稻启动子的制作方法

稻启动子的制作方法
【专利摘要】本发明提供了从稻分离的若干启动子，其能在植物中驱动和/或调节有效连接的核酸的表达。已在稻中研究了本发明启动子的表达模式且一些启动子在植物特定的细胞、组织或器官中显示特异的活性，而其它的在基本上整个植物中呈现组成型表达。一些启动子显示弱表达，而其它的具有强活性。
【专利说明】稻启动子
[0001]本申请是申请日为2004年2月4日、申请号为201210062389.3、发明名称为“稻启动子”的发明专利申请的分案申请。
[0002]本发明涉及植物分子生物学领域，更具体地涉及驱动和/或调节植物中有效连接的核酸表达的核酸序列。公开了该核酸序列从稻的分离，以及其在驱动和/或调节有效连接的核酸表达中的用途。本发明因此涉及启动子、杂合启动子、遗传构建体、表达盒、转化载体、表达载体、宿主细胞和包含根据本发明的分离核酸的转基因植物。本发明还涉及用于驱动和/或调节核酸表达的方法以及用于转基因植物生产的方法。
[0003]基因表达取决于转录起始，其通过转录起始复合物介导。基因表达还取决于转录的调节，其确定多强、何时以及在何处基因得到表达。所述基因表达的调节可通过转录调控元件介导，其通常嵌入核酸序列5’-侧或表达基因的上游。上游核酸区域因为其启动转录起始复合物的结合、形成和/或活化而通常称为“启动子”，并且因此能够驱动和/或调节其3’下游核酸序列的表达。
[0004]为获得有用的植物表型的植物遗传工程通常包括异源基因的表达，其一般通过能驱动和/或调节有效连接的异源核酸表达的启动子介导。宿主植物的表型不仅取决于异源核酸的贡献，还取决于确定如何、在何处以及何时异源核酸得到表达的所选启动子特异表达模式的贡献。因此，具有合适表达模式的启动子的选择对于获得合适的表型是至关重要的。本领域技术人员将需要有效的不同启动子，以确定针对特定核酸的最优启动子。对于许多不同的宿主植物，该有效性是相当有限的而因此还是需要提供具有各种表达特点的新启动子。
[0005]SEQ ID NOl至22表 示的核酸从稻(Oryza Sativa)分离且已发现能驱动和调节有效连接的核酸的表达；其表达模式也已被表征。因此本发明提供许多尚未知的分离核酸，其可用作启动子。
[0006]据此，本发明提供能驱动和/或调节表达的分离启动子，包括:
[0007](a) SEQ ID NOl至22任一所示的分离核酸或与SEQ ID NOl至22任一互补的分离核酸；或
[0008](b)与SEQ ID NOl至22任一所示的DNA序列具有至少90%序列同一性的分离核酸；或
[0009](c)与SEQ ID NOl至22任一所示的DNA序列在严谨条件下特异性杂交的分离核酸；或
[0010](d) (a)至(C)中任一项定义的分离核酸，其通过插入序列而间隔；或
[0011](e) (a)至(d)中定义的任一核酸的片段，其能驱动和/或调节表达。
[0012]如此处使用的术语“分离的”指从其原始来源中移出。优选地，“分离的”启动子不含那些启动子来源的生物体基因组DNA中天然位于启动子侧翼的序列(如蛋白质编码序列或位于3’末端的其他序列)。更优选地，“分离的”启动子也不含那些天然侧接于其5’末端的序列。更优选地，“分离的”启动子包括启动子来源的生物体基因组DNA中与该启动子天然在一起的少于 5kb、4kb、3kb、2kb、1.5kb、1.2kb、lkb、0.8kb、0.5kb 或 0.1kb 的核昔酸序列。
[0013]本发明并不限于由SEQ ID NOl至22表示的核酸。本领域技术人员将认识到可以存在维持同样功能的核酸的变体或片段。这些变体或片段可以是人工的(例如，通过遗传工程)或甚至可以是自然界存在的。因此本发明涉及SEQ ID NOl至22任一的变体核酸及片段，其在本发明方法中是有用的。上述变体及片段包含:
[0014](a) SEQ ID NOl至22中任一所示的分离核酸或与SEQ ID NOl至22任一互补的分离核酸；或
[0015](b)与SEQ ID NOl至22任一所示的DNA序列具有至少90%序列同一性的分离核酸；或
[0016](c)与SEQ ID NOl至22任一所示的DNA序列在严谨条件下特异性杂交的分离核酸；或
[0017](d) (a)至(C)任一中定义的分离核酸，其通过插入序列而间断；或
[0018](e) (a)至(d)中定义的任一核酸的片段，其能驱动和/或调节表达。
[0019]SEQ ID NOl至22任一的合适变体包含与SEQ ID NOl至22所示任一核酸具有递增的优选至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性的同源物。 [0020]同一性的百分比可用比对程序计算。优选可使用成对的全序列对比程序，其执行Needleman-Wunsch的算法(J.Mol.B1l.48:443-453,1970)。该算法最大化匹配数目而最小化缺口数目。所述程序有例如GAP、Needle (EMBOSS程序包)、stretcher (EMBOSS程序包)或Align X (Vector NTI suite5.5)且可使用标准参数(例如缺口开放罚分15和缺口延伸罚分 6.66)。做为选择，可使用执行 Smith-Waterman (Advances in Applied Mathematics〗，482-489( 1981))算法的局部比对程序。所述程序有例如WateKEMBOSS程序包)或matcher(EMBOSS程序包)。如此处使用的“序列同一性”优选对整个SEQ ID NOl至22任一所示的启动子全长进行计算。这些启动子的长度列于表2中。
[0021]同源核酸的检索和鉴定在本领域技术人员熟知的范围内。该方法，包括用本发明提供的序列筛选序列数据库，序列例如SEQ ID NOl至22的任意一个，优选以计算机可读的形式。有用的序列数据库包括但不限于Genbank (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/web/Genbank),欧洲分子生物学实验室核酸数据库(EMBL) (http:/w.eb1.ac.uk/eb1-docs/embl-db.html)或其不同版本,或MIPS数据库(http://mips.gsf.de/)。用于序列比对和比较的不同检索算法和软件在本领域众所周知。所述软件包括，例如GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。优选使用BLAST软件，其计算序列同一性百分比且进行序列间相似性的统计分析。称为BLAST程序的程序组具有5个不同的执行程序:三个设计用于核苷酸序列查询(BLASTN、BLASTX和TBLASTX)而两个设计用于蛋白质序列查询(BLASTP和TBLASTN)(Coulson, Trends in B1technology:76-80,1994 ；Birren 等，Genome Analysis, 1:543,1997)。进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(NCBI)公开得到。
