同步检测苹果属上三种检疫性疫霉的四重pcr引物及其扩增方法
【专利摘要】本发明公开了一种同步检测苹果属植物上三种检疫性疫霉的四重PCR引物及其扩增方法与用途，涉及4套引物，即疫霉属通用引物、冬生疫霉特异引物、丁香疫霉特异引物和栗黑水疫霉特异引物，其中通用引物用于菌丝基因组DNA的质量控制，建立的四重PCR分子检测，经琼脂糖凝胶电泳观察，疫霉属菌株均应出现884bp的扩增片段，冬生疫霉还应出现232bp特异片段，丁香疫霉还应出现683bp特异片段，栗黑水疫霉还应出现314bp特异片段，四套引物可有效用于三种疫霉的菌丝基因组DNA四重PCR特异扩增。
【专利说明】同步检测苹果属上三种检疫性疫霉的四重PCR引物及其扩 增方法
【技术领域】
[0001] 本发明设计PCR技术检测寄生于苹果属水果中冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉 的四重PCR引物及其扩增方法和用途，属于苹果属冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉病菌 检测领域。
【背景技术】
[0002] 苹果属)是蔷薇科中经济价值较高的植物，包括如苹果、垂丝海棠、 山定子、湖北海棠、西府海棠等是重要的园林树种，在北温带，亚洲、欧洲以及北美洲均有分 布。苹果是世界上五大果树(柑橘、苹果、香蕉、葡萄、梨)之一，目前，苹果生产已成为许多国 家主要的农事活动，全球约有80多个国家和地区从事苹果生产，年产量超过或接近100万 吨的主产国有12个，按产量排，依次为中国（46%)、美国（9%)、土耳其（6%)、意大利（5%)、法 国（5%)、波兰（5%)、德国（3%)俄罗斯（3%)等。我国是世界上最大的苹果生产国和消费国， 苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上，在世界苹果产业中占有重要地位。
[0003] 疫霉属5/7/7)真菌是苹果属果树上一类非常重要的病害，常多种 疫霉侵染柑橘属果树，复合侵染现象十分严重，侵染后出现脚腐、根腐、冠腐(流胶现象)、果 腐和叶疫等多种病害，为害植株的根、颈、叶、花、果实，具有流行性和毁灭性，可导致植物 大量减产，甚至绝产、死亡，给柑橘生产带来很大损失。据报道，全世界为害苹果的疫霉约 9种，不同国家或不同地区，疫霉种有所不同。其中冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉侵染 苹果是我国植物检疫性病原菌，目前在我国尚未发生。冬生疫霉是在澳大利亚西部的柑橘 果实上首次发现的，随后在美国、法国等多个国家和地区均有报道。该病菌主要为害柑橘 属（CYtras L.)植物，引起果实褐腐。还可以侵染苹果應)、玫瑰0?Ο5·<3 r收?μ)等，造成枯萎、根腐或溃疡。丁香疫霉2007年被列入我国进境植物检疫性有害生物 名单，2011年国内首次截获。丁香疫霉可引起寄主的根、茎、叶、果实的多种病害，可引起苹 果的果腐病（fruit rot)和颈腐病（collar rot)，丁香疫霉仅在欧洲西北部为苹果的主要病 原，引起裙腐，但造成严重损失的是引起贮藏期果实腐烂。受感染的植株长势衰弱，出现茎 枯，叶片褪绿萎蔫，严重时整株死亡，果实产量减少和品质下降。栗黑水疫霉寄主范围广泛， 主要引起栗树黑水病，侵染树干基部和较大的根，引起树干和根腐烂，还在许多果树上引起 根、茎腐烂病。
[0004] 苹果是世界上最重要的水果之一，在国际农产品贸易中占有非常重要的地位，随 着苹果的大量进口，有害生物随之传入我国风险很大。因此，急需加强进境苹果上携带有 害生物快速、准确的检测鉴定，有效保护和促进我国苹果产业健康发展。冬生疫霉、丁香疫 霉和栗黑水疫霉的常规生物学检测方法是形态学鉴定，通过分离培养观察真菌病害菌落、 分生孢子器、分生孢子等的形状、颜色进行鉴定。由于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉病 菌形态鉴定费力耗时，且较难准确、快速、有效鉴定三种病原菌，易造成漏检和误检，不能满 足口岸"快验快放"的要求，导致病菌在我国传播。目前常规检疫方法是根据病原菌形态特 征、生物学特性等方面存在的差异进行水果带菌检测。迄今，针对丁香疫霉与近似种检测鉴 定的研究不多，目前可行的方法仍是依据形态学来区分丁香疫霉及其近似种，而疫霉的分 离纯化比较困难，有性态和无性态形态特征的测定需要20d以上的时间，且疫霉的形态特 征变化较大，此种情况下不仅耗时费力，且很难根据菌落形态准确、快速、有效地鉴定出两 种病原菌，从而造成检疫人员的漏检和误检，且不能满足口岸"快验快放"的要求，从而错过 病害最佳防治时期，导致病害在田间肆虐发展。因此，加强对口岸进境柑橘携带有害生物快 速、准确的检测显得极为重要，对保护和促进我国柑橘产业健康发展具有十分重要的现实 意义。
【发明内容】
[0005] 本发明索要解决的技术问题是：设计同步检测苹果属水果上冬生疫霉、丁香疫霉 和栗黑水疫霉的四重PCR引物，包括冬生疫霉的特异性引物、丁香疫霉的特异性引物和栗 黑水疫霉的特异性引物，与自行设计的通用引物18SF/18SR，建立同步检测柑橘属上冬生疫 霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方法和用途。
