一种高产阿维菌素b组分的突变菌株及其筛选方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产阿维菌素B组分的突变菌株，其分类命名为除虫链霉菌（ Streptomyces avermitilis ），该菌株已于2014年11月06号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9950。本发明还公开了一种高产阿维菌素B组分突变菌株的筛选方法。本发明还公开了一种阿维菌素B组分的生产方法。本发明要解决的技术问题在于提供一种简单、高效、安全的阿维菌素B组分高产菌诱变方法，本发明还获得了阿维菌素B组分的菌株，高产阿维菌素菌株正突变率达到40%以上，阿维菌素B 组分发酵产量达到8000μg/ml以上。
CGMCC No.9950
20141106
【专利说明】一种高产阿维菌素 B组分的突变菌株及其筛选方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程和酶工程【技术领域】，具体涉及了一种高产阿维菌素 B组分的 突变菌株及其筛选方法。
【背景技术】
[0002] 阿维菌素（Avermectins)是由阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)产生的 一组结构相似的十六元大环内酯齐敦果糖双糖衍生物，1975年由日本北里研宄所从日本静 冈县的一个土壤样品中分离得到。阿维菌素具有广谱、高效抗各种线虫和人类寄生虫的活 性。阿维菌素杀虫和抗寄生虫机制较为独特，与其它抗寄生虫药物无交叉耐药性、毒性低、 无残留等优点，因此阿维菌素是至今发现最有效的杀虫剂（包括杀螨虫）之一。阿维菌素 有八种组分（A组分4种和B组分4种）：即A la，Alb，A2a，A2b，Bla，B lb，B2a，B2b，通常只有氏具 有药效，并以Bla活性最高。作为比较成熟的生物农药产品，在过去的几十年内，国内外研宄 主要集中在阿维菌素生产菌株的菌种改造、诱变筛选以及发酵工艺优化等方面。这些研宄 对提高阿维菌素的发酵单位起到了重要的推动作用，使得阿维菌素的发酵效价从3000 μ g/ ml提到6000 μ g/ml，其中最为重要的要属菌种诱变筛选或选育。然而阿维菌素生产菌属于 链霉菌，该菌株的产孢子丰富程度及质量直接影响阿维菌素的发酵生产，而且该菌株自然 退化也十分明显，因此要不断的进行菌株诱变筛选，才能保持阿维菌素的正常生产水平。在 微生物育种工作中，诱变育种以其操作简便诱变手段多样，且收效明显而成为实验室及生 产上最为常用的目的菌株选育方式，特别是对遗传背景不很清楚的对象，诱变育种更是育 种方法的首选。
[0003] 目前，国内外常用的诱变方法有物理诱变方法、化学诱变方法及生物诱变方法。化 学诱变剂（如一些烷化剂EMS、NTG等）大多是致癌剂或剧毒药品，使用时须十分谨慎，生物 诱变则需要极其精密的操作，并且整个实验过程较长，所以物理诱变成为一种较好的选择。 ARTP (Atmospheric and Room Temperature Plasma)即常压室温等离子体诱变是近几年发 展起来的一种等离子体物理诱变方法。ARTP能够在大气压下产生温度在25-40摄氏度之间 的、具有高活性粒子浓度的等离子体射流，这些等离子体产生具有活性的离子，能破坏细胞 结构导致DNA等遗传物质的分子结构发生改变，从而可能导致菌株致死。细菌拥有众多的 修复系统以修复诱变带来的损伤，DNA损伤后是否致死取决于DNA损伤程度和DNA修复系 统的修复能力。只有少数经过ARTP照射过的微生物会通过本身的自动修复系统对DNA进 行修复并且存活下来，在这个过程中微生物发生了基因突变，因此，ARTP能够实现微生物菌 种的快速诱变，有效提高菌株的正突变率和产量。同样，微波诱变也是一种物理诱变方法， 其作为一种辐射诱变剂具有显著的成效，已经形成微波诱变微生物技术。微波诱变与其他 诱变方式相比微波诱变具有操作简单、安全、变异率高、辐射损伤轻等优点。微波诱变作为 一种比较新兴的非电离电磁辐射物理诱变育种技术，与紫外诱变、化学诱变等经典的人工 诱变育种技术相比，对微生物进行诱变育种的相关实验技术方法尚不十分成熟。本发明采 用ARTP与微波复合交替诱变，具有操作安全、过程简单、设备投资少及效果显著等优点，并 首次在阿维链霉菌种采用ARTP与微波复合交替诱变，创新性好、应用性和可操作性强，对 提高阿维菌素育种正突变率和发酵产量意义重大。