[0022]鼠耳芥(Arabidopsis thaliana)基因组和稻基因组序列可在公共数据库如Genbank中获得。其他基因组目前正在测序中。因此，由于可获得更多的其他植物基因组序列，预计可通过与SEQ ID NOl至SEQ ID N022任一进行序列比对而鉴定同源启动子。技术人员将很容易得到来自其他植物种类的同源启动子，例如来自其他农作物植物，如玉米。来自其他农作物植物的同源启动子对在农作物植物中实施本发明的方法尤其有用。[0023]具有与SEQ ID NOl至22的任一至少90%序列同一性同源物的一种实例为SEQ IDNOl至22的任一等位变体。等位变体为同一种类的两个不同个体中的同一基因中发生的变体并且通常等位变体由于微小的序列变化而不同。等位变体可包含单核苷酸多态性(SNP)以及小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于10bp。SNP和INDEL在大多数生物体的天然发生多态性品系中形成最大一组序列变体。
[0024]适合用于本发明方法中的同源物可很容易通过PCR或杂交从其来源生物体分离。其驱动和/或调节表达的能力可很容易确定，例如，通过下列实施例部分描述的方法，用同源物简单替代用于实际实施例中的序列。
[0025]本发明包含的其他SEQ ID NOl至22任一的合适变体为在严谨条件下与SEQ ID NOl至22任一的核酸特异地杂交的核酸。术语“杂交”指在杂交过程中与基本上同源的互补的核苷酸序列的退火。依赖所述杂交过程的分子生物学工具包括聚合酶链式反应(PCR ;和所有基于此的方法)、消减杂交、随机引物延伸、核酸酶SI作图、引物延伸、反转录、cDNA合成、RNA差异显示和DNA序列测定、Northern印迹法(RNA印迹法)、Southern印迹法(DNA印迹法)。杂交过程还可与固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶磁珠或任何其他树脂的互补核酸发生。依赖该过程的分子生物学工具包括poly (A+)mRNA的分离。杂交过程还可与固定至固相支持物如硝酸纤维素或尼龙膜或通过例如光刻法固定至例如硅质玻璃支持物的互补核酸发生(后者称为核酸阵列或微阵列或称为核酸芯片)。依赖上述过程的分子生物学工具包括RNA和DNA凝胶印迹分析、菌落杂交、噬斑杂交、原位杂交和微阵列杂交。为了能够进行杂交，通常通过热或化学方法使核酸分子变性，从而使双链熔解成两条单链和/或由单链核酸消除发夹或其它二级结构。杂交严谨度受到如温度、盐浓度和杂交缓冲液组成等条件的影响。在例如 Sambrook (2001)Molecular Cloning:a laboratory manual, 3rdEdit1nCold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, NewYork 中描述了常规的杂交条件，但熟练的技术人员将领会可根据 已知的或预期的同源性和/或核酸序列的长度而设计多种不同的杂交条件。高严谨度的杂交条件包括高温和/或低钠/盐浓度(盐包括钠，实例为NaCl和柠檬酸三钠)和/或在杂交缓冲液中包含甲酰胺和/或降低杂交缓冲液中如SDS (十二烷基磺酸钠去污剂)等化合物的浓度和/或由杂交缓冲液中排除如硫酸葡聚糖或聚乙二醇(促进分子拥挤)等化合物。严谨条件下的特异杂交意味着序列非常相似。严谨条件下的特异杂交优选在温度60°C随后用0.1至1XSSC、0.1XSDS和1XSSC、0.1XSDS洗涤下进行。
[0026]本发明还涉及与本发明的任意核酸特异性杂交的至少有15个核苷酸长度的核酸分子。本发明还涉及通过聚合酶链式反应特异性扩增本发明核酸的至少15个核苷酸长度的核酸分子。
[0027]本发明包含的SEQ ID NOl至22任一的另外的变体为与上述SEQID NOl至22的任一或其变体对应的核酸，其通过插入序列而间断。例如，SEQ ID NOl至22所示的任意核酸可通过插入序列而间断。“插入序列”表示任意核酸或核苷酸，其使另一序列中断。插入序列的实例包括内含子、核酸标签、T-DNA和可移动的核酸序列如转座子或那些可通过重组而移动的核酸。具体转座子的实例包括Ac (激活剂)、Ds (解离)、Spm (抑制剂-突变基因)或En0目前广泛应用内含子导入启动子。本发明的方法还可使用含有内含子的SEQ ID NOl至22任一核酸序列而实施。若插入序列是内含子，则将出现本发明核酸的可变剪切变体。如此处使用的术语“可变剪切变体”包含核酸序列变体，其中插入的内含子已被切除、替换或加入。所述剪切变体可在自然界中找到或是人工的。制备具有内含子的上述启动子或制备相应剪切变体的方法是本领域所熟知的。
[0028]适合用于本发明方法的通过插入序列间断的变体可很容易例如通过下列实施例部分所述的方法用变体简单替代用于现有实施例中的序列而确定。
[0029]上文所述的变体核酸可在自然界中得到(例如等位变体或剪切变体)。另外和/或做为选择，上文所述的SEQ ID NOl至22任一的变体可通过本领域熟知的技术包括例如突变、替代、插入、缺失或衍生而人工制得。本发明还包含上述变体，以及其在本发明方法中的用途。
[0030]核酸的“突变变体”可使用重组DNA操作技术或核苷酸合成很容易地制得。上述技术的实例包含通过M13诱变的定点诱变、T7-Gen体外诱变(USB，Cleveland, 0H)、快速变换的定点诱变(Stratagene, San Diego, CA)、PCR-介导的定点诱变或其他定点诱变方案。或者，本发明的核酸可随机突变。
[0031]“替代变体”指那些核酸序列中至少一个残基被除去且在其位置插入一不同残基的变体。核酸替代一般为单残基，但可以是取决于位于核酸序列的功能性限制的簇；插入通常为约I至约10个核酸残基的顺序，而缺失可以在约I至约20个残基的范围。
