一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用，所述米曲霉分类命名为米曲霉（Aspergillusoryzae）米3，由中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC?NO：M2013640，保藏日期为2013年12月8日。本发明菌株以麦麸为发酵基质来发酵生产阿魏酸酯酶，并用阿魏酸酯酶断裂植物细胞壁多糖及木质素和阿魏酸之间的酯键，获得束缚型酚酸阿魏酸的方法，并且利用微生物生长周期短，不受气候限制，易于实现大规模生产，为阿魏酸等束缚型酚酸类物质提取提供了新的生物方法。
【专利说明】一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用。
【背景技术】
[0002] 小麦是世界上种植面积最为广泛的作物之一，约占粮食作物种植面积的26%，我国 小麦年产量高，小麦麸皮的年产量可达2000万吨以上，但是一直以来对于麸皮的开发利用 较少，基本上仅以作为饲料原料而加以利用。小麦麸皮中主要含有非淀粉多糖、淀粉、脂肪、 木质素、蛋白质、维生素和酚类物质等多种成分，其中以阿拉伯木聚糖为主的非淀粉多糖含 46%，是小麦细胞壁的主要成分。麸皮中还含有一定数量的酚酸类物质，如阿魏酸（ferulic acid)、P_ 香豆酸（p-coumaricacid)、咖啡酸（caffeicacid)、芥子酸（sinapicacid)和丁 香酸（syringicacid)等成分，其中以阿魏酸为主要成分，约为麸皮质量的0. 4%-0. 7%。阿魏 酸主要通过酯键与细胞壁多糖和木质素项链，一般可以使用强碱将酯键断开而释放出来。
[0003] 酚酸组要存在于麦麸皮层中，其具有较强的抗氧化活性和抗肿瘤作用，并对环境 中的有毒物质如多环芳烃和亚硝酸胺以及真菌毒素有抗诱变作用。有研究报道发现，在麦 麸膳食纤维的离体发酵试验中，结肠微生物能通过发酵作用将结合在麦麸膳食纤维上的阿 魏酸释放出来。而阿魏酸可显著降低人子宫颈癌细胞的生存能力、存活和抗氧化水平，同时 提高癌细胞保内的活性氧水平并增加癌细胞的脂质过氧化及DNA损伤作用。另有报道认 为阿魏酸可通过对血管内皮生长因子（VEGF)、血小板源生长因子（PDGF)和缺氧诱导因子 (HIF)的作用来调节血管的形成。
[0004] 目前，研究表明酚类物质主要以游离型、结合型和束缚型等几种形式存在于植物 机体内，一般来说，游离性和结合型酚类物质为可溶性酚类；束缚型则为不溶性酚类物质， 以酯键、糖苷键和醚苷键形式与其他物质(包括蛋白质、糖类、有机酸等）相结合。
[0005] 对于酚类物质的提取，一般采用有机溶剂为媒介，辅以超声、微波、亚临界等方法 进行。由于束缚型酚类物质一般与其他物质以不同的键型相连结，传统的提取方法不足以 将酯键、糖苷键或醚键断裂，因此对束缚型酚类物质的提取主要采用强酸强碱或生物方法 (酶法和发酵法)，其主要目的都是破坏细胞壁纤维成分致密的结构，以使束缚行酚类物质 释放出来。
[0006] 尽管化学方法操作简单、效率高，但是后续需要处理提取废液，不利于可持续性发 展。因此相比较而言，采用生物方法更符合绿色、环保的发展要求。对于麦麸进行发酵方面 的多集中在低聚木糖生产和产酶活性等领域，另外已有大量文献报道麦麸经发酵后等到膳 食纤维功能性质比发酵前有大幅改善，如持水性、持油性和对有害物质的结合能力等。
[0007] 阿魏酸作为麦麸中的主要酚酸，目前对其获得的方式主要为酶法，以发酵方式的 报道较少，特别需要指出的是，麦麸中的阿魏酸基本适宜束缚型的形态存在的，其游离型： 结合型：束缚型的比例为〇. 1:1:100。近年来，对酚类物质存在形式的研究逐渐成为新的研 究热点。目前已对一些游离型、酯化型、糖苷型、束缚型酚类物质的提取、测定及抗氧化活性 等方面的报道。酚类物质的存在形与其含量及抗氧化活性有重要关系，束缚型酚类物质不 仅含量远远高于游离型和结合型，且抗氧化性活性和抑制DNA损伤方面要高于其他两种类 型。
