一种利用热榨花生粕制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用热榨花生粕制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，包括以下步骤：花生粕粉碎、脱脂、加入蒸馏水，混合均匀，调节pH值，加入复合植物水解酶ViscozymeL酶解，得到酶解液；调节酶解液pH值，加入复合蛋白酶酶解，灭酶，离心；上清液1加入4倍于其体积的无水乙醇，静置，离心，上清液2真空旋转蒸发浓缩，超滤膜分离浓缩，透过液冷冻干燥得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。以本发明制得的葡萄糖苷酶抑制活性肽产品分子量小于5kDa，纯度大于90%，具有抗氧化、降血糖的功能活性，适合工业化生产。
【专利说明】一种利用热榨花生粕制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，属于食品天然活性产物加工领域。
【背景技术】
[0002]I^J^XArachishypogaea L )又称香果、地果、落花生,为豆科植物花生的种子,是世界上主要的油料资源之一。花生的蛋白质含量为25?36%，花生蛋白含有人体必需的八种氨基酸，精氨酸含量高于其它坚果，生物学效价高于大豆。目前，中国对花生的利用多在食用油脂方面，花生果提取油脂后产生大量的副产物花生柏，每年产量达400万吨，是一种大宗蛋白质资源。花生柏中的蛋白质经蛋白酶水解后可得到活性短肽，具有清除自由基、金属离子螯合、抑制脂质过氧化等抗氧化作用，以及抑制α -葡萄糖苷酶活性和降血糖作用。
[0003]葡萄糖苷酶抑制活性肽是一种淡黄色或乳白色、略带花生香气的粉末状固体，易溶于水。该产品具有较好的清除自由基、抑制α-葡萄糖苷酶活性以及降血糖作用。葡萄糖苷酶抑制活性肽竞争性抑制位于小肠的各种α -葡萄糖苷酶，使淀粉类分解为葡萄糖的速度减慢，从而减缓肠道内葡萄糖的吸收，降低餐后高血糖。α -葡萄糖苷酶抑制活性肽不刺激β细胞分泌胰岛素，但可降低餐后胰岛素水平，说明可增加胰岛素的敏感性。葡萄糖苷酶抑制活性肽可以作为延缓肠道碳水化合物吸收而达到治疗糖尿病的辅助降糖药物；也可添加到饮料、面制品、肉制品中作为天然抗氧化剂，防止脂肪氧化，改善食品品质以及减少合成食品添加剂使用量。
[0004]目前，获得生物活性蛋白肽途径有三种:(1)从天然生物体提取，提取成本高，不能大规模生产。(2)水解蛋白产生，酸法水解蛋白，氨基酸受损严重，水解难控制而较少应用；酶解法可大量生产生物活性肽，水解条件温和，若结合微波、超声辅助酶解法可大大缩短反应时间，降低生物活性肽的生产成本，具有广阔的发展前景。(3)化学合成、酶法合成或重组DNA技术合成，化学合成法成本高、副反应物及残留化合物对人体有害，其发展受到制约；酶法合成反应周期长，产率低不能满足工业生产的需求；重组DNA技术合成法刚刚起步，存在技术不成熟，产物生物活性肽的结构和生物活性不稳定等问题。由此看来，将花生柏中蛋白制备成花生葡萄糖苷酶抑制活性肽的最好方法是蛋白酶酶解法。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于为解决上述技术中存在的技术难题，提供一种利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法。该方法集微波萃取浸提技术与复合植物水解酶和复合蛋白酶分步酶解技术于一体，在复合植物水解酶水解花生柏的细胞壁组分和微波将多糖、蛋白质等细胞内容物充分浸提到溶剂中的基础上，复合蛋白酶的酶切位点很好的与蛋白质大分子结合，肽键被切断，肽链缩短生成大量的小分子蛋白肽。由于在微波中进行酶解反应，使得反应时间大为缩短，酶解效率和蛋白肽得率大大提高；再进行二级超滤处理，蛋白肽的纯度也大为提高，真正实现了温和条件下快速制备花生葡萄糖苷酶抑制活性肽的目的。
[0006]为达到上述目的，本发明所采用的技术方案是:一种利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其步骤包括:
一、花生柏粉碎过150目筛，筛下物加入石油醚脱脂，干燥得到脱脂的花生柏粉，加入蒸懼水，微波加热混合均勻，调节pH值,加入复合植物水解酶Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶在内的复合多糖酶)，微波辅助酶解，得到Viscozyme L酶解液；
二、调节ViscozymeL酶解液pH值,加入复合蛋白酶,微波辅助酶解,灭酶,离心；
三、上清液I加入4倍于其体积的无水乙醇，冰箱中静置过夜，离心，上清液2真空旋转蒸发浓缩，超滤膜分离浓缩，透过液冷冻干燥得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。
[0007]优选地，步骤一所述的花生柏粉碎筛下物与石油醚的质量与体积比为1:8.3-10.2(g/ml)，石油醚沸程为30-60°C，脱脂的条件为51°C恒温水浴振荡器中，以325r/min转速往复式振荡脱脂16h，通风橱中挥发干燥，脱脂的花生柏粉与蒸馏水的质量与体积比为1:9.7-10.7(g/ml)，微波功率800w、加热温度47.5°C、加热时间3.2min条件下混合均匀，pH值调节至4.8-5.8, Viscozyme L加入量为每克花生柏粉17.5-20.5FBG (FBG为ViscozymeL的酶活单位)，微波功率800w、加热温度45.5-52.5°C、加热时间8.5-10.5min条件下酶解。
