一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白ifit的表达载体及其制备和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体及其制备和应用。干扰素调控蛋白表达载体，以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物F1和R1进行PCR扩增，PCR产物与载体pEASY-E2连接，获得质粒pEASY-IIP；用限制性内切酶EcoRV酶切pEASY-IIP后回收1.3kb片段，与质粒pCN3连接，得质粒pCNIIP。本发明的干扰素调控蛋白能显著增强鱼类抗细胞肿大病毒的能力。
【专利说明】一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体及其制备和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学领域，具体的说是一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体及其制备和应用。
【背景技术】
[0002]IFIT (Interferon-1nduced protein with tetratricopeptide repeat)蛋白家方矣是受干扰素诱导表达的一类蛋白，也称ISG56家族。所有IFIT蛋白都包含有多个TPR结构域(Tetratricopeptide Repeat Motif),其功能与蛋白质相互作用有关。IFIT蛋白家族的主要功能为抵抗病毒对宿主的侵染。机体在被病毒感染后，大量表达干扰素，随后IFIT蛋白在干扰素的诱导下表达，抑制病毒复制。IFIT蛋白抗病毒的机制主要有两方面，一是区分来自宿主和病毒的mRNA，识别缺少甲基化的病毒mRNA并与之结合阻止病毒蛋白的翻译；二是与真核转录起始因子eIF3相互作用，抑制病毒基因的转录和蛋白的表达。因此IFIT家族蛋白是免疫系统中的一种重要的组成部分，在宿主抵抗病毒侵染中起到重要的作用。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体及其制备和应用。
[0004]为实现上述目的，本发明采用的技术方案为:
[0005]一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体，
[0006]以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增IFIT基因；PCR扩增产物用T4DNA连接酶与载体PEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选获得的质粒；将获得质粒与质粒PCN3用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接并转化入大肠杆菌DH5 α，筛选获得的质粒pCNIIP，即为半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒；
[0007]所述Fl 为 5’ -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3’ ；R1 为 5’ -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3’。
[0008]一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体的制备方法，以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增IFIT基因；PCR扩增产物用T4DNA连接酶与载体PEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5a，筛选获得的质粒；将获得质粒与质粒pCN3用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接并转化入大肠杆菌DH5 a，筛选获得的质粒pCNIIP，即为半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒；
[0009]所述Fl 为 5’ -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3’ ；R1 为 5’ -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3’。
[0010]一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体的应用，其特征在于:所述半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒用于防控细胞肿大病毒感染。
[0011]所述半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒用于制备抗细胞肿大病毒的药物。
[0012]本发明具有如下优点:本发明的干扰素调控蛋白表达载体注射鱼类后能够显著提高鱼类抗病毒感染能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0013]图1为本发明的干扰素调控蛋白表达质粒pCNIIP在抗病毒侵染中的应用。
【具体实施方式】
[0014]下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。
[0015]在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法:
[0016]1.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。
[0017]2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell:Molecular Cloning: ALaboratory Mannual.Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)。
[0018]3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。
[0019]实施例1
[0020]干扰素调控蛋白表达质粒pCNIIP的构建:
[0021]以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增IFIT基因；PCR条件为:940C 60s预变性模板DNA，然后94°C 40s, 58C 60s，30个循环后再在72°C延伸反应7 —1min0 PCR产物用天根的相应试剂盒纯化。PCR产物用T4DNA连接酶与载体pEASY_E2 (购于TransGen B1tech,北京)在室温连接2 — 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含氨苄青霉素(100ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，即为质粒pEASY-1IP。用限制性内切酶EcoRV酶切pEASY-1IP后回收1.3kb片段；将质粒pCN3(构建过程参见 Jiao XD, Zhang M, Hu YH, Sun L.Construct1n and evaluat1n of DNA vaccinesencoding Edwardsiella tarda antigens.Vaccine2009 ；27:5195 - 202.)用 EcoRV 酶切，回收5.4kb片段。将上述两片段用T4DNA在室温连接2 — 4小时，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，在含卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子提取质粒，命名为pCNIIP。通过DNA测序分析pCNIIP含有SEQ ID N0.1中琐事的干扰素调控蛋白序列。
