一种高活性纤维二糖酶及其编码基因与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高活性纤维二糖酶及其编码基因与应用，该纤维二糖酶是(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表 SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺失和/或添加且具有纤维二糖酶高活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明所述的纤维二糖酶具有很强分解纤维二糖的活性，最大反应速率可达740.39±10.23U/mg。产物葡萄糖抑制方面，该酶显示出很好的耐受性，其抑制常数Ki高达800mM。研究表明，本发明的纤维二糖酶具有高催化活力、高产物耐受及耐热性，具有在生产中推广应用的巨大潜力。
【专利说明】一种高活性纤维二糖酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种在较高温度下可高效分解纤维二糖的纤 维二糖酶，以及该纤维二糖酶的编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 纤维二糖酶（EC 3. 2. 1. 21，也称β -葡萄糖苷酶β-glucosidase)属于外切水解 酶类。它的特性是可水解结合于末端、非还原性的β-D-糖苷键，同时释放β-D-葡萄糖和 相应的配基；此外还能微弱地水解对硝基苯-β -D-半乳糖和β -D-木糖苷。纤维二糖酶不 仅是纤维素酶重要组成成分，降解纤维素的关键酶而且常被用作风味酶，提高啤酒、果汁等 的风味。
[0003] 目前，寻找具有耐高糖的纤维二糖酶成为研究纤维二糖酶的热点，因为这种酶可 以提高木质纤维素的糖化速率。报道显示有些微生物纤维二糖酶有较高的葡萄糖抑制常 数，糖耐受性高（Lu, J.，et al. , Expression and characterization of a novel highly glucose-tolerant beta-glucosidase from a soil metagenome. Acta Biochimica Et Biophysica Sinica, 2013. 45 (8) :p. 664-673.)，但是这些酶对纤维二糖的水解活性相当 低。纤维二糖是纤维素分子的结构单元，也是纤维素酶水解纤维素时的主要产物，它能强 烈抑制纤维素酶的水解作用。纤维二糖酶能够水解纤维二糖产生两分子的葡萄糖，是纤维 素酶的限速酶。它不仅可水解纤维二糖，更可解除纤维二糖对内切葡聚糖酶和外切葡聚 糖酶的抑制，提高水解速率和程度（Gusakov, A.V.，et al·，Design of highly efficient cellulase mixtures for enzymatic hydrolysis of cellulose. Biotechnology and Bio engineering, 2007. 97(5) :p. 1028-1038.)。人们发现，水解纤维素过程中，由于纤维二糖酶 活力的匮乏，反应体系中常常出现纤维二糖的累积，而纤维二糖的累积对内切型-β -葡 聚糖酶及外切型-β -葡聚糖酶的水解反应具有很强的反馈抑制作用（Shen, Υ.，et al. , Simultaneous saccharification and fermentation of acid-pretreated corncobs with a recombinant Saccharomyces cerevisiae expressing beta-glucosidase. Bioresource Technology, 2008. 99(11) :p. 5099-5103.)。因此获得能耐受很高的葡萄糖浓 度且具有很强分解纤维二糖的活性的纤维二糖酶对降解廉价纤维素生物质，解决能源危机 具有重要的现实意义。
[0004] 工业应用过程中，酶热稳定性越高越有利，所以采用基因工程手段从嗜热菌中克 隆表达纤维二糖酶引起了人们的兴趣。大肠杆菌由于系统简单，在表达系统的选择上范 围广泛，因此通常被用作蛋白质表达的宿主菌。已有报道来源于嗜热菌和真菌的一些基 因在E. COli中大量表达时，常常出现表达的蛋白质形成包涵体或被蛋白酶降解的情况， 原因可能重组蛋白不能正确折叠（Pan, K.L.，et al·，Roles of DegP in prevention of protein misfolding in the Periplasm upon overexpression of penicillin acylase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 2003. 185 (10) :p. 3020-3030·)。已证 实，分子伴侣可以参与蛋白质的正确折叠。据报道，目的蛋白质与伴侣蛋白共同表达，便可 增加可溶性蛋白质的回收率，而使用通常方法，由于包涵体的形成，这些表达蛋白质常常是 不可回收的（de Marco, A.，et al. , Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E-coli.Bmc Biotechnology, 2007. 7.)〇
