莲草直胸跳甲tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种莲草直胸跳甲tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由SYBRPremixExTaqTM、引物混合物、标准tubulin基因模板和超纯水组成。本发明实现了方便快捷的检测tubulin基因转录水平的目的。本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优点。
【专利说明】莲草直胸跳甲tubu I in基因转录水平荧光定量PCR检测试 剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种莲草直胸跳甲微管蛋白（tubulin)基因转录水平的荧光定量PCR 检测试剂盒，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002] 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR)，即DNA体外扩增技术，是 1985年由美国Mullis首创的一种生物高技术，随着耐高温的Taq酶的出现，扩增自动化的 完善，PCR近年得以迅速推广，它仅需要微微克水平的模板就能快速特异大量地复制任何所 希望的基因或DNA片断。
[0003] 荧光定量PCR是一种核酸定量技术，该技术在PCR反应系统中引入了特定的荧光 标记物质，通过检测每个热循环后PCR反应体系中的荧光值的变化情况来实时监测DNA的 扩增情况，并获得每个样本的荧光定量变化曲线，从而获得每个反应管的Ct值(荧光变化 达到阈值时的循环数)，以起始模板数的对数为横坐标，以Ct值为纵坐标制备标准曲线，据 此标准曲线和各个标本的Ct值对每个反应的起始DNA模板数进行定量测定。
[0004] SYBR Green是一种结合于双链DNA小沟中的结合染料。利用荧光染料（SYBR Green)与双链DNA分子结合发光的特性来指示扩增产物的增加。在PCR反应体系中，加入 过量SYBR Green I荧光染料，当该染料掺入DNA双链后，荧光信号增强；当DNA变性时SYBR Green I染料释放出来，荧光急剧减少；随后在聚合延伸过程中引物退火并形成PCR产物， SYBR Green I染料与双链产物结合，经检测获得荧光的净增量。荧光信号的增加与PCR产 物的增加完全同步。这种高灵敏度、较低毒性的核酸染料在结合双链DNA分子后荧光增强 800-1000 倍。
[0005] SYBR Green在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结 合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。此外，由于 一个PCR产物可以与多分子的染料结合，因此SYBR Green的灵敏度很高。但是，由于SYBR Green与所有的双链DNA结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起 的假阳性会影响定量的精确性。通过测量升高温度后荧光的变化可以帮助降低非特异产物 的影响。由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBR Green得到定量结果的准确 性。
[0006] 在荧光定量PCR检测基因表达水平时，经常检测某个基因的相对表达量，其中内 参基因常常选择tubulin。通过大量的实验研究，我们优化出了一套能够有效检测莲草直胸 跳甲tubulin基因表达量的引物和PCR反应条件，并组装成tubulin基因表达检测荧光定 量聚合酶链式反应试剂盒，以满足生命科学、植物保护研究者的检测需要。
【发明内容】
[0007] 本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种莲草直胸跳甲 tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒。
[0008] 本发明的技术方案如下： 一种莲草直胸跳甲tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，试剂盒由SYBR? Premix Ex Taq?、引物混合物、标准tubulin基因模板和超纯水组成，试剂盒中各组成成分 如下： SYBR Premix Ex Taq?:内含 TaKaRa Ex TaqHS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I 等。
[0009] 引物混合物：引物1为10 Mmol/L、引物2为10 Mmol/L， 引物 1 序列为 V - CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT -3 ^、 引物 2 序列为 5 ' - GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC -3 '; 标准tubulin基因模板：浓度为1. 0 Mmol/L，tubulin基因模板序列为：5 ' - CAGGTG AAGGTATGGACGAAATGGAATTCACTGARGCMGAATCMAACATGAAYGAWTTAGTATCTGAATACCAACAATACCAA GAGGC -3 ;； 超纯水组成：纯度超过18. 25 ΜΩ · CM。
[0010] 本发明具有以下有益效果： 1.本发明实现了方便快捷的检测tubulin基因转录水平的目的。
[0011] 2.本发明在检测基因转录水平方面具有灵敏度高、稳定性好、实验成本低的优 点。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 附图为莲草直胸跳甲tubulin基因转录水平的荧光检测结果。
[0013] 图1 :莲草直胸跳甲tubulin基因扩增曲线，横坐标为PCR循环次数，纵坐标为相 对突光量值（Relative Fluorescence Units, RFU); 图2 :莲草直胸跳甲tubulin基因熔解曲线，横坐标为温度，纵坐标为单位温度下相对 荧光值的变化量。
[0014] 扩增曲线结果表明tubulin基因荧光信号值符合标准的"S"型曲线，熔解曲线表 明该荧光定量具有高度的检测专一性。
【具体实施方式】
[0015] 以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0016] 本试剂盒由SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、标准tubulin基因模板和超纯水 组成，试剂盒组成： 表1
【权利要求】
1. 一种莲草直胸跳甲tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测引物，其特征 在于：引物1序列为V -CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT -3 7、引物2序列为V -GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC -3 7 。
2. -种莲草直胸跳甲tubulin基因转录水平荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所 述试剂盒包括SYBR Premix Ex Taq?、引物混合物、标准tubulin基因模板和超纯水组成， 试剂盒中各组成成分如下： SYBR Premix Ex Taq?:包含TaKaRa Ex TaqHS，dNTP Mixture，Mg2+，Tli RNaseH，SYBR Green I ； 引物混合物：引物1为10 Mrnol/L、引物2为10 Mmol/L， 引物 1 序列为 V - CAGGTGAAGGTATGGACGAAAT -3 ^、 引物 2 序列为 5 ' - GCCTCTTGGTATTGTTGGTATTC -3 '; 标准tubulin基因模板：浓度为1. 0 Mmol/L，tubulin基因模板序列为：5 ' - CAGGTG AAGGTATGGACGAAATGGAATTCACTGARGCMGAATCMAACATGAAYGAWTTAGTATCTGAATACCAACAATACCAA GAGGC-3 '; 超纯水组成：纯度超过18. 25 ΜΩ · CM。
【文档编号】C12N15/11GK104152560SQ201410401765
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】郑丽祯, 傅建炜, 史梦竹, 李建宇, 游泳, 林涛 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所