一种30分钟内提取土壤微生物基因组dna的试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种30分钟内提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，本试剂盒能够在三十分钟内快速、高效地提取纯度高、浓度高的土壤微生物基因组DNA，克服了传统土壤微生物基因组DNA提取耗时长以及需要进一步纯化的缺点。利用本试剂盒提取得到的土壤微生物基因组DNA无需进一步纯化，便能直接用于下游实验。本试剂盒主要包括土壤样品的前处理，以及土壤微生物基因组DNA的提取和纯化。本方法耗时短，效率高。
【专利说明】—种30分钟内提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明提供一种30分钟内提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，属于生物【技术领域】。
技术背景
[0002] 土壤除了为陆生植物提供营养源和水分之外，还是植物生长，进行光合作用、能量交换的主要场所；同时也具有微生物生长繁殖所需要的一切营养物质及各种条件，是微生物良好的生活场所，有“微生物的天然培养基”之称。
[0003]土壤是微生物的主要栖息地，是自然环境中最复杂的异质体系，这决定了土壤微环境的多样化和土壤微生物的高度多样性。每克土壤含有大约17个原核生物细胞，但仅有
0.1%~10%的土壤微生物是可以培养的。在微生物学研究领域中，因为99%以上的微生物都是目前未(难)被纯培养的，过去人们对微生物世界的认识基本上都集中在不到1%的微生物上。对这些未培养微生物多样性及群落功能的研究将大大扩展我们对生命的了解，包括了解生命如何耐受极端环境、新的生物能源、生命进化以及微生物与环境之间的相互作用。
[0004]微生物环境基因组学为最大限度地挖掘微生物资源带来了前所未有的机遇，已经成为国际生命科学技术研究和开发最重要的热点和前沿。为了充分认识不可培养微生物的丰富资源，结合现代分子生物学技术的发展，已建立起了许多不需要对微生物进行独立培养的新方法和新技术。如变性梯度凝胶电泳(DGGE)法是将目标基因进行PCR扩增，通过对PCR产物进行分离和鉴定分析土壤微生物群落结构的组成信息；随机扩增多态性DNA技术(RAPD)是应用不同的随机引物在非严格的条件下进行PCR扩增，通过分析PCR产物在凝胶电泳上的条带多态性来反映样品中微生物的多样性。
[0005]关于土壤微生物基因组学技术的构建已有许多研究报道，主要的突破在于需要足够高质量的DNA，因此直接从土壤环境中提取和纯化DNA是其中最关键的步骤。土壤微生物基因组学技术在我国土壤及环境微生物生态学方面的研究才刚起步，对这一新技术的跟踪和应用，将会有力地促进我国土壤微生物生态学研究的发展。因此，研究一种高效提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，对于大规模开展土壤微生物基因组学研究显得十分必要。
[0006]
【发明内容】
:
本发明提供一种30分钟内提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，利用该试剂盒能够高效、快速提取土壤微生物DNA，所提取得到的DNA纯度高、浓度高。
[0007]一种三十分钟内快速提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，所述试剂盒包括:
(1)Buffer A 溶液的配置:ρΗ=5_6、0.5-2M Tris-HCl ；
(2)Buffer B 溶液的配置:0.1-0.3M Al2(SO4)3 ；
(3)Buffer C 溶液的配置:3_5M NaOH ；
(4)Buffer D 溶液的配置:ρΗ=7_9、0.1-0.2Μ Tris-HCl ；
(5)Buffer E 溶液的配置:300-350 μ IUOwt.%SDS ；(6)BufferF溶液的配置:称取2_3g LiCl，l_2g Tris，3_4g EDTA，加入双蒸水溶解并调节至pH=7.5-8.5，定容至10ml ；
(7)去蛋白液溶液配制:4-6M盐酸胍，15-25mM Tris-HCl，pH6.5-7.0，使用前加入乙醇，乙醇浓度为35-40wt.% ；
(8)漂洗液溶液配制:15-25mMNaCl, l_3mM Tris-HCl, ρΗ7.0-8.0 ；
(9)洗脱液溶液配制:5-15mMTris-HCl, ρΗ8.0-9.0。
[0008]上述试剂盒的优选配方:
(1)Buffer A 溶液的配置:ρΗ=5.5、IM Tris-HCl ；
(2)Buffer B 溶液的配置:0.2M Al2(SO4)3 ；
(3)Buffer C 溶液的配置:4M NaOH ；
(4)Buffer D 溶液的配置:pH=8、0.1M Tris- Tris-HCl ；
(5)Buffer E 溶液的配置:325 μ 1、10%SDS ；
(6)BufferF 溶液的配置:称取 2.416g LiCl，1.211g Tris，3.506g EDTA，加入双蒸水溶解并调节至pH=8.0,定容至100ml ；
(7)去蛋白液溶液配制 :5M盐酸胍，20mM Tris-HCl，pH6.6，使用前加入乙醇，乙醇浓度为 38wt.% ；
(8)漂洗液溶液配制:20mMNaCl，2mM Tris-HCl, ρΗ7.5 ；
(9)洗脱液溶液配制:10mMTris-HCl，pH 8.5。
[0009]所述的试剂盒提取土壤微生物基因组DNA的方法，包括土壤样品的前处理，土壤微生物基因组DNA的提取和纯化。具体步骤为:
Cl) 土壤样品的前处理:用天平称取0.5g的土壤于2ml的离心管中，加入100 μ IBuffer Α，600μ I 无菌水，300μ I Buffer B，涡旋震荡 30s ;加入 100 μ I Buffer C，300 μ IBuffer D，涡旋震荡 30s ；8000g 离心 2min，去上清；