[0008] 本发明旨在利用微生物资源采用发酵工程技术将农业资源转化形成人类社会需 求的物质，解决抗氧化物质资源短缺的问题。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是：针对现有抗氧化供应的提供新的原料和方法，并 对小麦等大宗植物进行再利用，提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用，其可利用小麦 麸皮发酵生产阿魏酸，由于微生物生长周期短、不受气候限制，易于实现大规模生产，从而 解决阿魏酸不足等问题。
[0010] 本发明提供一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，来源于华南理工大学周边植物腐生较多 的土壤，经过筛选，分离纯化得到的。所述米曲霉分类命名为米曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae) 米3,由中国典型培养物保藏中心保藏，简称CCTCC，保藏编号为CCTCC NO :M2013640,其ITS 序列表如表1所示，保藏日期为2013年12月8日，保藏地址为中国武汉武汉大学，中国 典型培养物保藏中心。
[0011] 本发明所得米曲霉oiTzae)米3平板观察特征和显微镜特征如下： 米曲霉米3在察氏培养基上菌落生长速度较慢，培养7d直径50mm ; 有辐射状不规则的沟纹，质地丝绒状中央现絮状，分生孢子结构多，无渗出液，反面呈淡粉 红色至淡褐色。在麦芽汁琼脂上菌落生长速度快，培养7d长满全皿，质地丝绒状至厚絮状； 黄绿色近于黄橄榄色后变淡褐橄榄色，反面无色。在査氏酵母膏琼脂上菌落培养7d直径 70mm，具辐射状沟纹，质地丝绒状或絮状；分生孢子结构多，淡黄褐色。
[0012] 显微镜下可以观察到分生孢子头幼球形后呈辐射形，分生孢子梗发生于基质或气 生菌丝；顶囊近球形至烧瓶形，直径16?45mm，产孢子结构单层或双层，有些统一顶囊上 二种情况兼有，瓶梗8?14μπιΧ3. 5?5μπι;或椭圆形，4. 8 μ mX 4 μ m，壁近于平滑或稍粗 糖。
[0013] 所述米曲霉 dpergiBiAs orjzae)米 3 的 ITS 与米曲霉 dpergiBiAs orjzae) 同源性达99. 8%。
[0014] 一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，本发明的米曲霉来源于华南理工大学周边腐生植物 较多的土壤，采用不同的培养基进行筛选，筛选到多个菌株，逐一进行阿魏酸含量及牛津杯 透明圈测定实验，得到高产阿魏酸酯酶的米曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae)米3,包括如下步 骤：称取土壤样品l〇g放入装有9(Tl00 mL无菌的含玻璃珠的生理盐水的300mL三角瓶中 摇荡18~20min，作10倍递增系列稀释样品匀液1:10、1:100、1:1000、及1:10000，取稀释 样品匀液1:100、1:1000、及1:10000各1. 〇mL分别加入到无菌平皿；再加10?15mL PDA培 养基混合均匀，静置广2 min，于28°C ±1°C倒置培养70?72h，将PDA培养基上单个的菌 落转接到斜面PDA培养基上28°C ±1°C培养70?72h，再转入初筛培养基，于28°C ±1°C培 养58?60h，用牛津杯透明圈实验，筛选得到产阿魏酸酯酶的米曲霉 米3 ;所述土壤样品采集自华南理工大学周边腐生植物较多的土壤。
[0015] 上述方法中，将从初筛培养基上获得产阿魏酸酯酶的米曲霉接种到三角瓶种子培 养基中，于28°c ±1°C培养58~ 60h，即为米曲霉种子；再将米曲霉种子接种到发酵培养基 中培养，为产阿魏酸的米曲霉的提取物。