[0032]核酸的“插入变体”为其中一个或多个核酸残基被导入核酸预定位点的变体。插入可包括5’ -末端和/或3’ -末端的融合以及单个或多个核苷酸的内部-序列插入。通常，核酸序列内的插入小于5’-或3’-末端的融合，为约I至约10个残基的顺序。5’-或3’_末端融合的实例包含用于酵母双-杂交系统或酵母单-杂交系统的转录激活因子活化作用结构域或结合结构域 ，或噬菌体包被蛋白、6组氨酸标签、谷胱甘肽S-转移酶标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、标签.100表位、c-myc表位、FLAG?.-表位、lacZ、CMP (钙调蛋白-结合多肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位的编码序列。
[0033]术语核酸的“衍生物”可包括与天然核酸相比天然的和非一天然存在的核酸残基的替代，和/或缺失和/或添加。衍生物可例如包括甲基化核苷酸，或人工核苷酸。
[0034]本发明还包括启动子,其包括上文所述SEQ ID NOl至22任一所示的任意核酸或其变体的片段。如此处使用的“片段”指核酸序列的一部分。用于本发明方法的合适片段为功能性片段，其至少保持启动子的功能性部分，由此仍然能驱动和/或调节表达。启动子功能性片段的实例包含最小启动子、上游调控元件或其任意的组合。
[0035]合适的片段可在至少约20个碱基对或约50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950 或 1000 个碱基对，直至本发明的全长序
列的范围。该碱基对一般紧邻转录起始位点的上游，但做为选择，可以在启动子序列的任何地方。
[0036]用于本发明方法的合适片段可通过技术人员熟知的标准技术，或通过以下实施例部分描述的方法测试其驱动和/或调节表达的能力。
[0037]SEQ ID NOl至22的任一公开的启动子作为来自特定的稻编码序列(⑶S)上游区域约1.2kb的核酸而分离。核酸可包含启动子的一般元件，其在图1中显示。通常，启动子可包括从编码序列至上游方向:(i)前-信使RNA的5’ UTR, (ii)包括转录起始元件(INR)和更上游的TATA框的最小启动子，以及(iii)可包含决定启动子特定表达模式的调控元件。
[0038]如此处使用的术语“启动子”应用于整个上下文并且指能作用(驱动和/或调节)与其有效连接的序列表达的调控核酸序列。“启动子”包含源于典型基因组基因的转录调控序列。通常启动子包括TATA框，其能将转录起始复合物引导至适当的转录起始开始位点。然而，一些启动子不具有TATA框(无TATA框启动子)，但仍然有驱动和/或调节表达的完整功能。启动子可另外包括CCAAT框序列和另外的调控元件(即上游激活序列或顺式-元件如增强子和沉默子)。“启动子”还可包括典型原核类基因的转录调控序列，在这样情况下其可包括-35框序列和/或-10框转录调控序列。
[0039]如此处使用的“驱动表达”指启动(promote)核酸的转录。
[0040]如此处使用的“调节表达”指影响核酸转录的水平、时间或位置。本发明的启动子可因此用来增强、降低或改变核酸转录的时间和/或位置。例如，其可用来将转录限至某些细胞类型、组织或器官，或在某段时间内，或响应某些环境条件。
[0041]启动子优选植物-可表达的启动子。术语“植物-可表达的”指能在植物、植物细胞、植物组织和/或植物器官中调节表达。因此，本发明包含如上述的分离核酸，能调节有效连接的核酸在植物或植物的一种或多种特定细胞、组织或器官中的转录。
[0042]详细研究本发明启动子的表达模式，发现其中许多是组织特异性的。因此，本发明提供“组织特异性的”启动子。术语“组织特异性的”将被用于表明表达主要在特定组织、组织-类型、器官或生物体的任何其他部分中，虽然不一定是专门在所述组织、组织-类型、器官或其他部分中。因此，本发明包含如上述的分离核酸，能以组织特异性方式驱动和/或调节表达(有效连接的核酸的)。表达可在种子、胚、盾片、糊粉、胚乳、叶片、花、愈伤组织、分生组织、芽分生组织、分 化中心(discriminating centre)、芽、芽分生组织和根中得到驱动和/或调节。禾本科植物中芽分生组织位于所谓的分化中心(discriminat1n zone),从中芽和叶片发生。
[0043]组织特异性启动子是所谓的“受调控的启动子”的一种实例。这些启动子通过内源信号如某些转录因子、代谢物、植物生长素的存在或外源信号如变老、应激或营养状况而得到调控。这些调控可影响一个或多个不同水平的上述时空特异性。本发明中包含的为上文所述的核酸，其为“受调控的启动子”。受调控的启动子的实例有细胞-特异性启动子、组织特异性启动子、器官一特异性启动子、细胞周期-特异性启动子、诱导型启动子或早期的组织特异性启动子。
[0044]做为选择和/或另外，本发明的一些启动子显示组成型表达的模式。因此，本发明提供上文所述的启动子，其为组成型启动子。术语“组成型的”指没有或几乎没有时空的调节。如此处使用的术语“组成型表达”指基本在生物体的所有组织中基本上连续的表达。熟练技术人员将理解“组成型启动子”为在生物体生长发育几乎但未必所有的时期以及遍及生物体几乎但未必所有的部分中都有活性的启动子。
[0045]启动子的“表达模式”不仅受时空方面的影响，还受表达水平的影响。表达水平通过所谓的启动子的“强度”确定。基于所得到的表达水平，此处可在“弱”或“强”启动子间作出区分。通常，“弱启动子”指启动子驱动有效连接的核酸以约1/10000转录本至约1/100000转录本至约1/500000转录本的水平表达。通常，“强启动子”指启动子驱动有效连接的核酸以约1/10转录本或至约1/100或至约1/1000转录本的水平表达。
[0046]根据一具体的实施方案，本发明提供上文提及的分离启动子，其为杂合启动子。如此处使用的术语“杂合启动子”指例如通过遗传工程合成制得的嵌合启动子。本发明优选的杂合启动子包括本发明一种启动子的一部分，优选功能部分以及其他启动子的至少另一部分，优选功能部分。后面的部分，可以是任何启动子的部分，包括本发明的启动子及其他启动子的任何一个。杂合启动子的实例包括与另一启动子的最小启动子组合的本发明启动子的调控元件。杂合启动子的另一个实例为包括另外的调控元件以进一步增强其活性和/或改变其时空表达模式的启动子。
[0047]本发明还提供用于改变启动子表达模式的SEQ ID NOl至22任一的或其变体的功能性片段的用途。在所述方法中，本发明任意核酸的至少一部分与另外的启动子的至少一个片段组合。
[0048]此外，本发明提供遗传构建体，包含:
[0049](a)如上定义的分离的启动子
[0050](b)与(a)的分离启动子有效连接的异源核酸序列，和任选的
[0051](C) 3’转录终止子
[0052]如此处使用的术语“遗传构建体”指通过遗传工程制得的核酸。
