一种发酵生产2-酮基-l-古龙酸的方法
【专利摘要】本发明涉及发酵【技术领域】，公开了一种发酵生产维生素C前体2-酮基-L-古龙酸的方法。本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌混合由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺，缩短发酵周期，降低生产成本。同时Go菌与Kv菌混合培养培养容易、不易染菌，比较稳定，且可以利用原有的发酵罐进行发酵，容易实现工业化。进一步的，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法采用敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv配合混菌发酵，在一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖，提高转化效率。
【专利说明】一种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及发酵【技术领域】，具体涉及一种发酵生产维生素 C的方法，尤其是涉及 一种发酵生产维生素 C前体2-酮基-L-古龙酸的方法及相关发酵菌株。
【背景技术】
[0002] 维生素 C(Vitamin C, VC)，又名L-抗坏血酸（L-ascorbic acid)，是人体必需的营 养物质。维生素 C为抗体及胶原形成，组织修补（包括某些氧化还原作用），苯丙氨酸、酪 氨酸、叶酸的代谢，铁、碳水化合物的利用，脂肪、蛋白质的合成，维持免疫功能，羟化与羟色 胺，保持血管的完整，促进非血红素铁吸收等所必需，维生素 C作为一种抗氧化剂，在人体 的氧化还原代谢反应中起到重要的调节作用。同时维生素 C还具备抗自由基、抑制酪胺酸 酶的形成，从而达到美白，淡斑的功效。
[0003] 目前有多种人工合成维生素 C的方法，如：串联发酵法、利用欧文氏菌一步发酵 法、Reichstein发明的莱氏化学合成法，以及尹光琳二步发酵法。其中尹光琳发明的二步 发酵法是20世纪70年代，由中科院北京微生物所的尹光琳等人利用一种混合微生物发酵 体系，将原有莱氏法中的三步化学反应缩短为一步生物反应，以生物氧化代替化学氧化，既 避免了大量易燃、易爆或有毒化学原料的使用，同时也大大缩短了工艺流程、降低了生产成 本，成为现阶段工业生产维生素 C最主要的工艺。此法首先用一步菌氧化葡萄糖酸杆菌 (Gluconobacter oxydans, Go)将D-山梨醇转化为L-山梨糖；然后用二步混菌将L-山梨 糖高效地转化为维生素 C的前体2-酮基-L-古龙酸（2-Keto-L-Gulonic acid，2-KGA); 最后再用与Reichstein法类似的化学法转化为维生素 C。其中，第二步所用的混菌体系由 两种菌组成，一种是产酸菌-酮古龙酸杆菌（Ketogulonigenium vulgare, Kv),行业内俗称 小菌；另一种是伴生菌，行业内俗称大菌，伴生菌的种类较多，如：錯状芽孢杆菌（Bacillus cereus，Bc)、巨大芽抱杆菌（Bacillus megaterium，Bm)、苏芸金芽抱杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt)等。
[0004] 虽然现有维生素 C的生产体系已经很成熟，但是因其两步发酵而必然导致能耗 大，总发酵周期较长，即生产成本较高。然而随着维生素 C市场竞争日趋激烈，如何降低生 产成本，提高维生素 C的收率，是企业能否在激烈的竞争中抢占有利制高点的关键，故此对 现有发酵工艺的优化已成为研究热点。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于针对现有技术两步发酵生产维生素 C前体2-酮 基-L-古龙酸发酵周期长、能耗大、生产成本高的缺陷，提供一种发酵周期短的发酵生产 2-酮基-L-古龙酸的方法。采用本发明所述方法发酵生产维生素 C前体2-酮基-L-古龙 酸，发酵周期短，能耗小，生产成本低。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] -种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)与酮古龙酸杆菌（Ketogulonigenium vulgare)混合，以山梨醇作为碳源，发酵制 备2-酮基-L-古龙酸。
[0008] 在一些实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例为 10:1-1:10。
[0009] 在一些实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌中山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因 被敲除。
[0010] 在一些实施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因 序号为 B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、B932_2846、 B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026 的基因中的一种或 几种。
[0011] 在一些实施方案中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank中基因 序号为B932_1330的基因。
[0012] 在一些实施方案中，所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法中，所述发酵的 具体方法为：发酵罐按装料系数60% -80%装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为 4 %，3h后开始流加剩余4 % ;在培养温度25 °C -33 °C、搅拌速度400rpm-600rpm、通气量 I. Ovvm-L 5vvm 条件下发酵 20h_50h。