[0016] 初筛培养基：FeS04 · 7H20 0· Olg，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， K2HP041.0g，鹿糖30 g，琼脂20 g，蒸馈水1000m L，pH值自然；121°C灭菌20 min。灭菌后 培养基冷到60°C左右添加无菌的10%阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100mL，摇匀至均匀 的乳白色倒平板。
[0017] 种子培养基：FeS04 ·7Η20 0· Olg，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 ·7Η20 0· 5 g， K2HP041.0g，麸皮 1000 g，蒸馏水 1000m L，pH 值自然。121°C灭菌 20 min。
[0018] PDA培养基：PDA (马铃薯琼脂）40g，定容至lL，pH自然。121°C保温灭菌20min。
[0019] 发酵培养基：麦麸：水为重量比1:1，pH值自然。
[0020] -种米曲霉应用于产阿魏酸酯酶，包括如下步骤：利用天然麦麸直接接种米曲霉 (As/76?r^77A/5· oiTzae)米3,于发酵培养基中进行曲盘发酵，获得发酵提取物，利用高效液 相色谱测量发酵培养基中麦麸的阿魏酸释放量。
[0021] 上述应用中，所述发酵的条件为：用麦麸在曲盘上进行固体发酵，麦麸厚度控制 在2~3cm内，米曲霉种子接种量为0. 5% (含菌量为1?2 X 109个/g)，培养温度为25? 28°C，进行通风培养，发酵时间为48?55h; pH自然。所述麦麸为天然麦麸。所述米曲霉 种子由米曲霉接种到三角瓶种子培养基中，于28°C ±1°C培养58?72h得到。
[0022] 与现有技术相比，本发明的有益效果是： 本发明提供了一种新的米曲霉oiTzae)米3,所述菌株具有产阿魏 酸酯酶的能力，极大的补充了提取束缚型阿魏酸菌的资料库；所述米曲霉 米3已经从生物界中分离纯化出来，并且易于培养保存，繁殖迅速，生长能力强。
[0023] 本发明同时提供了所述米曲霉的发酵产阿魏酸酯酶特性试验，通过大量的试验证 明了米曲霉的阿魏酸酯酶的酶活很高，可以作为从植物中提取束缚型酚酸的生物菌。
[0024] 本发明提供了米曲霉米3在植物中束缚型阿魏酸生物法 的应用，为束缚型酚酸的释放及后续抗氧化工程，提供了新的生物方法以及强有力的技术 支持。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图1为本发明菌株初筛培养基的透明圈图及菌落图； 图2为本发明发明菌株在显微镜下400倍观察的个体形态图； 图3为HPLC测定的阿魏酸标准品色谱图； 图4为HPLC测定的阿魏酸标准品的标准曲线； 图5为米曲霉发酵色谱图。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合实施例对本发明作进一步地说明。
[0027] 以下实施例中用到的培养基配方： 初筛培养基：FeS04 · 7H20 0· 01g，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， K2HP041.0g，鹿糖30 g，琼脂20 g，蒸馈水1000m L，pH值自然；121°C灭菌20 min。灭菌后 培养基冷到60°C左右添加无菌的10%阿魏酸乙酯的二甲基甲酰胺溶液100mL，摇匀至均匀 的乳白色倒平板。
[0028] 种子培养基：FeS04 · 7H20 0· Olg，NaN03 2. 0 g，KC1 0· 5 g，MgS04 · 7H20 0· 5 g， 1(2册041.(^，麸皮 1000 8，蒸馏水 10001111^，？!1值自然。1211：保温灭菌201^11。
[0029] PDA培养基：PDA (马铃薯琼脂）40g，定容至lL，pH自然。121°C保温灭菌20min。
[0030] 发酵培养基：麦麸：水重量比为1:1，pH自然。121°C保温灭菌20min。
[0031] 实施例1 米曲菌的初筛，牛津杯透明圈筛菌实验筛选高产菌株。