(2)土壤微生物基因组DNA的提取和纯化:加入325 μ I Buffer D，0.5g 0.5mm玻璃珠，325 μ I Buffer Ε,325μ I Buffer F，涡旋震荡 lmin，4°C IlOOOg 离心 2min，吸取 750ul 上清至1.5ml离心管，加入750μ I酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，涡旋震荡30s，4°C 16000g离心lmin，将上清转移至1.5ml离心管，加入等体积的沉淀剂，将样品加到硅基质膜核酸纯化柱上，12000 g离心30s，弃废液，加入500 μ I去蛋白液，12000 g离心30s，加入500 μ I漂洗液，12000 g离心30s，吹干，加入50μ I洗脱液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0010]所得的土壤微生物的纯度可达1.78。对提取的土壤微生物DNA进行16sr DNA扩增实验，发现本方法所获得的土壤微生物DNA不需经过进一步纯化便能扩增出16sr DNA,这进一步证明了本方法能获得纯度高的土壤微生物DNA。
[0011]本发明的显著优点:
1.适用于各种不同土壤样品。
[0012]2.仅需30分钟便能从土壤中提取出微生物基因组DNA。
[0013]3.提取到的土壤微生物基因组DNA具有较高的纯度，适用于下一步实验。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为5种不同土壤样品的微生物基因组DNA提取结果图；泳道1，2，3，4，5分别表示甘蔗土壤微生物基因组DNA，花生土壤微生物基因组DNA，玉米土壤微生物基因组DNA，化感水稻PI312777 土壤微生物基因组DNA，非化感水稻Lemont 土壤微生物基因组DNA。
[0015]图2为5种不同土壤样品的微生物基因组16s rDNA扩增结果图；泳道1，2，3，4，5分别表示甘蔗土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，花生土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，玉米土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，化感水稻PI312777 土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，非化感水稻Lemont土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图。
具体实施例
[0016]实施例1
本发明的一种三十分钟内快速提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒及方法，具体步骤如下:
(I)原料:新鲜甘蔗根际土壤，新鲜花生根际土壤，新鲜玉米根际土壤，新鲜化感水稻PI312777根际土壤，新鲜非化感水稻Lemont根际土壤。
[0017](2) 土壤样品的前处理:用天平分别称取不同的土壤样品0.5g于2ml的离心管中，加入 100 μ I Buffer A，600 μ I 无菌水，300 μ I Buffer B，涡旋震荡 30s;加入 100 μ IBuffer C, 300 μ IBuffer D,润旋震荡 30s; 8000g 离心 2min,去上清。
[0018] (3) 土壤微生物基因组DNA的提取和纯化:加入325 μ I Buffer D，0.5g 0.5mm玻璃珠，325μ1 Buffer Ε,325μ I Buffer F，涡旋震荡 lmin，，4°C IlOOOg 离心 2min。吸取750ul上清至1.5ml离心管，加入750 μ I酚:氯仿:异戊醇(25:24:1),涡旋震荡30s，4。。16000g离心lmin。将上清转移至1.5ml离心管,加入等体积的沉淀剂,将样品加到娃基质膜核酸纯化柱上，12000 g离心30s，弃废液，加入500 μ I去蛋白液，12000 g离心30s，加Λ 500 μ I漂洗液，12000 g离心30s，吹干，加入50 μ I洗脱液。于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0019](4)扩增土壤微生物16sr DNA基因:通过PCR的方式进行土壤微生物16sr DNA基因的扩增，PCR扩增体系如下:rTaq酶0.3 μ 1,PCR buffer 2.5 μ I, DNTP ΙμL，引物R I μ 1，引物F I μ 1，土壤微生物基因组DNA I μ 1，灭菌水18.2 μ I。PCR扩增程序如下:95。C 5min ；95° C 30s, 58° C 30s, 72。C 30s, 35 个循环；72。C 5min。将扩增得到的产物用1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
[0020]试剂盒配方为:
(1)Buffer A 溶液的配置:1M Tris-Cl (pH=5.5)；
(2)Buffer B 溶液的配置:0.2M Al2(SO4)3 ；
(3)Buffer C 溶液的配置:4M NaOH ；
(4)Buffer D 溶液的配置:0.1M Tris-Cl (pH=8)；
(5)Buffer E 溶液的配置:325 μ I 10%SDS ；
(6)BufferF 溶液的配置:称取 2.416g LiCl, 1.211g Tris，3.506g EDTA，加入适当体积的双蒸(7)水溶解并调节pH=8.0，定容至100ml。
[0021](8)去蛋白液溶液配制:5M盐酸胍，20 mM Tris_HCI，pH6.6，使用前加入乙醇，乙醇浓度为38%。