[0008]优选地,步骤二所述的pH值调节至7.2-8.2,复合蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶Neutral Protease、无花果蛋白酶以2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的复合蛋白酶，加入量为每克花生柏粉5000-7000U (U为复合蛋白酶的酶活单位)，酶解的条件为微波功率800w、加热温度50-60°C、加热时间4.5-12.5min, 100°C灭酶5min，7200r/min 离心 18min。
[0009]优选地，步骤三所述的离心条件为7200r/min离心18min,在水浴加热温度73°C、真空度0.1MPa条件下，以224r/min转速真空旋转蒸发浓缩，Labscale小型切向流超滤系统中以3.45bar压力、25°C、34ml/min进料流速、1kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行一级超滤，再以4.25bar压力、25°C、24ml/min进料流速、5kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行二级超滤分离浓缩，冷冻干燥条件为_55°C、真空度0.1MPa，干燥48h。
[0010]本发明的有益效果是:根据本发明，能够提供分子量小于5kDa，纯度大于90%，具有抗氧化、降血糖功能活性的花生葡萄糖苷酶抑制活性肽产品，适合工业化生产。
【具体实施方式】
[0011]采用福林酚比色法(Lowery法)测定本发明实施例中提取的葡萄糖苷酶抑制活性肽的纯度，HPLC测定本发明实施例中提取的葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布。
[0012]实施例1
花生柏粉碎过150目筛，取筛下物以花生柏粉碎筛下物与石油醚的质量与体积比为1:9.6(g/ml)的比例加入石油醚(沸程30-60°C )，在51 °C恒温水浴振荡器中，以325r/min转速往复式振荡脱脂16h，通风橱中挥发石油醚，得到干燥脱脂的花生柏粉，以脱脂的花生柏粉与蒸馏水的质量与体积比为1:10.1 (g/ml)向花生柏粉中加入蒸馏水，在微波功率800w、加热温度47.5°C、加热时间3.2min条件下，微波加热混合均匀，得到花生柏悬浮液，调节花生柏悬浮液pH值至5.1，加入每克花生柏粉19.6FBG (FBG为复合植物水解酶ViscozymeL的酶活单位)的Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶在内的复合多糖酶)，在微波功率800w、加热温度48.5°C、加热时间8.5min条件下微波辅助酶解，得到Viscozyme L酶解液；调节Viscozyme L酶解液pH值至7.6,加入以碱性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶Neutral Protease:无花果蛋白酶=2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的复合蛋白酶，加入量为每克花生柏粉5758U(U为复合蛋白酶的酶活单位)，在微波功率800w、加热温度53.5°C、加热时间5.8min条件下微波辅助酶解，100°C沸水浴中灭酶5min, 7200r/min离心18min ;上清液I加入4倍于其体积的无水乙醇，冰箱中静置过夜，7200r/min离心18min，上清液2在水浴加热温度73°C、真空度0.1MPa条件下，以224r/min转速真空旋转蒸发浓缩,取浓缩液在Labscale小型切向流超滤系统中以3.45bar压力、25°C、34ml/min进料流速、1kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行一级超滤，取透过液I再以4.25bar压力、25°C、24ml/min进料流速、5kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行二级超滤分离浓缩，取透过液2在_55°C、真空度0.1MPa条件下，冷冻干燥48h得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布范围为3kDa_5kDa分子量段的活性肽占10.48%，3kDa-lkDa分子量段的活性肽占80.57%，分子量在IkDa以下的活性肽占8.95% ;纯度为92.45% ;抗氧化作用包括:体外清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和 ABTS 自由基的 IC5tl 值分别为 0.56mg/mL、0.88mg/mL、0.69mg/mL 和 0.34mg/mL。降血糖功能活性包括:体外对α -葡萄糖苷酶抑制活性的IC5tl值为56.32mg/L，对链脲佐菌素、盐酸肾上腺素和四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用，饲喂花生非淀粉多糖治疗实验后的空腹血糖值比实验前分别降低了 80.35%,85.12%和87.29%。