[0032] 从华南理工大学周边腐生植物较多的土壤中采集土壤样品，称取样品10g放入装 有90mL无菌的含玻璃珠的生理盐水的300mL三角瓶中摇荡20 min，作10倍递增系列稀 释样品匀液 1:10、1:100、1:1〇〇〇、及 1:10000，取稀释样品匀液 1:100、1:1〇〇〇、及 1:10000 各1. OmL分别加入无菌平皿；再加 15mL PDA培养基混合均匀，静置lmin，于28°C倒置培养 72h，将培养基上单个的菌落转接到斜面PDA培养基上28°C培养72h，再转入含阿魏酸乙酯 的初筛培养基28°C培养60h，筛选产阿魏酸酯的菌株，备用； 用平皿牛津杯透明圈实验做再次筛菌，将分离获得的产阿魏酸酯的菌株采用液体发酵 方法在发酵培养基中28°C培养2天，获得发酵液，将发酵液6000r/min离心后取200uL上清 液，放到初筛培养基上牛津杯中，置于37°C培养箱中培养5-27h观察透明圈（如图1所述)， 发酵液的上清液消解底物而产生透明圈，即可说明产阿魏酸酯酶活性的高低，以此方法在 已经产阿魏酸酯酶的菌株中对比筛选透明圈，透明圈大的即为高产阿魏酸酯酶的菌株。
[0033] 实施例2 菌株的微生物学特性及鉴定 米曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae )米3在察氏培养基上菌落生长速度较慢，培养7d直径 50mm;有辐射状不规则的沟纹，质地丝绒状中央现絮状，分生孢子结构多，无渗出液，反面呈 淡粉红色至淡褐色。在麦芽汁琼脂上菌落生长速度快，培养7d长满全皿，质地丝绒状至厚 絮状；黄绿色近于黄橄榄色后变淡褐橄榄色，反面无色。在査氏酵母膏琼脂上菌落培养7d 直径70mm，具辐射状沟纹，质地丝绒状或絮状；分生孢子结构多，淡黄褐色。
[0034] 显微镜下可以观察到分生孢子头幼球形后呈辐射形，分生孢子梗发生于基质或气 生菌丝；顶囊近球形至烧瓶形，直径16?45mm，产孢子结构单层或双层，有些统一顶囊上 二种情况兼有，瓶梗8?14μπιΧ3. 5?5μπι;或椭圆形，4. 8 μ mX 4 μ m，壁近于平滑或稍粗 糙(如附图2所示)。
[0035] 所述米曲霉 dpergiBiAs orjzae)米 3 的 ITS 与米曲霉 dpergiBiAs orjzae) 同源性达99. 8%。
[0036] 实施例3 固态发酵测定束缚型阿魏酸释放量 按种子培养基配方，称10g麸皮加水10g混合入500mL三角瓶，种子培养基灭菌后接种 米曲霉米3斜面菌株，接种量为0. 5%，28°C培养3d后，得到米曲霉 种子；按发酵培养基配方，称200g麸皮加水200g混合后灭菌，置瓷盘冷却，麦麸厚度控制在 2. 5cm内，米曲霉种子接种量为0.5% (含菌量为1?2X109个/g)，培养温度为28°C，进 行通风培养，发酵时间为48h。将固态发酵麸皮，按15g加90mL水比例在40°C水浴锅中浸 提60min后，于4°C，12 000 r / min离心20 min，取上清液酶液置于冰箱中保存。
[0037] 取上清液3mL入lOmL离心管加3mL甲醇：冰醋酸（19:1)混合，10000 r / min离 心取上清液用〇. 45 μ m膜过滤如进样瓶冰箱保存，备用。样品做空白对照即麸皮培养基不 发酵的按此方法处理即得。HPLC采用Venusil XBP C18(L)(4. 6mmX250mm，5ym)，保护柱 为C18(4.6X7. 5 mm，5 μ m)条件为：10 μ L进样量，流动相为1%冰乙酸：乙腈（8:2)，波长 320nm,柱温2(TC，流速为0. 9ml ?π?ΓΓ1。取1. Omg阿魏酸标准品，经甲醇定容至lOmL,分别 配制成浓度为40、60、80、100、120、140μ g/mL的溶液，经上述色谱条件进行测定(见图3为 某浓度阿魏酸标准品色谱图)，并将阿魏酸浓度为横坐标（X)，峰面积为纵坐标（Y)，最后得 回归方程为：Y==311134x + 202717, R2=0. 