[0004] 国内外诱变选育高产阿维菌素菌株的报道主要集中在物理诱变、化学诱变及生物 诱变三种方法上，在诱变菌株处理方法单一，实验结果重复性差，导致目前报道产量很高， 但重复后却大打折扣。相对而言，利用ARTP诱变筛选阿维菌素菌种的报道文献较少，报道 JAL ：L. -Y. Wang et al. Novel mutation breeding method for Streptomyces avermitilis using an atmospheric pressure glow discharge Plasma， Journal of Applied Microbiology，2009,在功率为120W，间距2mm，处理时间为3分钟，阿维链霉菌孢子致死率 为98. 2%，正突变率为21 %，阿维菌素产量提高30%。该文献仅仅单独利用ARTP对阿维链 霉菌进行育种，手段单一，实验难以重复；其次没有做菌株稳定性试验，突变株发生退化的 可能性很大。在已公布的中国专利中，有关阿维菌素诱变筛选的专利有3篇，分别是：一种 阿维菌素产生菌及其制备方法（201110003059. 2石家庄市兴柏生物工程有限公司）、一种 阿维菌素 Bla高产菌株及其应用（201210113850. 3南京工业大学）、阿维菌素高产高分泌率 生产菌种及AVM提取新方法（200410009639. 2武汉绿世纪生物工程有限责任公司、武汉天 惠生物工程有限公司）。这几篇专利中均涉及到氯化锂、紫外线及亚硝基胍等参与的复合诱 变。亚硝基胍（NTG)有"超级诱变剂"之称，但同时也是致癌剂或剧毒药品，操作起来危险 度高，较大限制了其用途。此外，在报道的几篇专利中，其菌株的正突变率均未见，所获得阿 维菌素突变株的产量也不高。
【发明内容】
[0005] 发明目的：本发明的第一个目的是提供了一种高产阿维菌素 B组分的突变菌株。 本发明的第二个目的是提供了一种高产阿维菌素 B组分突变菌株的筛选方法。本发明的第 三个目的是提供了一种阿维菌素 B组分的生产方法。
[0006] 技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种高产阿维 菌素 B组分的突变菌株，其分类命名为除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis)，该菌株 已于2014年11月06号保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号 为CGMCC No. 9950,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研宄所，邮 编：100101。该保藏的菌株是本发明通过ARTP诱变--ARTP诱变--微波诱变--微波 诱变交替进行筛选得到的发酵产量最高的一株菌株。即本发明实施例3中的AVE-Il正突 变菌株。
[0007] 上述高产阿维菌素 B组分的突变菌株是通过ARTP诱变和微波物理诱变为主要手 段，两种方法交替使用获得。
[0008] 一种高产阿维菌素 B组分突变菌株的筛选方法，包括以下步骤：
[0009] 1)将阿维链霉菌孢子悬液进行ARTP诱变筛选或微波诱变筛选，对诱变处理的孢 子悬液进行涂布平板培养，发酵验证，获得产量提升的ARTP突变株或微波突变株；
[0010] 2)将获得的ARTP突变株或微波突变株再进行进一步的微波诱变筛选或ARTP诱变 筛选，对微波诱变处理或ARTP诱变处理的的孢子悬液进行涂布平板培养，发酵验证，获得 产量进一步提升的ARTP-微波突变株、ARTP-ARTP突变株、微波-微波突变株、或微波-ARTP 突变株；
[0011] 3)重复1?2步骤，最终筛选获得高产的阿维菌素 B组分突变菌株；
[0012] 4)对获得高产的阿维菌素 B组分突变菌株进行发酵验证。