[0013]实施例2
花生柏粉碎过150目筛，取筛下物以花生柏粉碎筛下物与石油醚的质量与体积比为1:8.8(g/ml)的比例加入石油醚(沸程30-60°C )，在51 °C恒温水浴振荡器中，以325r/min转速往复式振荡脱脂16h，通风橱中挥发石油醚，得到干燥脱脂的花生柏粉，以脱脂的花生柏粉与蒸馏水的质量与体积比为1:10.7 (g/ml)向花生柏粉中加入蒸馏水，在微波功率800w、加热温度47.5°C、加热时间3.2min条件下，微波加热混合均匀，得到花生柏悬浮液，调节花生柏悬浮液PH值至5.4，加入每克花生柏粉20.5FBG (FBG为复合植物水解酶Viscozyme L的酶活单位)的Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶在内的复合多糖酶)，在微波功率800w、加热温度50.6°C、加热时间10.2min条件下微波辅助酶解，得到Viscozyme L酶解液；调节Viscozyme L酶解液pH值至8.0,加入以碱性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶Neutral Protease:无花果蛋白酶=2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的复合蛋白酶，加入量为每克花生柏粉6391U(U为复合蛋白酶的酶活单位)，在微波功率800w、加热温度58.2°C、加热时间10.6min条件下微波辅助酶解，100°C沸水浴中灭酶5min, 7200r/min离心18min ;上清液I加入4倍于其体积的无水乙醇，冰箱中静置过夜，7200r/min离心18min，上清液2在水浴加热温度73°C、真空度0.1MPa条件下，以224r/min转速真空旋转蒸发浓缩,取浓缩液在Labscale小型切向流超滤系统中以
3.45bar压力、25°C、34ml/min进料流速、1kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行一级超滤，取透过液I再以4.25bar压力、25°C、24ml/min进料流速、5kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行二级超滤分离浓缩，取透过液2在_55°C、真空度0.1MPa条件下，冷冻干燥48h得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布范围为3kDa_5kDa分子量段的活性肽占8.37%，3kDa-lkDa分子量段的活性肽占81.04%,分子量在IkDa以下的活性肽占10.59% ;纯度为94.08% ;抗氧化作用包括:体外清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基和 ABTS 自由基的 IC5。值分别为 0.75mg/mL、0.92mg/mL、0.71mg/mL 和 0.52mg/mL。降血糖功能活性包括:体外对α -葡萄糖苷酶抑制活性的IC5tl值为58.98mg/L，对链脲佐菌素、盐酸肾上腺素和四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用，饲喂花生非淀粉多糖治疗实验后的空腹血糖值比实验前分别降低了 78.68%,83.42%和85.33%。
[0014]实施例3
花生柏粉碎过150目筛，取筛下物以花生柏粉碎筛下物与石油醚的质量与体积比为1:10.2 (g/ml)的比例加入石油醚(沸程30-60°C)，在51°C恒温水浴振荡器中，以325"min转速往复式振荡脱脂16h，通风橱中挥发石油醚，得到干燥脱脂的花生柏粉，以脱脂的花生柏粉与蒸馏水的质量与体积比为1:9.7 (g/ml)向花生柏粉中加入蒸馏水，在微波功率800w、加热温度47.5°C、加热时间3.2min条件下，微波加热混合均匀，得到花生柏悬浮液，调节花生柏悬浮液pH值至5.8，加入每克花生柏粉18.2FBG (FBG为复合植物水解酶Viscozyme L的酶活单位)的Viscozyme L (其中包括阿拉伯聚糖酶、纤维素酶、β _葡聚糖酶、半纤维素酶和木聚糖酶在内的复合多糖酶)，在微波功率800w、加热温度52.5°C、加热时间9.4min条件下微波辅助酶解,得到Viscozyme L酶解液JMfViscozyme L酶解液pH值至7.2,加入以碱性蛋白酶Alcalase:木瓜蛋白酶:中性蛋白酶Neutral Protease:无花果蛋白酶=2.1:1.8:2.5:2.6比例混合的复合蛋白酶，加入量为每克花生柏粉6805U (U为复合蛋白酶的酶活单位)，在微波功率800w、加热温度55.6°C、加热时间12.3min条件下微波辅助酶解，100°c沸水浴中灭酶5min, 