[0053]如此处使用的术语“有效连接”至启动子指转录通过该启动子驱动和/或调节。本领域技术人员将理解与启动子有效连接优选指启动子位于该有效连接的核酸的上游(即在5’ -末端)。只要本发明的启动子能够驱动和/或调节该有效连接的核酸的转录，与有效连接的核酸的距离是可变的。例如，在启动子和该有效连接的核酸间，可能有克隆位点、接头、转录或翻译增强子。
[0054]该有效连接的核酸可以是任何编码或非编码的核酸。该有效连接的核酸可以是有义或反义方向的。一般在宿主细胞的遗传工程情况下，该有效连接的核酸被导入宿主细胞且用来改变宿主细胞的表型。或者，该有效连接的核酸为来自宿主细胞的内源核酸。
[0055]如此处使用的术语“异源的”指“与本发明启动子异源的”。与本发明的启动子异源的核酸当在其生物基因组环境中时并不天然存在于本发明启动子侧翼的核酸序列中。虽然该核酸可以是与本发明的启动子异源的，其可以是与植物宿主细胞同源的或天然的或异源的或外源的。该异源的有效连接的核酸可以是任何核酸(例如编码任何蛋白质)，条件是其包括或其至少与一种正常情况下不位于本发明启动子侧翼的核酸侧接。
[0056](C)中使用的术语“转录终止子”指其给出转录终止信号的转录单元末端的DNA序列。终止子为通常包含聚腺苷酸化信号的3’-非翻译DNA序列，其促进聚腺苷酸序列加至初级转录本的3’ -末端。在和/或分离自病毒、酵母、霉菌、细菌、昆虫、禽类、哺乳动物和植物中有活性的终止子是已知的且已在文献中描述过。适用于本发明遗传构建体的终止子的实例包含根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)胭脂碱合酶(NOS)基因终止子、根癌土壤杆菌章鱼碱合酶(OCS)基因终止子序列、花椰菜花叶病毒(CaMV)35S基因终止子序列、稻ADP-葡萄糖焦磷酸化酶终止子序列(t3’Bt2)、玉米的玉米蛋白基因终止子序列、rbcs-lA基因终止子和rbcs-3A基因终止子序列等等。
[0057]本发明还提供包含如上所述遗传构建体的表达盒、转化载体或植物表达载体。
[0058]此处“表达盒”指核酸表达所需的最小遗传构建体。一般的表达盒包括启动子-基因-终止子组合。表达盒可另外包括克隆位点，例如Gateway TM重组位点或限制性内切酶识别位点以方便有效连接的核酸的克隆或方便表达盒转入载体。表达盒可进一步包括5’非翻译区、3’非翻译区、筛选标记、转录增强子或翻译增强子。[0059]“转化载体”指遗传构建体，其可通过转化导入生物体且可在所述生物体中稳定维持。一些载体可在例如大肠杆菌、A.tumefaciens、酿酒酵母或粟酒裂殖糖酵母中维持，而其它的如噬粒和粘粒载体可在细菌和/或病毒中维持。转化载体可在其宿主细胞中增殖且可再次从中分离而转化至另一宿主细胞。载体序列通常包括一组限制性内切酶识别的唯一位点、多克隆位点(MCS)，其中可插入一个或多个非载体序列。载体序列可进一步包括一复制起点，其为在特定宿主细胞中维持和/或复制所必需的。复制起点的实例包含但不限于，fΙ-ori 和 colElο
[0060]“表达载体”构成转化载体的亚群，其由于包含适当的调节序列，能启动插入的非载体序列的表达。已记载适于在细菌(例如大肠杆菌)、真菌(例如啤酒酵母、粟酒裂殖糖酵母、巴斯德毕赤氏酵母)、昆虫细胞(例如杆状病毒表达载体)、动物细胞(例如COS或CHO细胞)和植物细胞中表达的表达载体。本发明的一种合适的表达载体为植物表达载体，用于植物细胞的转化、植物基因组中的稳定整合、植物细胞内的维持和植物细胞中非载体序列的表达。
[0061]一般地，本发明的植物表达载体包括上文所述的SEQ ID NOl至22任一核酸或其变体，其任意与另外的核酸有效连接。一般地，本发明的植物可表达的载体进一步包括用于稳定整合入植物基因组的T-DNA区域(例如Ti质粒的左侧边界和右侧边界区域)。
[0062]本发明的遗传构建体可进一步包括“筛选标记”。如此处使用的，术语〃筛选标记"包含任何基因，其赋予细胞表型，在其中得到表达以便于转染的或转化的细胞的鉴定和/或选择。合适的标记可选自赋予抗生素或除草剂抗性的标记。包含该遗传构建体的细胞因此将在杀死未转化细胞的抗生素或除草剂浓度下存活。筛选标记基因的实例包含赋予抗生素抗性的基因(如编码能磷酸化新霉素和卡那霉素的新霉素磷酸转移酶的nptll，或编码能磷酸化潮霉素的潮霉素磷酸转移酶的hpt)、赋予除草剂抗性的基因(例如bar，其提供Basta的抗性；提供草甘膦 抗性的aroA或gox)，或提供代谢作用特性的基因(如允许植物利用甘露糖作为单独碳源的manA)。可见的标记基因引起颜色的生成(例如β -葡糖醛酸酶，⑶S)、发光(如萤光素酶)或产生荧光(绿色荧光蛋白，GFP和其衍生物)。合适筛选标记基因进一步的实例包括氨苄青霉素抗性(Ampr)、四环素抗性基因(Ter)、细菌卡那霉素抗性基因(Kanr)、膦丝菌素抗性基因和氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因，等等。
[0063]此外,本发明包括包含本发明上文所述的分离的启动子,或遗传构建体,或表达盒，或转化载体或表达载体的宿主细胞。在本发明的具体实施方案中，宿主细胞选自细菌、藻类、真菌、酵母、植物、昆虫或动物宿主细胞。
[0064]在一个具体的实施方案中，本发明提供包含本发明的分离的启动子，或本发明上述的分离的核酸，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体的转基因植物细胞。上述植物细胞优选为双子叶植物植物细胞或单子叶植物植物细胞，更优选此处提及的任何植物的细胞。优选地，在本发明的转基因植物细胞中，本发明的启动子或遗传构建体稳定整合入该植物细胞的基因组中。
[0065]本发明还提供用于转基因植物生产的方法，包括:
[0066](a)将分离的启动子导入植物细胞，例如根据本发明的以及上文所述的SEQ ID NOl至SEQ ID N022的任意一个，或其变体或片段，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体，和[0067](b)在促进植物生长的条件下培养上述植物细胞。