[0013] 其中，上述ARTP诱变筛选步骤具体包含有将阿维链霉菌的孢子悬浮液固定于载 片上，采用ARTP诱变装置系统设置参数进行等离子体照射获得ARTP-微波突变株。
[0014] 其中，上述ARTP诱变装置系统设置参数为电源功率100W，射频功率13W，工作距离 2mm，等离子体的温度28°C，气流量10SLM，照射时间为20?180秒。
[0015] 其中，上述微波诱变的条件为：微波炉功率为700W，脉冲频率为2450MHz，照射时 间分别为20?180秒。
[0016] -种阿维菌素 B组分的生产方法，将高产阿维菌素 B组分的突变菌株进行发酵培 养得到含有阿维菌素 B组分的发酵液，采用HPLC液相色谱方法测定发酵液的效价；发酵培 养方法如下：
[0017] 种子培养基配方：种子培养基（g/L):玉米淀粉30,酵母粉5,黄豆饼粉8， CoCl2O. 3,花生饼粉 10, pH 6. 5 ?7. 5 ;
[0018] 摇瓶种子培养：取阿维链霉菌孢子接种到斜面，28°C培养7?9d，将培养好的斜面 孢子用接种铲刮取约Icm 2的菌苔接入250ml摇瓶，装液量50ml/250ml，摇床转速250r/min， 温度28°C，培养30?40h ;
[0019] 摇瓶发酵培养基（g/L):玉米淀粉140,酵母粉1，豆柏粉30,钼酸钠0. 02， CoCl2O. 02,硫酸锰 0· 002,硫酸铵 0· 5, pH 7. 5 ?8. 0 ;
[0020] 摇瓶发酵培养：将制备好的种子液以5 %接种量接入250ml摇瓶，装液量为 40ml/250ml，摇床转速 250r/min，温度 28°C，培养 240h。
[0021] 具体的实验步骤如下：
[0022] ARTP 诱变：
[0023] (1)孢子悬浮液的制备：挑取阿维链霉菌（编号AVE-110)斜面上的成熟孢子至装 有适量生理盐水的试管中，振荡分散悬浮液，脱脂棉过滤并调整孢子浓度为IO 6-IO7个/ml。 (2)样品载片的制备：在无菌条件下，将上述制备的孢子液，滴加在无菌的载片上，滴加量 为 10 μ L·
[0024] (3)样品载片的风干处理：在无菌条件下，将上述（2)所制备的液体载片置于冷风 (10-20度）下风干。
[0025] (4)设置参数：诱变装置系统采用高纯氦气作为产生等离子体的工作气体，电源 功率100W，射频功率13W，工作距离2mm，等离子体的温度28°C，气流量10SLM。设定一定的 时间对样品进行等离子体照射。在这些确定的条件下，ARTP对样品的作用剂量只取决于作 用时间。
[0026] (5)照射结束后，立即用无菌镊子将样品载片取出，放置于装有适量生理盐水的 2ml EP管中，利用旋涡混合器剧烈振荡lmin，将载片上的样品彻底洗下并悬浮于生理盐水 中。（6)将样品进行梯度稀释后，涂布固体培养基平板。
[0027] (7)平板在28摄氏度培养箱中培养7-9天，平板上菌落个数为10-50个，全部挑取 做发酵验证。
[0028] (8)取发酵产量高于出发菌株（CK)的菌株，计算正突变率。
[0029] (9)将正突变率菌株保存备用。
[0030] (二）、微波诱变：
[0031] (1)孢子悬液的制备取经过上述ARTP诱变的菌种斜面，用无菌生理盐水洗下孢 子，脱脂棉过滤并用无菌生理盐水调整孢子浓度为IO 6-IO7个/ml。
[0032] (2)孢子悬液微波处理：在无菌操作台上吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的 无菌平皿中，每个平皿的悬液量为10mL，调微波炉功率为700W，脉冲频率为2450MHz，按 不同的处理时间（20s，40s，60s)，对孢子悬液进行福照处理，然后分别从每个平皿中取出 0. ImL的菌悬液，进行适当稀释，得到不同稀释度的菌悬液。
[0033] (3)吸取上述稀释后的菌悬液0. 3mL，适当稀释后涂布培养基平板，然后置于28°C 恒温箱培养7-9天，活菌计数，计算致死率和正突变率。
[0034] (4)挑取平板上所有菌落，进行摇瓶发酵复筛。
[0035] (三）、ARTP诱变、微波诱变轮流操作：