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种具有较高产物葡萄糖耐受的高活性纤维二糖酶及其编 码基因与应用。
[0006] 本发明所提供的高活性纤维二糖酶，来源于嗜热厌氧杆菌 (Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27)，是如下（a)或（b)的蛋白质：
[0007] (a)由序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (b)将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/ 或缺失和/或添加且具有纤维二糖酶高活性的由（a)衍生的蛋白质。
[0009] 其中，序列表中的SEQ ID No:2由446个氨基酸组成，分子量约为46kD。
[0010] 为了使（a)中的纤维二糖酶便于纯化，在序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序 列组成的蛋白质C端连接上6 XHis标签。
[0011] 上述（a)和（b)中的纤维二糖酶可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物 表达得到。（b)中的纤维二糖酶的编码基因可通过将序列SEQ ID No: 1中的DNA序列中缺 失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变得到。
[0012] 上述的纤维二糖酶的编码基因，所述编码基因选自如下1)或2)或3):
[0013] 1)其核苷酸序列为序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA分子；
[0014] 2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码所述纤维二糖酶的DNA分子；
[0015] 3)与1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述纤维二糖酶的DNA分子。
[0016] 上述严格条件是，在6XSSC，0. 5% SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 I X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0017] 含有上述任一所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属于 本发明的保护范围。
[0018] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0019] 本发明的纤维二糖酶具有高活性，所述高活性是指以对硝基苯葡萄糖苷（pNPGlu) 为底物，酶活达到180. 02U/mg，且具有很强分解纤维二糖的活性，最大反应速率达到 740. 39±10. 23U/mg。
[0020] 实验表明，本发明的纤维二糖酶具有很高的葡萄糖耐受浓度，抑制常数Ki高达 800mM，其最适反应温度为60°C，最适pH值为6. 0,在55°C保温30min，酶活保留率超过 80%。
[0021] 本发明所述的纤维二糖酶具有高表达量、高回收率、高催化活力、高产物耐受及耐 热性，具有在生产中推广应用的巨大潜力。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明PCR扩增产物的电泳图谱；其中，I :PCR扩增产物；2 :分子量标准 (DL2000)。
[0023] 图2为本发明表达载体pET-30a_bgl质粒的鉴定电泳图谱；I :分子量标准（lkb DNA ladder) ;2 :pET-30a_bgl 质粒；3 :Nde I 和 Xho I 双酶切的 pET-30a_bgl ;4 :Nde I 和 Xho I双酶切的pET-30a ;5 :pET-30a-bgl质粒PCR扩增产物。
[0024] 图3为本发明纤维二糖蛋白表达电泳图谱。1 :蛋白分子量标准；2 : E.coliBL21(DE3)lmM IPTG 诱导下的总蛋白；3 :未添加 IPTG 诱导的 E.coliBL21(DE3)/ pET-30a-bgl/pGro7 总蛋白；4 :E. coliBL21(DE3)/pET-30a-bgl/pGro7 在 ImM IPTG 诱导下 的总蛋白；5 :纯化的纤维二糖酶。
[0025] 图4为本发明纤维二糖酶酶学性质曲线，a为最适pH曲线；b为pH稳定性曲线；c 为最适反应温度曲线；d为温度稳定性曲线。
[0026] 图5为本发明纤维二糖酶葡萄糖耐受曲线。
[0027] 图6为本发明纤维二糖酶对纤维二糖的降解动力学曲线。
【具体实施方式】
[0028] 实施例1
[0029] 纤维二糖酶表达菌株的构建
[0030] 1.纤维二糖酶基因的扩增
