红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法
【专利摘要】红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法：⑴.含表皮、真皮结构人工皮肤的构建；将人皮肤成纤维细胞重悬于胶原蛋白溶液滴加至细胞培养孔板培养；细胞完全展开滴加人角质形成细胞悬液至胶原凝胶表面继续培养；凝胶表面人角质形成细胞完全铺满时进行气液面培养；角质层分化至5-8层停止培养；⑵.红色毛癣菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的测定。本发明构建的人工皮肤成为角蛋白酶产生的天然诱导剂；具有以下优点：一、人工皮肤含有真皮层、表皮层及5-8层的角质层，结构和功能更接近人体皮肤；二、表皮层角质形成细胞分泌的角蛋白作为天然底物诱导角蛋白酶的产生；三、由天然底物角蛋白诱导产生的角蛋白酶，其活性测定更准确、更真实、更稳定。
【专利说明】 红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，属于真菌微生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]皮肤癣菌是指能入侵角质层和角质组织，引起人和动物皮肤、毛发和甲感染的真菌。目前发现大约有40余种皮肤癣菌，其中的30余种有致病性。常引起感染的皮肤癣菌主要有红色毛癣菌，须癣毛癣菌，犬小孢子菌，石膏小孢子菌和絮状表皮癣菌。红色毛癣菌是引起皮肤癣菌病最常见的致病菌，据统计可导致皮肤癣菌病90%的慢性难治性感染。
[0003]与其他感染性疾病相同，皮肤癣菌病的发病是真菌毒力因子与宿主屏障结构和免疫系统相互作用的结果。通常认为与角蛋白降解有关的酶是皮肤癣菌病致病菌的重要毒力因子。
[0004]但是，角蛋白酶的产生需要底物的诱导，现有研究及相关的技术体系需要采用特殊培养基，如沙堡培养基、蛋白胨培养基、含皮屑培养基、含甲培养基等诱导角蛋白酶的产生。临床上红色毛癣菌感染人体时并不存在上述诱导物，以诱导产生的方式研究红色毛癣菌重要的毒力因子角蛋白酶致病机理可能存在严重偏差。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于提供一种红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法。该方法是为了模拟人体皮肤的组织结构与基本功能且反映红色毛廯菌临床上粘附、感染并致病的大体过程，从而构建了含表皮、真皮结构的人工皮肤，该人工皮肤含有分化良好的角质层，成为角蛋白酶产生的天然诱导剂。为今后揭示红色毛廯菌导致机体发病的机理提供更真实、更准确的方法。
[0006]本发明采用的技术方案如下:
一种红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤:(1).含表皮、真皮结构人工皮肤的构建；⑵.红色毛癣菌的人工感染；⑶.角蛋白酶活性的测定。
[0007]以上所述的红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，具体操作步骤是:
(1).含表皮、真皮结构人工皮肤的构建:
a.无菌操作条件下，将人皮肤成纤维细胞重悬于胶原蛋白溶液，滴加至细胞培养孔板，放置于细胞培养箱培养；
b.显微镜下观察到细胞完全展开，滴加人角质形成细胞悬液至胶原凝胶表面，继续置于细胞培养箱培养；
c.显微镜下观察到凝胶表面人角质形成细胞完全铺满时，进行气液面培养；
d.之后每天进行冷冻切片HE染色，当角质层分化至5-8层时，停止培养；即得含表皮、真皮结构的人工皮肤；
⑵.红色毛癣菌的人工感染:将培养的红色毛癣菌重悬于生理盐水，调整为I个麦氏浓度(16个孢子/ml)，滴加5μ I至步骤⑴制备的含表皮、真皮结构的人工皮肤，继续培养48h ；HE染色验证红色毛癣菌是否成功感染人工皮肤；
(3).角蛋白酶活性的测定:收集步骤⑵感染红色毛癣菌的人工皮肤的培养液，以天青角蛋白为底物，按照试剂盒说明书操作测定角蛋白酶的活性。
[0008]为了模拟人体皮肤的组织结构与基本功能且反映红色毛廯菌临床上粘附、感染并致病的大体过程，本发明构建了含表皮、真皮结构的人工皮肤，该人工皮肤含有分化良好的角质层，成为角蛋白酶产生的天然诱导剂。
[0009]本发明的核心创新在于:创造性的引入人体角蛋白作为角蛋白酶的诱导底物，而角蛋白哪里来的呢？是通过我们构建人工皮肤时自然产生的。这一核心创新点，与目前所有研究均不同，以前的研究集中在动物模型或者是用培养基诱导角蛋白酶的产生。
[0010]本发明的核心是模拟一种更准确、更真实模拟红色毛廯菌感染人体皮肤的过程，即用来自人体细胞且与人体皮肤有同样结构的角蛋白作为角蛋白酶的诱导底物。
[0011]本发明具有以下优点:一、人工皮肤含有真皮层、表皮层，特别是5-8层的角质层，在结构和功能上更接近人体皮肤；二、表皮层角质形成细胞分泌的角蛋白作为天然底物诱导角蛋白酶的产生；三、由天然底物角蛋白诱导产生的角蛋白酶，其活性的测定更准确、更真实、更稳定。例如，在实施例中，A595 nm较阴性对照每改变0.01相当于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13 U。