[0013] 在一些优选实施方案中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60%装发酵 培养基；以山梨醇计初始投入料为4%，3h后开始流加剩余4%;在培养温度30°C、搅拌速度 500rpm、通气量I. 5vvm条件下发酵28h。
[0014] 本发明还提供了一种敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆 菌。
[0015] 在一些实施方案中，所述的氧化葡萄糖酸杆菌中所述山梨糖/山梨醇旁路代谢 相关基因为 Gene Bank 中基因序号为 B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、 B932_3022、B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、 B932_3025、B932_3026的基因中的一种或几种。
[0016] 在一些实施方案中，所述的氧化葡萄糖酸杆菌中所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相 关基因为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因。
[0017] 本发明还提供了所述敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆 菌在发酵生产2-酮基-L-古龙酸中的用途。
[0018] 与现有技术相比，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌 混合由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺，缩短发酵周期，降低生 产成本。同时Go菌与Kv菌混合培养培养容易、不易染菌，比较稳定，且可以利用原有的发 酵罐进行发酵，容易实现工业化。进一步的，本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方 法采用敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌与Kv配合混菌发酵，在 一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖，提高转化效率。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现 有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0020] 图1示实施例4NSR单基因缺失菌株验证结果电泳图，其中泳道M为 DM2000Marker ;泳道NSR为NSR单基因缺失株中的庆大霉素基因片段；泳道Go为对照组；
[0021] 图2示实施例5单菌摇瓶发酵培养结果图，其中图（A)为以2%山梨醇为碳源的 结果图，图（B)为以2%山梨糖为碳源的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为含量， 一为NSR单基因缺失菌株培养基中山梨糖含量，+为HGO菌株培养基中山梨糖含量， 为NSR单基因缺失菌株培养基中山梨醇含量，为HGO菌株培养基中山梨醇含量；
[0022] 图3示实施例5混菌摇瓶发酵培养产酸图，其中图（A)为以2%山梨醇为碳源的 结果图，图（B)为以2%山梨糖为碳源的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为2-酮 基-L-古龙酸产量，-·-为NSR单基因缺失菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量，+为 HGO菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量；
[0023] 图4示实施例6单菌发酵罐发酵培养结果图，其中图（A)为以8%山梨醇为碳源的 结果图，图（B)为以8%山梨糖为碳源的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为山梨 糖含量，-一:为NSR单基因缺失菌株培养基中山梨糖含量，-为HGO菌株培养基中山梨糖 含量；
[0024] 图5示实施例6在不同NSR/HG0与Kv混合的比例下发酵罐发酵培养2-酮基-L-古 龙酸产量结果图，其中图（A)为NSR/HG0与Kv混合比例为5:1的结果图，图（B)为NSR/HG0 与Kv混合比例为1:4的结果图，各图中横坐标为发酵时间，纵坐标为2-酮基-L-古龙酸产 量， 为NSR单基因缺失菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量，+为HGO菌株培养基 中2-酮基-L-古龙酸产量；
[0025] 图6示实施例7NSR/HG0与Kv混合的比例为5:1，发酵的搅拌速度500rpm发酵28h 条件下发酵罐发酵培养2-酮基-L-古龙酸产量结果图，其中图中横坐标为发酵时间，纵坐 标为2-酮基-L-古龙酸产量，为NSR单基因缺失菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产 量，为HGO菌株培养基中2-酮基-L-古龙酸产量。
【具体实施方式】
[0026] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0027] 本发明提供了一种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌（Go) 与酮古龙酸杆菌（Kv)混合，以山梨醇作为碳源，发酵制备2-酮基-L-古龙酸。
[0028] 本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法将Go菌与Kv菌混合，以山梨醇作 为碳源，混菌发酵培养，实现由D-山梨醇到2-酮基-L-古龙酸的一步转化，简化生产工艺， 缩短发酵时间，从而降低生产成本。
[0029] 其中，在一些实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比 例为 10:1-1:10。