[0036] 重复上述（一）、（二），或者（二）、（一），可顺序颠倒进行诱变筛选操作。
[0037] 有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明要解决的技术问题在于提 供一种简单、高效、安全的阿维菌素 B组分高产菌诱变方法，本发明还获得了阿维菌素 B 组分的菌株，高产阿维菌素菌株正突变率达到40%以上，阿维菌素 B组分发酵产量达到 8000 yg/ml 以上。
【专利附图】
【附图说明】
[0038] 图1阿维菌素 Bla液相标准图谱；
[0039] 图2实施例1突变株B组分发酵效价HPLC测定结果；图中第一个峰为溶剂峰。
【具体实施方式】
[0040] 下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于 本发明的保护范围。
[0041] 实验材料：阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis)由浙江升华拜克生物股份 有限公司提供。其他实验试剂购买于生物试剂公司，由常熟理工学院提供。
[0042] 实施例1 :
[0043] ARTP诱变和微波诱变轮流2次，阿维链霉菌诱变结果：
[0044] 具体实施如下：
[0045] 首先进行ARTP诱变，具体步骤和技术参数如下：
[0046] (1)挑取阿维链霉菌出发菌株（编号AVE-110)斜面上的成熟孢子至装有适量生理 盐水的试管中，振荡分散悬浮液，脱脂棉过滤并调整孢子浓度为IO 6-IO7个/ml。
[0047] (2)样品载片的制备：在无菌条件下，将上述制备的孢子液，滴加在无菌的载片 上，滴加量为10 μ 1。
[0048] (3)样品载片的风干处理：在无菌条件下，将上述步骤⑵所制备的液体载片置于 冷风（10-20度）下风干。
[0049] (4)设置参数：电源功率100W，射频功率13W，工作距离2mm，等离子体的温度 28°C，气流量10SLM。设1分钟时间对样品进行等离子体照射。
[0050] (5)照射结束后，用无菌镊子将样品载片取出，放置于装有适量生理盐水的2ml EP 管中，利用旋涡混合器剧烈振荡lmin，将载片上的样品彻底洗下并悬浮于生理盐水中。
[0051] (6)将样品进行梯度稀释后，涂布固体培养基平板。
[0052] (7)平板在28摄氏度培养箱中培养8天，平板上菌落个数为13个，全部挑取初步 进行发酵效价验证，挑取高效价菌株备用。
[0053] (8)取发酵产量高于出发菌株（CK)的菌株，即为正突变率菌株。
[0054] (9)将正突变率菌株保存备用。
[0055] 以下为微波诱变：
[0056] (10)选ARTP诱变的高效价正突变率菌株在此基础上进行微波诱变，微波诱变条 件为：
[0057] a.取经过上述ARTP诱变的菌种斜面，用无菌生理盐水洗下孢子，脱脂棉过滤并用 无菌生理盐水调整孢子浓度为IO 6-IO7个/ml。
[0058] b.在无菌操作台上吸取制得的孢子悬液，注入底部平整的无菌平皿中，每个平皿 的悬液量为10mL，调微波炉功率为700W，脉冲频率为2450MHz，处理时间20s，对孢子悬液进 行辐照处理，然后分别从每个平皿中取出0. ImL的菌悬液，进行适当稀释，得到不同稀释度 的菌悬液。
[0059] c.吸取上述稀释后的囷悬液0. 2mL，稀释1000彳首后涂布培养基平板，然后置于 28°C恒温箱培养7-9天，活菌计数，计算菌株正突变率。
[0060] d.挑取平板上所有菌落，进行发酵效价验证，挑取高效价正突变菌株保存备用。
[0061 ] 最后再将上述经过ARTP诱变和微波诱变得到的高效价正突变率菌株进行ARTP诱 变、微波诱变分别重复一次，进行发酵效价验证，选取5株效价较高的突变株，为方便，编号 依次为:AVE-1，AVE-2, AVE-3, AVE-4, AVE-5。
[0062] 发酵培养方法如下：
[0063] 种子培养基配方：种子培养基（g/L):玉米淀粉30,酵母粉5,黄豆饼粉8， CoCl2O. 3,花生饼粉 10, pH 6. 5 ?7. 5 ;