[0068]优选通过转化完成“导入”上述分离的启动子，或遗传构建体，或表达盒，或转化载体或表达载体至宿主细胞中(例如植物细胞)。如此处使用的术语“转化”包含外源多核苷酸转入宿主细胞中，而不考虑用于转入的方法。尤其对于能无性繁殖的植物、组织，无论通过器官发生或胚胎发生，都适于用本发明的遗传构建体转化且可从中再生完整的植株。所选的特定组织将随对转化的特定植物品种有效的且适合其的无性繁殖系统而不同。典型的靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、雌配子体、愈伤组织、存在的分生组织(例如，顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和可诱导的分生组织(例如，子叶分生组织和下胚轴分生组织)。该多核苷酸可瞬时或稳定地导入植物细胞以及可以非整合地维持，例如以质粒的形式。或者，其可以整合入植物基因组。
[0069]植物品种的转化目前是相当常规的技术。方便地，一些转化方法中任何一个都可用来将本发明的核酸导入合适的祖细胞(ancestor cell)。转化方法包括利用脂质体、电穿孔法、增强游离DNA摄取的化学试剂、DNA直接注射入植物、基因枪轰击、利用病毒或花粉的转化以及显微投影。方法可选自用于原生质体的钙/聚乙二醇方法(Krens，F.A.等，1882，Nature296, 72-74 ；Negrutiu 1.等，Junel987, Plant Mol.B1l.8,363-373);原生质体的电穿孔(Shillito R.D.等，1985B1/Technol3,1099-1102);微注射入植物材料(CrosswayA.等，1986,Mol.Gen Genet202,179_185);DNA或RNA包被颗粒的轰击(Klein T.Μ.等，1987，Nature327,70);病毒的感染(非-整合的)等等。生产本发明转基因植物细胞的优选的转化方法为土壤杆菌介导的转化方法。
[0070]包括本发明任一启动子的转基因稻植物优选利用任何熟知的稻转化的方法通过土壤杆菌-介导的转化而产生，如以下所述的任何方法:公开的欧洲专利申请EP1198985A1, Aldemita 和 Hodges (Planta, 199,612-617,1996) ；Chan 等.(Plant Mol.B1l.22 (3) 491-506，1993) ；Hiei 等.(Plant J.6 ( 2) 271-282，1994);其公开的内容就如充分陈述一样此处引入作为参考。至于玉米的转化，优选的方法如Ishida等.(Nat.B1technol.1996Jun ；14 (6):745-50)或 Frame 等.(Plant Phys1l.2002May ;129 (I):13-22)所述，其公开的内容就如充分陈述一样此处引入作为参考。
[0071]通常在转化后，选择具有一个或多个标记的植物细胞或细胞团，其由用目的基因共转染的植物可表达的基因编码(其可受本发明任何启动子控制)，随之在促进植物生长的条件下培养被转化的材料。
[0072]得到的转化植物细胞随后可用于以本领域技术人员已知的方式再生转化植株。因此，上文所述的生产转基因植物的方法可进一步包括从上述(a)的植物细胞再生植株。
[0073]本发明进一步提供包括上文所述植物细胞的植物。该植物可生长，或甚至达到成熟包括例如果实产生、种子形成、种子成熟和结籽。
[0074]此外，可从这些种子生产子代，其子代是可育的。做为选择或另外，转化的和再生的植物也可以通过无性繁殖如克隆、嫁接产生子代。产生的转化植物可通过多种方式繁殖，如通过无性繁殖或传统的育种技术。例如，第一代(或Tl)转化的植物可自花授精以得到纯合的第二代(或T2)转化体，而T2植株进一步通过传统的育种技术繁殖。
[0075]产生的转化生物体可有多种形式。例如，其可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；无性转化体(例如，所有细胞被转化以包含表达盒)；转化和未转化组织的嫁接物(例如，在植株中，转化的根茎嫁接至未转化的接穗)。
[0076]随着DNA的转入和转化的细胞生长，可利用例如Southern分析对推定的转化植物细胞或植物进行目的基因存在、拷贝数和/或基因组结构的评估。做为选择或另外，新近导入的DNA的表达水平或表达模式可利用Northern和/或Western分析进行,两种技术均为本领域普通技术人员所熟知。
[0077]本发明显然涉及通过本发明的任何方法可获得的植物，其含有任何本发明分离的启动子或构建体。本发明显然涉及上述植物的任何植株部分和繁殖体。本发明进一步包含通过任何上述方法产生的原始转化细胞、组织、器官或整株植物的子代，唯一条件是子代表现出与通过本发明方法在亲代中产生的相同的基因型和/或表型特征。本发明还涉及植物可收获的部分，如但不限于种子、叶片、果实、花、茎干培养物、茎、根状茎、根、块茎、鳞茎和棉纤维。
[0078]如此处使用的术语“植物”包括整株植物、植物的原代和子代以及植物部分，包括种子、芽、茎、根(包括块茎)和植物细胞、组织和器官。因此术语“植物”还包含悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、配子体、孢子体、花粉和小孢子。在本发明方法中特别有用的植物包括属于绿色植物(Vi ridiplantae)总科的所有植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲料或草料豆科、观赏植物、粮食作物、树木、或灌木，选自:金合欢属(Acacia spp.)、槭属(Acer spp.)、称猴桃属(Actinidia spp.)、七叶树属(Aesculus spp.)、新西兰贝壳杉(Agathis austral is )>Albizia amara、Alsophila tricolor、须芒草属(Andropogon spp.)、落花生属(Arachis spp.)、模榔(Areca catechu)、Astelia fragrans、Astragalus cicer、Baikiaea plurijuga、样木属(Betula spp.)、芸苔属(Brassica spp.)、木揽(Bruguieragymnorrhiza)、Burkea africana、Butea frondosa、Cadaba farinosa、朱缀花属(Calliandraspp、)、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、辣椒属(Capsicum spp.)、决明属(Cassia spp.)、Centroema pubescens、木瓜属(Chaenomeles spp.)、肉桂(Cinnamomumcassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、Colophospermum mopane、绣球小冠花(Coronilliavaria)、Cotoneaster serotina、山楂属(Crataegus spp.)