【具体实施方式】
[0012]为进一步说明本发明，结合一下实施例具体阐述。
[0013]实施例1:
无菌操作条件下，将16个人皮肤成纤维细胞重悬于2ml胶原蛋白溶液，滴加至细胞培养6孔板，放置于37°C、5% CO2的细胞培养箱培养。3d后显微镜下观察到细胞完全展开，滴加16个人角质形成细胞悬液至胶原凝胶表面，继续置于细胞培养箱培养。5d后显微镜下观察到凝胶表面人角质形成细胞完全铺满时，进行气液面培养。之后每天进行冷冻切片HE染色，1d后角质层分化至5-8层时，停止培养。即得含表皮、真皮结构的人工皮肤(见图1)。
[0014]实施例2:
将培养的红色毛癣菌重悬于生理盐水，调整为I个麦氏浓度(16个孢子/ml)，滴加5μ I至步骤⑴制备的含表皮、真皮结构的人工皮肤，继续培养48h。HE染色验证红色毛癣菌成功感染人工皮肤(见图2)。
[0015]实施例3:
收集步骤⑵感染红色毛癣菌的人工皮肤的培养液约4ml，4000 rpm 15 min，吸出上清液3 ml转移入2 ml含5 mg的keratin-azure的缓冲液,将其放入30°C 200 rpm摇床孵育。用3ml无菌水代替上清液作为阴性对照。72小时后，将反应上清液置于冰板上，吸取上清液lml，4°C 12000 rpm离心5min。将上清液吸取至96孔板，每孔200 μ 1，重复3孔，用紫外分光光度计测定Α595 nm的OD值，以无菌水含等量keratin-azure的空白液为阴性对照。A595 nm较阴性对照每改变0.01相当于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13U。
【权利要求】
1.一种红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤:α).含表皮、真皮结构人工皮肤的构建；⑵.红色毛癣菌的人工感染；(3).角蛋白酶活性的测定。
2.根据权利要求1所述的红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，其特征在于，具体操作步骤如下: (1).含表皮、真皮结构人工皮肤的构建: a.无菌操作条件下，将人皮肤成纤维细胞重悬于胶原蛋白溶液，滴加至细胞培养孔板，放置于细胞培养箱培养； b.显微镜下观察到细胞完全展开，滴加人角质形成细胞悬液至胶原凝胶表面，继续置于细胞培养箱培养； c.显微镜下观察到凝胶表面人角质形成细胞完全铺满时，进行气液面培养； d.每天进行冷冻切片HE染色，当角质层分化至5-8层时，停止培养；即得含表皮、真皮结构的人工皮肤； (2).红色毛癣菌的人工感染:将培养的红色毛癣菌重悬于生理盐水，调整为I个麦氏浓度，滴加5 μ I至步骤⑴制备的含表皮、真皮结构的人工皮肤，继续培养48h ；HE染色验证红色毛癣菌是否成功感染人工皮肤； (3).角蛋白酶活性的测定:收集步骤⑵感染红色毛癣菌的人工皮肤的培养液，以天青角蛋白为底物，按照试剂盒说明书操作测定角蛋白酶的活性。
3.根据权利要求2所述的红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，其特征在于，各步骤的具体操作方法是: ⑴.含表皮、真皮结构人工皮肤的构建:a.无菌操作条件下，将16个人皮肤成纤维细胞重悬于2ml胶原蛋白溶液，滴加至细胞培养6孔板，放置于37°C、5% CO2的细胞培养箱培养；b.3d后显微镜下观察到细胞完全展开，滴加16个人角质形成细胞悬液至胶原凝胶表面，继续置于细胞培养箱培养；c.5d后显微镜下观察到凝胶表面人角质形成细胞完全铺满时，进行气液面培养；d.之后每天进行冷冻切片HE染色，1d后角质层分化至5-8层时，停止培养；即得含表皮、真皮结构的人工皮肤； ⑵.红色毛癣菌的人工感染:将培养的红色毛癣菌重悬于生理盐水，调整为I个麦氏浓度，滴加5 μ I至步骤⑴制备的含表皮、真皮结构的人工皮肤，继续培养48h ；HE染色验证红色毛癣菌成功感染人工皮肤； (3).角蛋白酶活性的测定:收集步骤⑵感染红色毛癣菌的人工皮肤的培养液约4ml，4000 rpm 15 min,吸出上清液3 ml转移入2 ml含5 mg的keratin-azure的缓冲液,将其放入30°C 200 rpm摇床孵育；用3ml无菌水代替上清液作为阴性对照；72小时后，将反应上清液置于冰板上，吸取上清液lml，4°C 12000 rpm离心5min ;将上清液吸取至96孔板，每孔200μ 1，重复3孔，用紫外分光光度计测定Α595 nm的OD值，以无菌水含等量keratin-azure的空白液为阴性对照；A595 nm较阴性对照每改变0.01相当于IU角蛋白酶活性，得到角蛋白酶活性9.85±0.13 U。
4.根据权利要求2或3所述的红色毛癣菌角蛋白酶活性的测定方法，其特征在于，步骤⑴的子步骤a中，是将滴加有人皮肤成纤维细胞的细胞培养孔板，放置于细胞培养箱培养。
【文档编号】C12Q1/02GK104357542SQ201410657738
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月17日 优先权日:2014年8月6日
【发明者】刘维达, 马鹏程, 曹玉萍, 沈永年 申请人:中国医学科学院皮肤病研究所