[0006] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种同步检测冬生疫霉、丁香 疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物，实现三种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物， 序列如下： 冬生疫霉的特异引物： PHSF ：CTT TGC TCG AAA AGC ΑΤΑ ATG GAA PHSR ：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT 丁香疫霉的特异引物： PSSF ：AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC PSSR ：GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG 栗黑水疫霉的特异引物： PCSF ：CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG PCSR ：CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC 所述PHSF/PHSR扩增片段为232bp，PSSF/PSSR扩增片段为683bp，PCSF/PCSR扩增片段 为314bp，特异引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌丝基因组DNA特异四重PCR 扩增。还包括检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的通用引物，序列如下： 18SUF ：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 所述引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为 884bp，作为提取和扩增过程的质量检测。
[0007] -种同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物的扩增方法，包 括下述的扩增体系和扩增程序： (1)扩增体系 建立20yL的扩增体系为，包括lOXBuffer 2. OyL (其中含终浓度为1.5mmol/L的 MgC12) ;2· 5mmol/L dNTPs 为 2· Ομ L ;0· 4μ LTaq DNA 聚合酶（5U/y L);浓度为 ΙΟμπιοΙ/ L 的引物 18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR 和 PHSF/PHSR 依次为 0· 2 μ L/0. 2 μ L、 0·6μ?70·6μ?、0·8μ?ν0·8μ?、1·0μ?7?·0μ? ;DNA模板 lyL (约为 20ng)，余量为双蒸 水； (2)反应程序 设立反应程序：94°C预变性4min ;94°C变性30s，63°C复性20s，72°C延伸40s，40个循 环；72°C 延伸 7min。
[0008] 上述同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物在检测冬生疫 霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉方面的应用。
[0009] 发明的有益效果是：建立了方法简便、重现性好的A AiAeraa/is、A sjriflgae 和 caffiWrara 的四重 PCR 引物，能将 sjTiflgae 和 caffiWrara 区 别开来。采用引物检测试验过程，避免假阴性。实现了在同一 PCR管中4组引物检测A Ai办eraa/is、/*. sjriflgae和rara,该四重PCR检测体系的建立简化和方便了对 sjriflgae和A dAirara的检测，节约了试剂盒时间，检测快速、可靠，可 有效在口岸检测中推广应用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1是本发明菌丝基因组DNA三四重PCR扩增。
【具体实施方式】
[0011] 本发明的同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉A Ai知raa/is和丁香疫霉A 和栗黑水疫霉ca?Airara的四重PCR引物，实现了同时检测AiAeraa/is、/*. syringae 和Ρ· cambivora。
[0012] (1)设计冬生疫霉和丁香疫霉的各自的特异性引物，引物序列如下： 冬生疫霉的特异引物： PHSF ：CTT TGC TCG AAA AGC ΑΤΑ ATG GAA PHSR ：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT 丁香疫霉的特异引物： PSSF ：AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC PSSR ：GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG 栗黑水疫霉的特异引物： PCSF ：CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG PCSR ：CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC PHSF/PHSR扩增片段为232bp，PSSF/PSSR扩增片段为683bp，PCSF/PCSR扩增片段为 314bp，这三套特异引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌丝基因组DNA特异四重 PCR扩增。
[0013] (2)自行设计的冬生疫霉和丁香疫霉的通用引物，序列如下： 18SUF ：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 上述引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为 884bp，作为提取和扩增过程的质量检测。
[0014] 本发明建立检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方 法，包括扩增体系的建立及反应程序的设立。