[0030] 在一些优选实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比例 为 5:1_1:4。
[0031] 进一步的，在一些具体实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌 的混合比例为5:1。
[0032] 在一些实施方案中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60% -80%装发 酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4%，311后开始流加剩余4(% ;在培养温度251：-331：、 揽拌速度400rpm-600rpm、通气量I. Ovvm-1. 5vvm条件下发酵20h_50h。
[0033] 在一些具体实施例中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60%装发酵培 养基；以山梨醇计初始投入料为4%，3h后开始流加剩余4% ;在培养温度30°C、搅拌速度 450rpm、通气量I. 5vvm条件下发酵48h。
[0034] 在另一些具体实施例中，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60%装发酵 培养基；以山梨醇计初始投入料为4%，3h后开始流加剩余4%;在培养温度30°C、搅拌速度 500rpm、通气量I. 5vvm条件下发酵28h。
[0035] 在本发明的一些实施例中，所述发酵培养基具体为D-山梨醇8. 0 %，玉米浆 1. 〇%，尿素 1. 2%，KH2PO4O. 1%，MgSO4 · 7H20 0· 02%，CaCO3O. 1%，余量为水。
[0036] 当体系中同时存在山梨醇和山梨糖时，Go菌优先利用山梨醇作为碳源，而当山梨 糖被耗尽后，Go菌则开始消耗山梨糖。本发明所述发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法采 用Go菌与Kv菌配合一步混菌发酵，Go菌对山梨糖的代谢会竞争性的与Kv菌争夺底物山 梨糖，从而降低转化效率。
[0037] 因此进一步的，在一些优选实施方案中，所述氧化葡萄糖酸杆菌中山梨糖/山梨 醇旁路代谢相关基因被敲除。Go菌中山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因被敲除可以更好的 配合Kv混菌发酵，一定程度上避免Go菌与Kv菌竞争性的争夺底物山梨糖。
[0038] 其中，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因如表1所示。
[0039] 表1山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因表
[0040]
【权利要求】
1. 一种发酵生产2-酮基-L-古龙酸的方法，将氧化葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter oxydans)与酮古龙酸杆菌（Ketogulonigenium vulgare)混合，以山梨醇作为碳源，发酵制 备2-酮基-L-古龙酸。
2. 根据权利要求1所述的方法，所述氧化葡萄糖酸杆菌与所述酮古龙酸杆菌的混合比 例为 10:1-1:10。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，所述氧化葡萄糖酸杆菌中山梨糖/山梨醇旁路代 谢相关基因被敲除。
4. 根据权利要求3所述的方法，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank 中基因序号为 B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、B932_1062、 B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、B932_3026 的基因 中的一种或几种。
5. 根据权利要求3所述的方法，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因为Gene Bank 中基因序号为B932_1330的基因。
6. 根据权利要求1-5任意一项所述的方法，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系 数60 % -80 %装发酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4 %，3h后开始流加剩余4 % ;在培 养温度25°C _33°C、搅拌速度400rpm-600rpm、通气量1. Ovvm-1. 5vvm条件下发酵20h_50h。
7. 根据权利要求6所述的方法，所述发酵的具体方法为：发酵罐按装料系数60%装发 酵培养基；以山梨醇计初始投入料为4%，3h后开始流加剩余4%;在培养温度30°C、搅拌速 度500rpm、通气量1. 5vvm条件下发酵28h。
8. -种敲除山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因的氧化葡萄糖酸杆菌。
9. 根据权利要求8所述的氧化葡萄糖酸杆菌，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基 因为 Gene Bank 中基因序号为 B932_0664、B932_1330、B932_1370、B932_1684、B932_3022、 B932_1062、B932_2846、B932_2847、B932_2848、B932_3018、B932_3024、B932_3025、 B932_3026的基因中的一种或几种。
10. 根据权利要求8所述的氧化葡萄糖酸杆菌，所述山梨糖/山梨醇旁路代谢相关基因 为Gene Bank中基因序号为B932_1330的基因。
【文档编号】C12P7/60GK104404121SQ201410752557
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年12月10日 优先权日:2014年12月10日
【发明者】元英进, 王恩旭, 丁明珠 申请人:天津大学