、香瓜属(Cucumis spp.)、柏木属(Cupressus spp.)、Cyathea dealbata、媪梓(Cydonia oblonga)、日本柳杉(Cryptomeriajaponica)、香茅属(Cymbopogon spp.)、Cynthea dealbata、媪梓(Cydonia oblonga)、Dalbergia monetaria、Davallia divaricata、山虫马虫皇属(Desmodium spp.)、Dicksoniasquarosa> Diheteropogon amp I ectens> D1clea spp、键扁丑属(Dolichos spp.)、Dorycniumrectum、Echinochloa Pyramidalis> Ehrartia spp.、眷 (Eleusine coracana)、Eragrestisspp.、剌桐属(Erythrina spp.)、按属(Eucalyptus spp.)、Euclea schimper1、Eulaliavillosa、养麦属(Fagopyrum spp.)、南美稳(Fei joa sellowiana)、草莓属(Fragariaspp.)、千斤拔属(Flemingia spp)、Freycinetia banksi1、Geranium thunbergi1、银杏(Ginkgo biloba)、Glycine javanica、Gliricidia spp、陆地棉(Gossypium hirsutum)、银禅属(Grevillea spp.)、Guibourtia coleosperma、岩黄甚属(Hedysarum spp.)、牛鞭草(Hemarthia altissima)、扭黄茅(Heteropogon contortus)、大麦(Hordeum vulgare)、红荀茅(Hyparrhenia rufa)、小连翅(Hypericum erectum)、Hyperthelia dissoluta、Indigoincamata、鸾尾属(Iris spp.)、Leptarrhena Pyrolifolia、古月枝子属(Lespediza spp.)、Lettuca spp.、银合欢(Leucaena leucocephala)、Loudetia simplex、Lotonus bainesi1、百脉根属(Lotus spp.)、Macrotyloma axillare、苹果属(Malus spp.)、木薯(Manihotesculenta)、紫苜猜(Medicago sativa)、水杉(Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、烟草属(Nicotianum spp.)、马户食草属(Onobrychis spp.)、Ornithopusspp.、稻属(Oryza spp.)、Peltophorum africanum、狼尾草属(Pennisetum spp.)、Perseagratissima、碧冬煎属(Petunia spp.)、菜豆属(Phaseolus spp.)、Phoenix canariensis、Phormium cookianum、石楠属(Photinia spp.)、Picea glauca、松属(Pinus spp.)、豌豆(Pisum sativum)、新西兰罗汉松(Podocarpus totara)、Pogonarthria flecki1、Pogonarthria squarrosa、杨属(Populus spp.)、瓜叶牧豆树(Prosopis cineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋梨(Pyrus communis)、栎属(Quercus spp.)、Rhaph1lepsis umbellata、Rhopalostylis sapida、Rhus natalensis、欧洲醋栗(Ribes grossularia) 、荼.薦子属 (Ribes spp.)、刺槐(Robinia pseudoacacia)、蔷薇属(Rosa spp.)、悬钩子属(Rubus spp.)、柳属(Salix spp.)、Schyzachyriumsanguineum、金丰公(Sciadopitys verticillata)、匕美红杉(Sequoia sempervirens)>巨杉(Sequoiadendron giganteum)、高梁(Sorghum bicolor)、菠菜属(spinacia spp.)、sporobolus fimbriatus、 Stiburus alopecuroides、 Stylosanthos humilis、葫芦茶属(Tadehagi spp)、落羽杉(Taxodium distichum)、阿拉伯黄背草(Themeda triandra)、车轴草属(Trifolium spp.)、小麦属(Triticum spp.)、异叶铁杉(Tsuga heterophylla)、越桔属(Vaccinium spp.)、野豌豆属(Vicia spp.)、葡萄(Vitis vinifera)>Watsonia pyramidata、马蹄莲(Zantedesc hia aeth1pica)、玉蜀黍(Zea mays)、觅属(amaranth)、朝鲜蓟、芦笑、茎椰菜、抱子甘蓝、甘蓝、芸苔、胡萝卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘蓝绿叶菜、亚麻、散叶甘蓝、小扁豆、含油种子油菜、秋葵、洋葱、马铃薯、稻、大豆、稻草、糖用甜菜、糖甘蔗、向日葵、番茄、南瓜和茶、树木和藻等等。按照本发明的优选特征，植物为农作物植物如大豆、向日葵、芸苔、紫花苜猜、油菜籽、棉花、番茄、马铃薯、烟草、南瓜、番木瓜、白杨、豆科、亚麻、羽扇豆属或高粱。按照本发明的另一个优选方案，植物为单子叶植物，如甘蔗，进一步优选谷类如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦或燕麦。
[0079]本发明进一步提供在植物或植物细胞中驱动和/或调节核酸表达的方法，包括:
[0080](a)将核酸有效连接至上文所述的本发明的分离核酸，如连接至SEQ ID NOl至22的任意一个或其变体或片段，和
[0081](b)将得到的遗传构建体导入植物或植物细胞中。
[0082]优选(a)的有效连接的核酸与本发明核酸是异源的。