7200r/min离心18min ;上清液I加入4倍于其体积的无水乙醇，冰箱中静置过夜，7200r/min离心18min，上清液2在水浴加热温度73°C、真空度0.1MPa条件下，以224r/min转速真空旋转蒸发浓缩,取浓缩液在Labscale小型切向流超滤系统中以3.45bar压力、25°C、34ml/min进料流速、1kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行一级超滤，取透过液I再以4.25bar压力、25 °C、24ml/min进料流速、5kDa的Pe11 icon XL超滤膜管匣进行二级超滤分离浓缩，取透过液2在_55°C、真空度0.1MPa条件下，冷冻干燥48h得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。葡萄糖苷酶抑制活性肽的分子量分布范围为3kDa_5kDa分子量段的活性肽占11.12%, 3kDa_lkDa分子量段的活性肽占79.88%,分子量在IkDa以下的活性肽占9.00% ;纯度为93.97% ;抗氧化作用包括:体外清除羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH 自由基和 ABTS 自由基的 IC50 值分别为 0.36mg/mL、0.52mg/mL、0.41mg/mL 和 0.19mg/mL。降血糖功能活性包括:体外对α -葡萄糖苷酶抑制活性的IC5tl值为52.55mg/L，对链脲佐菌素、盐酸肾上腺素和四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠的降血糖作用，饲喂花生非淀粉多糖治疗实验后的空腹血糖值比实验前分别降低了 86.87%,88.89%和90.61%。
[0015]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，包括以下步骤: (1)花生柏粉碎过150目筛，筛下物加入石油醚脱脂，干燥得到脱脂的花生柏粉，加入蒸懼水，微波加热混合均勻，调节pH值,加入复合植物水解酶Viscozyme L,微波辅助酶解，得到Viscozyme L酶解液； (2)调节ViscozymeL酶解液pH值,加入复合蛋白酶,微波辅助酶解,灭酶,离心； (3)上清液I加入4倍于其体积的无水乙醇，冰箱中静置过夜，离心，上清液2真空旋转蒸发浓缩，超滤膜分离浓缩，透过液冷冻干燥得到葡萄糖苷酶抑制活性肽。
2.根据权利要求1所述的利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其特征在于:步骤(I)所述的花生柏粉碎筛下物与石油醚的质量与体积比为1:8.3-10.2 (g/ml),石油醚沸程为30-60°C，脱脂的条件为51°C恒温水浴振荡器中，以325r/min转速往复式振荡脱脂16h，通风橱中挥发干燥，脱脂的花生柏粉与蒸馏水的质量与体积比为1:9.7-10.7(g/ml)，微波功率800w、加热温度47.5°C、加热时间3.2min条件下混合均匀，pH值调节至.4.8-5.8, Viscozyme L 加入量为每克花生柏粉 17.5-20.5FBG (FBG 为 Viscozyme L 的酶活单位)，微波功率800w、加热温度45.5-52.5°C、加热时间8.5-10.5min条件下酶解。
3.根据权利要求1所述的利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其特征在于:步骤(2)所述的pH值调节至7.2-8.2,复合蛋白酶为碱性蛋白酶Alcalase、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶Neutral Protease、无花果蛋白酶以2.1: 1.8:2.5:2.6比例混合的复合蛋白酶，加入量为每克花生柏粉5000-7000U (U为复合蛋白酶的酶活单位)，酶解的条件为微波功率800w、加热温度50-60°C、加热时间4.5-12.5min, 100°C灭酶5min，7200r/min离心18min。
4.根据权利要求1所述的利用热榨花生柏制备葡萄糖苷酶抑制活性肽的方法，其特征在于:步骤(3)所述的离心条件为7200r/min离心18min,在水浴加热温度73°C、真空度.0.1MPa条件下，以224r/min转速真空旋转蒸发浓缩，Labscale小型切向流超滤系统中以.3.45bar压力、25°C、34ml/min进料流速、1kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行一级超滤，再以4.25bar压力、25°C、24ml/min进料流速、5kDa的Pellicon XL超滤膜管匣进行二级超滤分离浓缩，冷冻干燥条件为_55°C、真空度0.1MPa，干燥48h。
【文档编号】C12P21/06GK104342475SQ201410547450
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年10月16日 优先权日:2014年10月16日
【发明者】齐宏涛 申请人:青岛博之源生物技术有限公司