[0022](9)漂洗液溶液配制:20mM NaCL, 2mM Tris-HCl, ρΗ7.5。
[0023](10)洗脱液溶液配制:10mM Tris-HCl, pH 8.5。
[0024](11)引物 R: 5，-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，；引物 F: 5，- GGTTACCTTGTTACGACTT-3，。
[0025]土壤微生物基因组DNA检测结果见图1，泳道1，2，3，4，5分别表示甘蔗土壤微生物基因组DNA，花生土壤微生物基因组DNA，玉米土壤微生物基因组DNA，化感水稻PI312777土壤微生物基因组DNA，非化感水稻Lemont 土壤微生物基因组DNA。提取得到的微生物基因组DNA条带清晰明显，无杂带。将所获得的土壤微生物DNA进行16sr DNA基因的扩增，结果见图2，泳道1，2，3，4，5分别表示甘蔗土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，花生土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，玉米土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，化感水稻PI312777 土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图，非化感水稻Lemont 土壤微生物基因组16s rDNA扩增结果图。从图中可看出，通过本试剂盒所提出的DNA无需经过进一步纯化便能直接进行16s rDNA扩增。
[0026]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【权利要求】
1.一种三十分钟内快速提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括: (1)Buffer A 溶液的配置:ρΗ=5_6、0.5-2M Tris-HCl ；
(2)Buffer B 溶液的配置:0.1-0.3M Al2(SO4)3 ； (3)Buffer C 溶液的配置:3_5M NaOH ；
(4)Buffer D 溶液的配置:ρΗ=7_9、0.1-0.2Μ Tris-HCl ； (5)Buffer E 溶液的配置:300-350 μ IUOwt.%SDS ； (6)BufferF溶液的配置:称取2_3g LiCl，l_2g Tris，3_4g EDTA，加入双蒸水溶解并调节至pH=7.5-8.5，定容至10ml ； (7)去蛋白液溶液配制:4-6M盐酸胍，15-25mM Tris_HCl，pH6.5-7.0，使用前加入乙醇，乙醇浓度为35-40wt.% ； (8)漂洗液溶液配制:15-25mMNaCl, l_3mM Tris-HCl, ρΗ7.0-8.0 ； (9)洗脱液溶液配制:5-15mMTris-HCl, ρΗ8.0-9.0。
2.根据权利要求1所述的一种三十分钟内快速提取土壤微生物基因组DNA的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒包括如下: (1)Buffer A 溶液的配置:ρΗ=5.5、IM Tris-HCl ；
(2)Buffer B 溶液的配置:0.2M Al2(SO4)3 ； (3)Buffer C 溶液的配置:4M NaOH ；
(4)Buffer D 溶液的配置:pH=8、0.1M Tris- Tris-HCl ； (5)Buffer E 溶液的配置:325 μ 1、10%SDS ； (6)BufferF 溶液的配置:称取 2.416g LiCl, 1.211g Tris，3.506g EDTA，加入双蒸水溶解并调节至pH=8.0,定容至10ml ； (7)去蛋白液溶液配制:5M盐酸胍，20mM Tris-HCl，pH6.6，使用前加入乙醇，乙醇浓度为 38wt.% ； (8)漂洗液溶液配制:20mMNaCl，2mM Tris-HCl, ρΗ7.5 ； (9)洗脱液溶液配制:10mMTris-HCl，pH 8.5。
3.—种如权利要求1或2所述的试剂盒提取土壤微生物基因组DNA的方法，其特征在于:所述方法包括土壤样品的前处理，土壤微生物基因组DNA的提取和纯化。
4.根据权利要求3所述的试剂盒提取土壤微生物基因组DNA的方法，其特征在于:具体步骤为: Cl) 土壤样品的前处理:用天平称取0.5g的土壤于2ml的离心管中，加入100 μ IBuffer A, 600 μ I 无菌水，300 μ I Buffer B,涡旋震荡 30s ;加入 100 μ I Buffer C, 300 μ IBuffer D,润旋震荡30s ；8000g离心2min,去上清； (2)土壤微生物基因组DNA的提取和纯化:加入325 μ I Buffer D，0.5g 0.5mm玻璃珠，325 μ I Buffer Ε,325μ I Buffer F，涡旋震荡 lmin，4°C IlOOOg 离心 2min，吸取 750ul 上清至1.5ml离心管，加入750μ I酚:氯仿:异戊醇=25:24:1，涡旋震荡30s，4°C 16000g离心lmin，将上清转移至1.5ml离心管，加入等体积的沉淀剂，将样品加到硅基质膜核酸纯化柱上，12000 g离心30s，弃废液，加入500 μ I去蛋白液，12000 g离心30s，加入500 μ I漂洗液，12000 g离心30s，吹干，加入50μ I洗脱液，于1%琼脂糖凝胶中电泳检测。
【文档编号】C12N15/10GK104178481SQ201410449878
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年9月5日 优先权日:2014年9月5日
【发明者】王清水, 余彦 申请人:福建师范大学