[0083]该方法可进一步包括在促进生长、促进再生和/或促进成熟的条件下培养转化的植物或植物细胞。
[0084]此外，该有效连接的核酸的表达可以在植物特定的细胞、组织或器官中得到驱动和/或调节。因此，本发明提供如上所述的方法，其中表达是组成型表达或组织特异性表达。对于这些实施方案，参见实施例部分，其中描述本发明启动子特定表达模式且详述了组织特异性表达的不同类型。
[0085]本发明进一步包含上文定义的分离核酸驱动和/或调节有效连接的核酸表达的用途。
[0086]本领域技术人员将意识到序列SEQ ID NOl至22的提供使得很容易获得分离相关启动子的工具，其具有与任意SEQ ID NOl至22基本序列同一性。另外，序列SEQ ID N023至44 (对应于本发明启动子的CDS，参见表1)的提供使得很容易获得分离相关启动子的有效工具，其中该相关⑶S具有与任意SEQ ID N023至44基本序列同一性。因此本发明还包含分离能驱动和/或调节有效连接的核酸表达的核酸的方法，包括筛选核酸序列数据库以找到任意SEQ ID NOl至22或SEQ ID N023至44所示序列的同源物。随后这些同源物用来筛选基因组DNA文库，其文库例如从上述同源物来源的生物体制得。筛选过程可例如包括杂交。随后，分析与该同源物匹配的基因组DNA以鉴定与同源物对应的基因的转录起始位点和翻译起始位点。最后，设计针对位于上述翻译起始位点上游区域(在5’末端)的核酸扩增的特异引物。
[0087]本发明涉及调节蛋白的鉴定，其涉及本发明启动子活性的调节。所述鉴定可利用酵母单-杂交系统完成。在所述酵母单-杂交系统中，SEQ ID NOl至22的任意一个序列与GAL转录激活子有效连接且转化至酵母细胞培养物。酵母细胞培养物用编码候选调节因子的构建体文库再次转化。
[0088]现在将参照以下图例描述本发明，其中:
[0089]图1显示启动子的一般图示。调控元件为那些例如决定启动子活性的专一和/或时序调节的序列。最小启动子为必需和足以启动表达的最小序列。包括TATA框，其为正确引导核糖核酸聚合酶 II至转录起始位点所必需的。转录起始元件(INR)包括转录起始开始位点。5’非翻译区(5’UTR)指转录进入前-信使RNA以及最终进入mRNA，但不翻译为蛋白质的区域。翻译起始密码子由起始密码子ATG表示。
[0090]图2为用于在β -葡糖醛酸酶(⑶S)基因受本发明任一启动子控制下的植物中表达的载体Ρ4581的图谱。该双元载体包括Gateway重组盒,适于本发明任意启动子在大肠杆菌葡糖醛酸酶(⑶S)基因前的重组克隆。该盒包含氯霉素抗性基因(CamR)和用于非-重组质粒反向选择的ccdB自杀基因。该⑶S表达盒进一步包括双终止子序列T-zein和T-rbcS-deltaGA。该表达盒位于胭脂碱Ti质粒的左侧边界内(LB重复，LB Ti C58)和右侧边界内(RB重复，RB Ti C58)。克隆在该边界内的还有在组成型启动子和终止子序列的控制下的可选择标记和可筛选标记基因。该载体还包含细菌复制的复制起点(PBR322)和细菌可选择的细菌筛选标记(Spe/SmeR)。
[0091]下图显示用携带与报告基因GUS有效连接的本发明启动子的报告载体p4581转化的植物或植物部分的GUS染色结果。标志为“C植株”的植物是长至约5cm的转基因植物；标志为“B植株”的植物是长至约1cm的；而标志为"A植株〃的植物是长至成熟的。这些A植株用来收集来自老叶、新叶和种子的不同组织样品。
[0092]图3显示PR00110 (RCc3，SEQ ID NOl)的表达模式。在根中可见⑶S染色。
[0093]图4显示PR00005 (推定的β -淀粉酶，SEQ ID Ν02)的表达模式。在种子中可见GUS染色，更准确地是在胚或胚的盾片中。
[0094]图5显示PR00009 (推定的纤维素合成酶，SEQ ID Ν03)的表达模式。在根中可见⑶S染色。
[0095]图6显示PR00058 (蛋白酶抑制因子Rgpi9，SEQ ID N04)的表达模式。在种子中可见⑶S染色。
[0096]图7显示PR00061 ( β棒曲霉素ΕΧΡΒ9，SEQ ID Ν05)的表达模式。在A植株(A)的早期花和在B植株(B)以及C植株(C)其他早期增殖的组织中可见GUS染色。
[0097]图8显示PR00063 (推定的结构蛋白质，SEQ ID N06)的表达模式。在早期组织中可见⑶S染色，例如在“A植株”的愈伤组织(A)或老叶、新叶和种子(B)中。
[0098]图9显示PR00081 (推定的咖啡酰辅酶A3-0-甲基转移酶，SEQ IDN07)的表达模式。在早期组织，尤其是芽中可见⑶S染色。
[0099]图10显示PR00091 (醇溶谷蛋白RP5，SEQ IDN08)的表达模式。在种子(A)，尤其在胚乳，和分生组织(B)中可见⑶S染色。
[0100]图11显示PR00095 (推定的氨肽酶，SEQ ID N09)的表达模式。在种子，更具体在胚中可见⑶S染色。
[0101]图12显示PR00111 (uclacyanin3_样蛋白质，SEQ ID N010)的表达模式。在根和分生组织中可见⑶S染色。
[0102]图13显示PR00116 (26S蛋白酶体调控粒子非-ATPase亚单位11，SEQ ID NOlI)的表达模式。在整个植株(弱组成型)中微弱可见⑶S染色且在分生组织中尤其明显。
[0103]图14显示PR00117 (推定的40S核糖体蛋白，SEQ ID N012)的表达模式。在种子，更具体在胚乳中可见GUS染色。
[0104]图15显示PR00122 (叶绿素a/b_结合蛋白前体(Cab27)，SEQ ID N013)的表达模式。在芽中可见⑶S染色。
[0105]图16显示PR00123 (推定的原叶绿素酸酯还原酶，SEQ ID N014)的表达模式。在芽(地上组织)中可见⑶S染色。
[0106]图17显示PR00133 (壳多糖酶Cht_3，SEQ ID N015)的表达模式。在根茎和分生组织中可见⑶S染色。
[0107]图18显示PR00151 (WSI18，SEQ ID N016)的表达模式。在胼胝体和上部的植株部分(A)以及糊粉层和胚(B)中可见⑶S染色。
[0108]图19显示PR00169 (水通道蛋白，SEQ ID N017)的表达模式。在整个植株(组成型表达)中可见⑶S染色。
[0109]图20显示PR00170 (高迁移率组蛋白，SEQ ID N018)的表达模式。在由“B植株”(A)例解的整个植株，和各种组织如老叶、新叶和种子(B)以及愈伤组织(C)(组成型表达)中强烈可见GUS染色。
[0110]图21显示PR00171 (可逆糖基化蛋白RGPl，SEQ ID N019)的表达模式。在所有植株部分(组成型表达)可见GUS染色。