[0064] 摇瓶种子培养：取阿维链霉菌孢子接种到斜面，28°C培养7?9d，将培养好的斜面 孢子用接种铲刮取约Icm 2的菌苔接入250ml摇瓶，装液量50ml/250ml，摇床转速250r/min， 温度28°C，培养30?40h ;
[0065] 摇瓶发酵培养基（g/L):玉米淀粉140,酵母粉1，豆柏粉30,钼酸钠0.02， CoCl2O. 02,硫酸锰 0· 002,硫酸铵 0· 5, pH 7. 5 ?8. 0 ;
[0066] 摇瓶发酵培养：将制备好的种子液以5 %接种量接入250ml摇瓶，装液量为 40ml/250ml，摇床转速 250r/min，温度 28°C，培养 240h。
[0067] 采用HPLC液相色谱方法测定发酵液的效价；
[0068] ARTP、微波诱变分别重复一次，适当改变条件按ARTP-微波诱变一ARTP-微波诱 变的顺序得到以下实验结果：
[0069] 实验结果如下：
[0070] 表一：通过ARTP-微波诱变一ARTP-微波诱变顺序的正突变率
[0071]
【权利要求】
1. 一种高产阿维菌素 B组分的突变菌株，其特征在于，其分类命名为除虫链霉菌 (该菌株已于2014年11月06号保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9950。
2. 根据权利要求1所述的一种高产阿维菌素 B组分突变菌株，其特征在于，所述高产阿 维菌素 B组是通过ARTP诱变和微波物理诱变为主要手段，两种方法交替使用获得。
3. 权利要求1或2所述的一种高产阿维菌素 B组分突变菌株的筛选方法，其特征在于， 包括以下步骤： 1) 将阿维链霉菌孢子悬液进行ARTP诱变筛选或微波诱变筛选，对诱变处理的孢子悬 液进行涂布平板培养，发酵验证，获得产量提升的ARTP突变株或微波突变株； 2) 将获得的ARTP突变株或微波突变株再进行进一步的微波诱变筛选或ARTP诱变筛 选，对微波诱变处理或ARTP诱变处理的的孢子悬液进行涂布平板培养，发酵验证，获得产 量进一步提升的ARTP-微波突变株、ARTP-ARTP突变株、微波-微波突变株、或微波-ARTP 突变株； 3) 重复1~2步骤，最终筛选获得高产的阿维菌素 B组分突变菌株； 4) 对获得高产的阿维菌素 B组分突变菌株进行发酵验证。
4. 根据权利要求3所述的一种高产阿维菌素 B组分突变菌株的筛选方法，其特征在于， 所述ARTP诱变筛选步骤具体包含有将阿维链霉菌的孢子悬浮液固定于载片上，采用ARTP 诱变装置系统设置参数进行等离子体照射获得ARTP-微波突变株。
5. 根据权利要求4所述的一种高产阿维菌素 B组分突变菌株的筛选方法，其特征在于， 所述ARTP诱变装置系统设置参数为电源功率100 W，射频功率13 W，工作距离2 mm，等离子 体的温度28°C，气流量10 SLM，照射时间为20~180秒。
6. 根据权利要求3所述的一种高产阿维菌素 B组分突变菌株的筛选方法，其特征在 于，所述微波诱变的条件为：微波炉功率为700W，脉冲频率为2450 MHz，照射时间分别为 20~180 秒。
7. -种阿维菌素 B组分的生产方法，其特征在于，将权利要求1或2的高产阿维菌素 B 组分的突变菌株进行发酵培养得到含有阿维菌素 B组分的发酵液，采用HPLC液相色谱方法 测定发酵液的效价； 发酵培养方法如下：种子培养基配方：种子培养基（g / L):玉米淀粉30,酵母粉5,黄 豆饼粉8, CoCl2 0.3,花生饼粉10, pH 6. 5?7. 5; 摇瓶种子培养：取阿维链霉菌孢子接种到斜面，28°C培养7?9 d，将培养好的斜面孢 子用接种铲刮取约1 cm2的菌苔接入250 ml摇瓶，装液量50 ml / 250 ml，摇床转速250 r / min，温度 28°C，培养 30 ?40 h ; 摇瓶发酵培养基（g / L):玉米淀粉140,酵母粉1，豆柏粉30,钼酸钠0.02, C〇Cl2 0.02。
【文档编号】C12N15/01GK104498400SQ201410752763
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】梁剑光, 陈中兵, 朱益波, 王立梅, 齐斌, 黄海涛 申请人:常熟理工学院