所述双重荧光定量PCR方法包括以下步骤: 1)提取弓形虫RH株的基因组模板； 2)利用两种特异引物对分别进行Touch-downPCR扩增； 3)分别回收步骤2)扩增 的目的片段，将其连接到PUM-T载体并转化到大肠杆菌中；在36-38 0C、100-200rpm/min条件下将大肠杆菌摇培过夜，用质粒回收试剂盒提取经过夜培养的大肠杆菌菌液，即得到两种重组质粒，分别对两种重组质粒进行基因测序，得到重组质粒PUM-T-1TS-1 和 PUM-T-529bp ； 4)标准曲线的建立，将步骤3)获得的PUM-T-1TS-1和PUM-T-529bp重组质粒作为标准品，经紫外分光光度计测定两种标准品的OD26tl值，经以下公式计算得到标准品的拷贝数: 质粒拷贝数=质粒浓度X阿氏常数/质粒的分子量 5)标准曲线的绘制，将获得的两种标准品分别稀释成不同梯度浓度，作为模板进行荧光定量PCR反应，反应完成后，得出每个拷贝数所对应的CT值，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，测得的每个拷贝数所对应的CT值为纵坐标，以PUM-T-1TS-1和PUM-T-529bp作为标准品分别作标准曲线； 6)溶解曲线的绘制，取步骤I)提取的RH株弓形虫DNA作为模板，分别对两种特异引物对进行双重荧光定量PCR反应；对反应后产物采用ABI 7500 software v2.0.5进行分析。
3.根据权利要求2所述的检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于:所述步骤6)的双重荧光定量PCR反应，其反应条件为:95°C，30S ；95°C，5S;60°C，30S ；40个循环。
4.根据权利要求2所述的检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于:所述步骤6)的双重荧光定量PCR反应， 其反应体系为:SYBR Premix Dimer Eraser (2 X) 10 μ L，荧光定量PCR上下游引物混匀后各取0.3μ L (0.2μ L -0.5μ L), ROX II 0.4 μ L，补充灭菌水至反应总体系为20 μ L。
5.根据权利要求2所述的检测血液中弓形虫感染的双重荧光定量PCR方法，其特征在于:所述步骤6)溶解曲线的绘制时，双重荧光定量PCR反应条件为:95°C，15S ； 60°C,Imin ； 95°C，30S。
【文档编号】C12Q1/68GK103952471SQ201410087454
【公开日】2014年7月30日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】黄翠琴, 王寿昆, 赵东岳, 郑新添 申请人:龙岩学院