[0015] (1)扩增体系 建立20yL的扩增体系为，包括lOXBuffer 2. OyL (其中含终浓度为1.5mmol/L的 1%(：12);2.5臟〇1/1(1阶138为2.(^1^;0.4 4 1^&9〇嫩聚合酶（5"4 1^);浓度为1(^111〇1/ L 的引物 18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR 和 PHSF/PHSR 依次为 0· 2 μ L/0. 2 μ L、 0·6μ?70·6μ?、0·8μ?ν0·8μ?、1·0μ?7?·0μ? ;DNA模板 lyL (约为 20ng)，余量为双蒸 水； (2)反应程序 经过优化，设立反应程序：94 °C预变性4min ;94 °C变性30s，63 °C复性20s，72 °C延伸 40s，40 个循环；72°C延伸 7min。
[0016] 本发明设计合成了四套引物，包括 sjTiflgae和 的特异引物PHSF/PHSR、PSSF/PSSR和PCSF/PCSR，通用引物18SUF/18SUR，对所有实验材 料菌丝DNA进行质量检测，避免假阴性，四套引物对A AiAeraa/is、A sjriflgae和A rara进行四重PCR扩增。
[0017] 所述同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物在检测冬生疫 霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉方面的应用。
[0018] 本发明建立了简便快速、特异性强、灵敏度高、准确可靠的A sjriflgae和办irara的四重PCR分子检测方法，能将Ai办eraa/is、/*. sjriflgae和 A 区别开来。该方法的建立为三种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异 可行的方法，节约了试剂和时间，检测快速、可靠，整个过程在一个工作日内完成，可有效在 口岸检测中推广应用。
[0019] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明： 实施例1 :实验材料菌丝的培养 本实验供试菌株为A AiAeraayis、/*. sjriflgae和dAirara同属菌株，共计11个菌 株(见表1 )。实验涉及的材料包括5株ATCC菌株购买于美国菌种保藏中心，2株CBS菌株购 买于荷兰菌种保藏中心，2株ACCC菌株购买于中国农业微生物菌种保藏中心，Ljf2012-4、 Ljf2012-9供试菌株为天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心从美国、澳大利亚柑 橘上截获，供试材料的相关信息见表1. 表1供试材料
【权利要求】
1. 一种同步检测检疫性真菌病害冬生疫霉A AiAeraayis、丁香疫霉A sjriflgae和栗 黑水疫霉AdhVora的四重PCR引物，引物序列如下： 三种疫霉的通用引物： 18SUF ：CGC GGT AAT TCC AGC TCC AAT A 18SUR ：AGA ACA TCT AAG GGC ATC ACA GAC C 冬生疫霉的特异引物： PHSF ：CTT TGC TCG AAA AGC ATA ATG GAA PHSR ：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT 丁香疫霉的特异引物： PSSF ：AGG AGG AAG GCG AGA AGG CC PSSR ：GTA GTA GAT GCC GGG CTG CG 栗黑水疫霉的特异引物： PCSF ：CAA GCT CCA GAT TGT GCG TG PCSR ：CGA ATC AAA GCG GTC CAA CC 所述引物用于冬生疫霉和丁香疫霉菌丝基因组DNA扩增，扩增片段为884bp，作为提取 和扩增过程的质量控制，PHSF/PHSR扩增片段为232bp，PSSF/PSSR扩增片段为683bp，PCSF/ PCSR扩增片段为314bp，这四套特异引物用于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的菌丝基 因组DNA特异四重PCR扩增。
2. -种权利要求1所述的同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物 及其扩增方法，其特征在于，包括下述的扩增体系和扩增程序： (1) 扩增体系 建立20yL的扩增体系为，包括lOXBuffer 2. OyL (其中含终浓度为1.5mmol/L的 1%(：12);2.5臟〇1/1(1阶138为2.(^1^;0.4 4 1^&9〇嫩聚合酶（5"4 1^);浓度为1(^111〇1/ L 的引物 18SUF/18SUR、PCSF/PCSR、PSSF/PSSR 和 PHSF/PHSR 依次为 0· 2 μ L/0. 2 μ L、 0·6μ?70·6μ?、0·8μ?ν0·8μ?、1·0μ?7?·0μ? ;DNA模板 lyL (约为 20ng)，余量为双蒸 水； (2) 反应程序 设立反应程序：94°C预变性4min ;94°C变性30s，63°C复性20s，72°C延伸40s，40个循 环；72°C 延伸 7min。
3. 如权利要求1所述同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物在检 测冬生疫霉、丁香疫霉、栗黑水疫霉方面的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104046698SQ201410321851
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月8日 优先权日:2014年7月8日
【发明者】刘跃庭, 崔铁军, 郭京泽, 廖芳, 朱林慧, 罗加凤, 李关荣, 黄国明 申请人:天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心