[0111]图22显示PR00173 (胞质MDH，SEQ ID N020)的表达模式。在所有植株部分且尤其在芽(地上组织)和种子中可见⑶S染色。
[0112]图23显示PR00175 (RAB21,SEQ ID N021)的表达模式。在愈伤组织(A)、分生组织和新叶中微弱可见GUS染色，而在正发育和成熟的种子(B)中，更具体在胚中强烈可见GUS染色。
[0113] 图24显示PR00177 (Cdc2_l，SEQ ID N022)的表达模式。在分生组织和叶片中微弱可见⑶S染色。
实施例[0114]本发明的启动子作为来自各种稻基因翻译起始密码子(即第一个ATG，其密码子被排除)上游跨度约1.2kb序列的DNA区域而被分离。为了测定其核酸序列和表达模式，进行以下程序:首先对基因组稻序列进行in Silico研究。然而，基于自动化预测程序以定位启动子-样核酸序列的程序是非常容易出错的，即使是对最易-鉴定的启动子调控元件的定位，如TATA框和转录起始元件(INR)。还有,表达模式的in silico测定是极其投机性的。因此，为获得有关启动子核酸序列和表达模式的明确数据，进行体内试验，包含(i)启动子核酸序列的分离；(ii)将报告基因有效连接至该启动子且将得到的遗传构建体导入宿主生物体；(i i i )在允许报告基因表达的条件下培养转化的宿主细胞，和(iV)测定宿主生物体的不同组织中报告基因的活性。这些方法将更详细地得到描述。
[0115]实施例1.启动子的鉴定和分离
[0116]稻EST的鉴定，对应的基因和其在稻基因组中的定位
[0117]对包括稻序列的序列数据库检索稻表达序列标签(EST)。随后进行“in silico”的Northern-blot以鉴定强烈表达或对特定器官特异的EST家族。该分析包括从不同植物器官分离的EST数目的标准化。选择在源cDNA文库中具有目的分布状态的EST家族用于进一步的分析和序列同源性检索。在序列同源性检索结合搜索科研数据后，对应于EST家族的基因从序列数据库中得到鉴定并且给出功能(推定的)和相应的基因名称(参见表1)。随后，相应启动子区域通过以下方法分离。在第一个步骤中，检索TIGR数据库以得到对应EST家族的假定的重叠群。利用标准计算机程序得到序列同源性，如使用标准参数(一般，开放缺口的G值=5，延伸缺口的E值=2，在运行的blast部分错配的q罚分=_3，在运行的blast部分匹配的r奖分=l,e期望值=10.0, W字符长度=11, v —行描述的数目=100,b显示序列比对的数目=100，矩阵=BL0SUM62)的Blast N。TIGR数据库(基因组研究机构)提供了假定的重叠群(TC)，其为基于构建自所有已知EST、所有已知cDNA和改造的mRNA重叠群的序列预测。用来鉴 定本发明启动子的TC在表1中表示。在第二个步骤中，TC用来将相应基因定位至基因组序列上，其基因包括编码区以及启动子区域。通常，基因组序列为BAC克隆，此处通过其Genbank登录号(参见表1)表示。从这些BAC克隆可确定启动子区域的序列同一性。
[0118]表1:本发明的稻启动子列表。启动子序列在此通过其SEQ ID NO以及启动子编号(PRO)表示。由本发明启动子天然驱动的编码序列(⑶S)通过其名称、通过SEQ ID NO以及通过TIGR数据库的假定重叠群(TC)的登录号表示。包含本发明启动子区域的基因组序列(BAC克隆或基因)通过其Genbank登录号表示。
[0119]
【权利要求】
1.能驱动和/或调节表达的分离的启动子，包含: (a)SEQ ID NOl至22中任一项或与SEQ ID NOl至22任一项互补的分离核酸；或 (b)与SEQID NOl至22任一项所示的任何DNA序列具有至少90%序列同一性的分离核酸；或 (c)与SEQID NOl至22任一项的任何DNA序列在严谨条件下特异性杂交的分离核酸；或 (d)(a)至(c)中任一项中定义的分离核酸，其通过插入序列而间断；或 (e)(a)至(d)中定义的任何核酸的片段，其片段能驱动和/或调节表达。
2.权利要求1的启动子，其为包含权利要求1中定义的启动子的至少一部分以及启动子的其它部分的杂合启动子。
3.遗传构建体，包含: Ca)权利要求1或2中定义的分离的启动子；和 (b)与(a)的所述启动子有效连接的异源核酸序列；和任选的 (C) 3’转录终止子。
4.包含权利要求3定义的遗传构建体的表达盒。
5.包含权利要求3定义的遗传构建体的转化载体。
6.包含权利要求3定义的遗传构建体的表达载体。
7.包含权利要求1或2定义的分离的启动子，或权利要求3定义的遗传构建体，或权利要求4定义的表达盒，或权利要求5定义的转化载体，或权利要求6定义的表达载体的宿主细胞。
8.权利要求7的宿主细胞，选自细菌、藻类、真菌、酵母、植物、昆虫和动物宿主细胞。
9.包含权利要求1或2定义的分离的启动子，或权利要求3定义的遗传构建体，或权利要求4定义的表达盒，或权利要求5定义的转化载体，或权利要求6定义的表达载体的转基因植物细胞。
10.权利要求9的转基因植物细胞，其为单子叶植物植物细胞。
11.权利要求10的转基因植物细胞，其为双子叶植物植物细胞。
12.包含权利要求10或11定义的转基因植物细胞的转基因植物。
13.权利要求12的转基因植物，其中所述植物选自稻、玉米、小麦、大麦、粟、燕麦、黑麦、高粱、大豆、向日葵、芸苔、甘蔗、紫花苜蓿、豆、豌豆、亚麻、羽扇豆属、油菜籽、烟草、番茄、马铃薯、南瓜、番木瓜、白杨和棉花。
14.权利要求13或14定义的植物的植物部分，优选可收获的部分，繁殖体或子代。
15.在植物或植物细胞中驱动和/或调节核酸表达的方法，包括: Ca)将所述核酸有效连接至权利要求1定义的任一分离的核酸，和 (b)将得到的遗传构建体导入植物或植物细胞。
16.权利要求15的方法，其中所述的表达是组成型的或组织特异性的。
17.用于转基因植物生产的方法，包括: (a)将权利要求1或2定义的分离的启动子，或权利要求3定义的遗传构建体，或权利要求4定义的表达盒，或权利要求5定义的转化载体，或权利要求6定义的表达载体导入植物细胞，和(b)在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞。
18.权利要求1定义的任何分离核酸驱动和/或调节有效连接的核酸表达的用途。
【文档编号】C12N5/10GK104031918SQ201410106335
【公开日】2014年9月10日 申请日期:2004年2月4日 优先权日:2003年2月4日
【发明者】Y·哈茨费尔特, W·布罗克特 申请人:作物培植股份有限公司