9969 (见图4为阿魏酸标准品的标准曲线），再 根据样品测定的阿魏酸的Y值(见图5)，将Y值代入回归方程Y=311134x + 202717,得到X 值，即为样品阿魏酸浓度。利用液相色谱测定的束缚型阿魏酸释放量达到〇. 3-0. 5%，而有关 相关文献中束缚型阿魏酸的含量为〇. 3%-0. 7%。证明通过发酵后束缚型阿魏酸得到了极大 的释放。该菌株为高产阿魏酸酯酶及相关酶系并能通过发酵的方法从植物中得到束缚型阿 魏酸的菌株。 序列表1 SEQUENCE LISTING 〈110>华南理工大学 〈120> -株产阿魏酸酯酶的米曲霉及其应用 <130> <160> 1 <170> Patentln version 3. 5 <210> 1 <211> 584 <212> DNA 〈213> 米曲霉（Aspergillus oryzae)米 3 <400> 1 cgtagtgaac ctgcggaagg atcattaccg agtgtagggt tcctagcgag cccaacctcc 60 cacccgtgtt tactgtacct tagttgcttc ggcgggcccg ccattcatgg ccgccggggg 120 ctctcagccc cgggcccgcg cccgccggag acaccacgaa ctctgtctga tctagtgaag 180 tctgagttga ttgtatcgca atcagttaaa actttcaaca atggatctct tggttccggc 240 atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa ctagtgtgaa ttgcagaatt ccgtgaatca 300 tcgagtcttt gaacgcacat tgcgccccct ggtattccgg ggggcatgcc tgtccgagcg 360 tcattgctgc ccatcaagca cggcttgtgt gttgggtcgt cgtcccctct ccggggggga 420 cgggccccaa aggcagcggc ggcaccgcgt ccgatcctcg agcgtatggg gctttgtcac 480 ccgctctgta ggcccggccg gcgcttgccg aacgcaaatc aatctttttc caggttgacc 540
【权利要求】
1. 一株产阿魏酸酯酶的米曲霉，其特征在于，所述米曲霉分类命名为米曲霉 (Aspergi/AAs· 米3,由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO : M2013640,保藏日期为2013年12月8日，其ITS序列表如表1所示。
2. 权利要求1所述米曲霉应用于产阿魏酸酯酶中。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：利用天然麦麸直接接种米 曲霉(As/76?r^77A/5· oiTzae)米3,进行曲盘发酵，利用高效液相色谱测量阿魏酸释放量。
4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵的条件为：用麦麸在曲盘上进 行固体发酵，天然麦麸厚度控制在2~3cm内，米曲霉种子接种量为0.5%即含菌量为1? 2 X 109个/g，温度为25?28°C，进行通风培养，发酵时间为48?55h ;pH自然。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述米曲霉种子由米曲霉接种到三角瓶 种子培养基中，于28°C ±1°C培养58?60h得到。
【文档编号】C12R1/69GK104087516SQ201410301231
【公开日】2014年10月8日 申请日期:2014年6月26日 优先权日:2014年6月26日
【发明者】吴晖, 胡博涵, 赖富饶, 刘素纯, 曾岚 申请人:华南理工大学