[0022]所述LB组成成分按重量百分比计:1.0%蛋白胨，0.5%酵母粉，1.0%氯化钠，97.5%蒸馏水。
[0023]所述Fl 为 5’ -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3’ ；R1 为 5’ -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3’。
[0024]序列表SEQ ID N0.1中的氨基酸序列为:
[0025]MSAAETKTLKAKLEDLQCHFTWNLDATASKLLRISEHLIDIGSDEGNTWLGQIYNLLGYIHFKLGNNDEAGEFFTKSEEALLKTKQGDQGPWMAVNYANQAWLRHHQGEEEEAQVYLSKIDALMKEYPTPSQDELHPEIYGEKAWTLLKFGKTQKVLALDLFKKAIEIKPDVVEWQSSYFIGFTNTHKHSREGLPAAKMEEIREAMEQDPENLYLAAVYLKARAERGEHVEEEARELATKILGNPVSCYSGLKVILRVYRTYDLIDEAIALAEEALENHAEERYLKRCAALCYQWKLKFSRNGRPTQRMIERAMALHKDVIVLYPHSSFVKKMDLATVYAKTCDVRRAEEIYKDLLRGDLEPEDRQVLYNSYAKFLNFERNDRDRSVDYHMMAAEIHHESFFRQNSISALEKIRDRGRNRRGREIAEFLENLEQEG
[0026](a)序列特征:
[0027]?长度:436
[0028]?类型:氨基酸序列
[0029]籲链型:单链
[0030]?拓扑结构:线性
[0031](b)分子类型:蛋白质
[0032](C)假设:否
[0033](d)反义:否
[0034](e)最初来源:半滑舌鳎
[0035]结构特点:该蛋白预期含有两个pentatricopeptide repeats (PPR)功能域(氨基酸 53 — 79 和 335-360)。
[0036]实施例2
[0037]干扰素调控蛋白表达质粒pCNIIP的应用
[0038]步骤I)质粒注射
[0039]将上述实施例1的pCNIIP在PBS中稀释至200ug/ml，即为pCNIIP稀释液。将20条半滑舌鳎(重约14.3g)随机分为2组，每组10条。将这2组分别命名为A和B。将A组的每条鱼肌肉注射0.1ml pCNIIP稀释液，将B组(对照组)的每条鱼肌肉注射0.1ml PBS。
[0040]所述PBS组成成分按重量百分比计:0.8 % NaCl, 0.02 % KCl, 0.358 %Na2HPO4.12H20, 0.024% NaH2PO4,余量为水。
[0041]步骤2)病毒悬液制备
[0042]将细胞肿大病毒RBIV-Cl (具体制备方法见Zhang M, Xiao Z, Hu Y, SunL.Characterizat1n of a megalocytivirus from cultured rock bream, Oplegnathusfasciatus (Temminck & Schlege), in China.Aquae Res.2012 ;43:556 - 64)于 PBS 中稀释至lxl06copies/ml,即为病毒悬液。
[0043]步骤3)攻毒感染
[0044]在上述步骤I)注射后第3天，将A和B组的每条鱼腹腔注射10ul上述步骤2)的病毒悬液。在感染后第7天，取鱼肾脏和脾脏组织，提取DNA，用绝对定量PCR法检测组织中病毒含量(具体方法见上述参考文献)。结果表明A组鱼肾脏的病毒数(3.52xl04)显著(P<0.01)低于B组鱼肾脏的病毒数(1.05x10s) ;A组鱼脾脏的病毒数(3.55xl04)显著(Ρ〈0.01)低于B组鱼脾脏的病毒数(1.02χ106);(图1)。
[0045]这些结果表明，pCNIIP能够显著增强鱼类抵抗细胞肿大病毒的侵染。
【权利要求】
1.一种半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体，其特征在于: 以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增IFIT基因；PCR扩增产物用T4DNA连接酶与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选获得的质粒；将获得质粒与质粒PCN3用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接并转化入大肠杆菌DH5 α，筛选获得的质粒pCNIIP，即为半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒；
所述 Fl 为 5’ -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3’ ；R1 为 5’ -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3’。
2.—种权利要求1所述的半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体的制备方法，其特征在于: 以半滑舌鳎cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增IFIT基因；PCR扩增产物用T4DNA连接酶与载体pEASY-E2连接，连接液转化入大肠杆菌DH5 α，筛选获得的质粒；将获得质粒与质粒PCN3用限制性内切酶EcoRV酶切，酶切片段用T4DNA连接并转化入大肠杆菌DH5a，筛选获得的质粒pCNIIP，即为半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒；
所述 Fl 为 5’ -GCCACCATGAGTGCTGCTGAGACTAAAAC-3’ ；R1 为 5’ -GATATCGCCCTCTTGTTCCAAGTTTTCC-3’。
3.—种权利要求1所述的半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体的应用，其特征在于:所述半滑舌鳎干 扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒用于防控细胞肿大病毒感染。
4.根据权利要求3所述的半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体的应用，其特征在于:所述半滑舌鳎干扰素调控蛋白IFIT的表达载体质粒用于制备抗细胞肿大病毒的药物。
【文档编号】C12N15/70GK104178508SQ201410401856
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】孙黎, 龙昊 申请人:中国科学院海洋研究所