一种大批量开发苎麻基因组ssr标记的方法及其开发的引物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种大批量开发苎麻基因组SSR的方法及其开发的引物；具体包括如下步骤：(1)提取苎麻的DNA；(2)利用Rsal酶对苎麻基因组进行酶切，获得214-314bp的小片段；(3)对酶切获取的小片段进行测序，获得SLAF标签；(4)对标签，利用SSRhunter搜索SSR序列；(5)对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即为基因组SSR标记。相对于传统的磁珠富集法，方法易行，操作简便，效率高，成本低。大批量苎麻基因组SSR标记的获得，为苎麻分子生物学和遗传学奠定了坚实基础。
【专利说明】-种大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法及其开发的引 物
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，具体涉及一种从苎麻基因组中高通量开发SSR标 记的方法及其开发的引物。
【背景技术】
[0002] 简单序列重复（simple sequence repeat，SSR)，也称微卫星（microsatellite), 是指以1?6个核苷酸为单位在基因组中多次串联重复的DNA序列（Akkaya M, Bhagwata A, Cregan B. 1992.Length polymorphisms of simple repeat DNA in soybean. Genetics. 132:1131-1139)。SSR标记与其它分子标记技术相比，具有易检测、共显性遗 传、重复性好、数量丰富和多态性高以及遍布整个基因组等优点，因此在植物遗传研究的 众多方面受到重视（Schlotterer C. 2004. The evolution of molecular markers-just a matter offashion. Nat Rev Genet. 5:63-69)。SSR 可分为基因组 SSR 和 EST-SSR。传 统的基因组SSR标记开发一般使用文库筛选法、磁珠富集法，开发过程繁琐、时间长、成本 高，而且效率低（Roder MS，Korzun V，WendehakeK，Plaschke J，Tixier MH，Leroy P, Ganal MW. 1998.A microsatellite map of wheat. Genetics. 149:2007-2023)。此外，传统方法开 发的基因组SSR不但数量较少，而且重复基序也限制在2?3个核苷酸，极大地限制了基因 组SSR的应用范围（林元震，郭海，黄少伟，刘纯鑫，刘天颐，陈晓阳.2009. EST-SSR标记在 木本植物中的开发和应用.植物生理学通讯.45(12) : 1221-1225)。
[0003] 随着具有高通量、低成本、测序错误率低、测序读长短特点的新一代测序技术和生 物信息学的发展，使得高通量标记开发成为可能。目前，苎麻开发的SSR标记主要采用磁珠 富集法和从EST中开发SSR标记，开发的SSR标记不足2000对。利用SLAF-seq技术开发 SSR标记尚未见报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是在于提供一种大批量开发苎麻基因组SSR的方法及其开发的引 物；相对于传统的磁珠富集法，方法易行，操作简便，效率高，成本低。大批量苎麻基因组 SSR的获得，为苎麻分子生物学和遗传学奠定了坚实基础。
[0005] -种大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，具体包括如下步骤：
[0006] (1)提取苎麻的DNA ;
[0007] (2)将苎麻基因组DNA酶切为小片段；
[0008] (3)对酶切后获取的小片段进行测序，获得SLAF标签；
[0009] (4)对步骤（3)获得的标签，利用SSR hunter搜索SSR序列；
[0010] (5)对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即 为基因组SSR标记。
[0011] 步骤（2)中采用RsaI酶酶切苎麻基因组DNA。酶切后获取长度为214-314bp的片 段。步骤（4)的SSR hunter搜索SSR序列的标准为：单核苷酸的重复次数> 16,二核苷酸 的重复次数> 8,三核苷酸的重复次数> 5,四核苷酸的重复次数> 4,五核苷酸的重复次数 > 3,或者六核苷酸的重复次数> 3 ;
[0012] 步骤（5)的引物设计参数：扩增产物长度在100-180bp，引物长度在18-25bp。
[0013] 采用上述方法设计并经过多态性检测的15对基因组SSR引物序列如下：
[0014]
【权利要求】
1. 一种大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，具体包括如下步骤： (1) 提取苎麻的DNA ; (2) 将苎麻基因组DNA酶切为小片段； (3) 对酶切后获取的小片段进行测序，获得SLAF标签； (4) 对步骤（3)获得的标签，利用SSR hunter搜索SSR序列； (5) 对搜索到的SSR序列进行引物设计，经引物多态性检测，得到多态性引物，即为基 因组SSR标记。
2. 根据权利要求1所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，步骤 (2)中采用RsaI酶酶切苎麻基因组DNA。
3. 根据权利要求2所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，酶切后 获取长度为214-314bp的片段。
4. 根据权利要求1所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，步骤 (4) 的SSR hunter搜索SSR序列的标准为：单核苷酸的重复次数> 16,二核苷酸的重复次 数> 8,三核苷酸的重复次数> 5,四核苷酸的重复次数> 4,五核苷酸的重复次数> 3,或者 六核苷酸的重复次数> 3。
5. 根据权利要求1所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法，其特征在于，步骤 (5) 的引物设计参数：扩增产物长度在100_180bp，引物长度在18-25bp。
6. 根据权利要求1或2或3或4或5所述的大批量开发苎麻基因组SSR标记的方法， 其特征在于，设计并经过多态性检测的15对基因组SSR引物序列如下：
7. 用于苎麻基因组SSR标记的引物，其特征在于，15对基因组SSR标记引物序列如下：
【文档编号】C12N15/11GK104212897SQ201410449957
【公开日】2014年12月17日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】栾明宝, 刘晨晨, 陈建华, 王晓飞, 许英, 孙志民 申请人:中国农业科学院麻类研究所