[0031] 根据与本发明所用菌株 Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27 同源性 极高的 Thermoanaerobacterium saccharolyticum JW/SL-YS485 的纤维二糖酶基因序列 (GenBank:CP003184. 1)为模板，设计 PCR 引物：
[0032] Pl:5'-TAGCCCCATATGGCTAATTTTCCAAAAGGT-3' （SEQ ID No:3)
[0033] P2 :5,-TCCGTCTCGAGAAAAACAATTGAAGCTCTATTTAT-3, （SEQ ID No:4)
[0034] 在引物的5'分别引入Nde I和Xho I酶切位点，并在纤维二糖酶基因3'端引入 6 XHis tag标签，这样表达出的纤维二糖酶带有组氨酸标签，利用镍柱亲和层析方法，可将 表达出的纤维二糖酶进行亲和层析纯化，以利于快速、高效的获得纤维二糖酶纯品。
[0035] 以 Thermoanaerobacterium aotearoense SCUT27 基因组 DNA 为模板，扩增纤维二 糖酶基因 bgl。PCR程序如下：第一阶段变性98°C，2min ;第二阶段变性98°C，l〇SeC，退火 51°C，lOsec，延伸72°C，Imin 20sec，共进行30个循环；第三阶段延伸72°C，lOmin。得到 的PCR产物用1%琼脂糖电泳检测，结果见图1。得到的纤维二糖酶的核苷酸序列如SEQ ID No: 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。
[0036] 2.重组质粒的构建
[0037] 纯化的PCR扩增产物和pET_30a分别用Nde I和Xho I双酶切，纯化双酶切后的 产物，用T4连接酶将酶切后的bgl与pET-30a质粒连接，建立如下连接体系：40ng pET-30a 载体，80ng PCR 扩增产物，1μ I IOXligation buffer，补水至 10yl，16°C 连接 16h。连接 产物热激转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，得到的转化子测序验证是否突变；挑选序列正确 的克隆提取质粒，获得含有纤维二糖酶基因的重组质粒pET-30a-bgl。用1%琼脂糖电泳鉴 定重组质粒，结果见图2。
[0038] 3.含有重组质粒和伴侣质粒PGro7(TaKaRa，Japan)共表达体系的工程菌构建
[0039] 本实施例中所使用的表达宿主菌为含有pGr〇7载体的E. coli BL21 (DE3) (TaKaRa 公司），使用该菌株的目的是为了利用pGr〇7载体中的伴侣分子帮助纤维二糖酶在E. coli 中的大量有活性的表达。
[0040] 根据TaKaRa公司Chaperone Plasmid Set说明书构建共表达体系，步骤如下： [0041] (1)培养表达用的E. coli BL21 (DE3)，然后按常规方法制备感受态细胞；
[0042] (2)把伴侣质粒pGr〇7转化⑴制备的感受态细胞，然后在含有氯霉素（20 μ g/ ml)的平板上培养，筛选伴侣蛋白质粒转化体；
[0043] (3)将伴侣蛋白质粒转化体在含有20 μ g/ml氯霉素的液体培养基中培养，再用通 常方法将其制备成感受:态细胞。
[0044] (4)将重组质粒pET-30a_bgl转化（3)制备的感受态细胞，并于含有氯霉素 (20 μ g/ml)和含有卡那霉素（50 μ g/ml)的平板上培养，筛选阳性克隆转化体。得到含有本 发明 bgl 基因的工程菌 E. coli BL21(DE3)/pET-30a-bgl/pGro7。
[0045] 实施例2
[0046] 纤维二糖酶的表达和蛋白纯化
[0047] 将过夜培养的含有纤维二糖酶基因的重组菌E. coli BL21(DE3)/pET-30a_bgl/ pGr〇7按1:50比例接种于含有20 μ g/ml氯霉素、50 μ g/ml卡那霉素新鲜LB液体培养基中， 放置于37°C、250rpm条件下培养。当菌体密度006(|(|约0. 3-0. 5,加入终浓度lmg/ml L-阿拉 伯糖诱导伴侣蛋白的表达继续在37°C下培养；至OD约0. 6-1. 0加入终浓度为ImM的IPTG 诱导纤维二糖酶的表达，继续在于25°C、200rpm条件下继续培养6小时。如图3所示，重组 纤维二糖酶蛋白量占总蛋白量的约15-25%，达12. 29mg/L发酵液。
[0048] 在4°C、8000g条件下离心收集菌体，每IOOmg湿菌加入Iml缓冲液A(20mM磷酸盐 缓冲液，500mM氯化钠，20mM咪唑，pH 7. 4)重悬，450W冰水浴下超声60min破碎细胞。之后 离心收集上清，得到纤维二糖酶粗酶液。进一步通过常规镍柱亲和层析方法纯化纤维二糖 酶。最终实施例中纯化所得的纤维二糖酶纯度超过95%，回收率约为43%。
[0049] 实施例3
[0050] 重组纤维二糖酶的活性测定
[0051] 酶活测定以对硝基苯葡萄糖苷（pNPGlu)为底物测定实施例2中所得纤维二糖酶 活性。
[0052] 纤维二糖酶酶活测定方法为：在170 μ 1柠檬酸（IOOmM)-磷酸氢二钠
[0053] (50mM)pH 6. 0 的缓冲液中添加 20μ I 25mM pNPGlu，加入 10μ L 酶液，60°C 反应 5min后，快速加入600 μ L IM Na2CO3终止反应。在405nm测定吸光度值，通过查询对硝基 苯酚（PNP)与A 4tl5之间的标准曲线，获得所催化生成的pNP量。
[0054] 纤维二糖酶活力单位定义为（U) Imin催化释放1 μ mol pNP所需要的酶量。
[0055] 实施例2中所得的纤维二糖酶比酶活为180. 02U/mg，相应的米氏常数Kni为 0. 69mM。
[0056] 实施例4
[0057] 纤维二糖酶催化特性研究
[0058] 1.最适反应pH和pH稳定性研究
[0059] 配制pH 4. 0?8. 0的柠檬酸（IOOmM)-磷酸氢二钠（50mM)缓冲液。分别在不同 PH缓冲液中测定实施例2所得的重组纤维二糖酶酶活，结果如图4a所示。该酶最适反应 pH为6. 0,在弱酸性条件下具有较好的催化活力，在pH>7. 0时，酶催化活性快速丧失。
[0060] pH稳定性研究中，将实施例2所得的纤维二糖酶在不同pH的缓冲溶液中4°C条件 下放置24h，之后在60°C常规酶活测定方法测定残余酶活。研究结果表明（图4b)，实施例 2所得的纤维二糖酶在pH 5. 0-7. 0范围内酶活保留率>80%。
[0061] 2.最适催化温度和温度稳定性研究
[0062] 在不同温度下测定实施例2所得的纤维二糖酶酶活。结果如图4c所示，该酶的最 适反应温度为60°C，在55和65°C时的酶活是最适条件下的约90%。当酶促反应温度提高 至80°C时，其酶活约为最优条件下测得酶活的30%。
[0063] 将重组纤维二糖酶分别在50°C和55°C条件下保温不同时间测定残余酶活，结果 显示该酶在55°C条件下保温30min，酶活保留率达到82%，60min后残余酶活扔仍有75%。 而在50°C条件下保温120min，残余酶活达到63%。
[0064] 4.产物葡萄糖对纤维二糖酶酶活抑制研究
[0065] 实施例2所得的纤维二糖酶的酶促反应中添加 0. 1-1. 5M的产物葡萄糖，考察酶催 化效力。结果如图5所示，在反应初始添加的葡萄糖浓度低于200mM时，产物葡萄糖对该纤 维二糖酶酶活具有促进作用。特别的，IOOmM的产物葡萄糖添加可促进该酶酶活提高至原来 的143%。随着酶促反应初始添加的产物葡萄糖浓度不断升高，实施例2中所得的纤维二糖 酶催化能力逐渐受到抑制。通过计算，该酶的产物葡萄糖抑制常数达到K i为800mM。
[0066] 实施例5
[0067] 纤维二糖酶水解纤维二糖的应用
[0068] 分别测定实施例2所得的纤维二糖酶以不同浓度的纤维二糖为底物时的催化效 力。此处，纤维二糖酶活力单位定义为Imin在pH 6. 0、60°C条件下生成1 μ mol葡萄糖所需 要的酶量。实验结果表明，该酶以纤维二糖为底物的酶活可达740. 39± 10. 23U/mg。
[0069] 为了分析重组酶对纤维二糖的降解能力，用重组酶处理36g/L的纤维二糖分别 10min、20min、30min、40min、50min、60min，然后采用 HPLC 测定生成的葡萄糖量，反应 60min 后纤维二糖基本上全部降解为葡萄糖，催化效率较高，如图6所示。可见本发明所述纤维二 糖酶对纤维二糖有很强的水解活性，对于增强纤维素酶的协同降解性能，促进纤维素酶在 生物质能源产业化中的应用等具有重要意义。
【权利要求】
1. 一种高活性纤维二糖酶，其特征在于，选自如下（a)或（b): (a) 由序列表中SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 将序列表中SEQ ID No:2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基取代和/或缺 失和/或添加且具有纤维二糖酶高活性的由（a)衍生的蛋白质。
2. 权利要求1所述的纤维二糖酶的编码基因。
3. 根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因选自如下（1)或（2)或 (3)： (1) 其核苷酸序列为序列表中SEQ ID No: 1所示的DNA分子； (2) 在严格条件下与（1)限定的DNA序列杂交且编码所述纤维二糖酶的DNA分子； (3) 与（1)限定的DNA序列有90%以上同源性且编码所述纤维二糖酶的DNA分子。
4. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组载体。
5. 含有权利要求2或3所述编码基因的重组菌。
6. 含有权利要求2或3所述编码基因的转基因细胞系。
7. 含有权利要求2或3所述编码基因的表达盒。
8. 权利要求1所述纤维二糖酶在降解纤维素中的应用。
【文档编号】C12P19/14GK104312997SQ201410449969
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年9月4日 优先权日:2014年9月4日
【发明者】李爽, 阳芳 申请人:华南理工大学