家族性乳腺癌brca1和brca2基因检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本实用新型公开了一种家族性乳腺癌BRCA1和BRCA2基因检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体，包装盒体内的中间设有口腔拭子，口腔拭子的一侧设有样本保存管、含有PCR扩增试剂的试管、含有PCR产物纯化试剂的试管和含DNA测序试剂的试管，另一侧设有含有PCR扩增引物的8联管和含测序引物的8联管。本实用新型将样本采集、BRCA1和BRCA2基因常见易感位点检测检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。
【专利说明】家族性乳腺癌BRCA1和BRCA2基因检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本实用新型提供了一种家族性乳腺癌BRCAl和BRCA2基因检测试剂盒，属于分子生物学【技术领域】。
【背景技术】
[0002]乳腺癌是我国女性常见的恶性肿瘤，且发生率呈直线上升趋势。5-10%的乳腺癌的发生和遗传易感性相关，其中最常见的易感基因是BRCAl和BRCA2。
[0003]BRCAl基因于1994年获得分离和克隆，是第一个被发现的家族性乳腺癌抑癌基因，定位于17q21，由22个编码外显子和2个非编码外显子构成，mRNA长约7.8kb，编码1863个氨基酸。BRCA2基因于1994年由Wooster等发现，定位于13ql2.3，包含27个外显子，编码3418个氨基酸。BRCAl和BRCA2同为抑癌基因，在DNA损伤修复、细胞周期调节、基因转录激活、染色质稳定等方面发挥重要作用。据乳腺癌信息中心(breast cancer informat1ncore, BIC)报道，BRCAl和BRCA2基因突变已达到3000多种，分布于整个编码区，最常见的致病突变为移码突变、无义突变等。大多数突变导致截短蛋白的形成，使BRCAl和BRCA2蛋白质功能丧失，从而导致肿瘤发生。
[0004]BRCAl和BRCA2基因在不同人种中的突变率不同，具有极大的种族差异。西方及欧洲白种人的家族性乳腺癌人群BRCAl和BRCA2基因总突变率为15%_20%，某些特殊人群存在始祖突变，最显著的是约2.5%的德系犹太人携带BRCAl基因187delAG、5383insC以及BRCA2基因的6174delT突变。日本的Ikeda等报道在113个家族史的乳腺癌中BRCAl和BRCA2基因的突变率分别为13.3%和18.6%，其中21个BRCA2突变携带家庭中有7个是携带同一个5802delAATT的突变。中国台湾南部18例家族性乳腺癌BRCAl、BRCA2全部外显子和剪切点突变的研究显示BRCAl和BRCA2总突变率为27.8%，其中BRCA2突变率为16.7%。中国上海地区家族性乳腺癌人群中也检测出两基因突变率分别为11.4%和2.9%。中国湖南地区50例家族性乳腺癌患者中BRCAl和BRCA2总突变率为20%，发现了 5种致病性突变，其中2种为新发现突变。对来自中国上海、广州、辽宁3个地区219例独立家系的先证者，利用DHPLC联合测序的方法进行BRCAl和BRCA2基因全部外显子突变的检测，共发现23例突变，其中BRCAl I10delAT和BRCAl 5589del8这两个突变在中国人群中可能有部分的始祖突变效应。北京大学肿瘤医院乳腺中心实验室在对一项409例家族性乳腺癌病人的研究中发现，BRCAl和BRCA2基因的突变率为10.5%，但在发病年龄〈40岁的病人中BRCAl和BRCA2基因突变率高达23%，在三阴性乳腺癌病人中BRCAl和BRCA2基因突变率为20.8%。
【发明内容】
[0005]本实用新型的目的是提供一种检测BRCAl和BRCA2基因常见易感位点是否发生突变的试剂盒。
[0006]为实现以上目的，本实用新型提供了一种BRCAl和BRCA2基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体，包装盒体内的中间设有口腔拭子，口腔拭子的一侧设有样本保存管、含有PCR扩增试剂的试管、含有PCR产物纯化试剂的试管和含DNA测序试剂的试管，另一侧设有含有PCR扩增引物的8联管和含测序引物的8联管。试管排列位置固定如图1所
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[0007]本实用新型将样本采集、BRCAl和BRCA2基因常见易感位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便快捷，且成本更低。本实用新型基于直接测序技术，可以对PCR产物直接进行DNA序列分析，明确突变位点，是现有基因突变检测方法中最直接最准确的方法，且可以实现机械化自动化，使测序工作更加简便快捷，结果判读更直观。
【专利附图】
【附图说明】
[0008]图1为本实用新型提供的一种家族性乳腺癌BRCAl和BRCA2基因检测试剂盒结构示意图；
[0009]图2为BRCAl基因第11号外显子实验无突变的结果示意图；
[0010]图3为BRCAl基因存在c.1116G>A突变的结果示意图。
【具体实施方式】
[0011]为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例
[0012]如图1所示，为本实用新型提供的一种家族性乳腺癌BRCAl和BRCA2基因检测试剂盒的结构示意图，包括带盒盖的包装盒体1，包装盒体I内的中间设有口腔拭子2，口腔拭子2的一侧设有样本保存管3、含有PCR扩增试剂的试管4、含有PCR产物纯化试剂的试管6和含DNA测序试剂的试管6，另一侧设有含有PCR扩增引物的八联管7和含测序引物的八联管8。
[0013]测试步骤如下:
[0014]步骤1:采集检测样品
[0015]用口腔拭子2在被测者口腔左右两腮分别各上下刮20次，保证采集到足量的细胞样本，采集完毕，样本保存于样本保存管3中。
[0016]步骤2:采用硅胶吸附法抽提样本的基因组DNA。
[0017]步骤3:PCR扩增
[0018]PCR 扩增试剂 4 (总体积为 Iml)的成分包含:20mM Tris-HCL (PH8.0)U00mM KCL,500uM dNTPs、3mM MgCl2 溶液、0.1U Taq DNA 聚合酶/ul。
[0019]BRCAl基因第11外显子正向和反向引物:
[0020]正向引物:AGCTGAGAGGCATCCAGAAA；
[0021]反向引物:TGAGGGGACGCTCTTGTATT。
[0022]BRCAl基因第24外显子正向和反向引物:
[0023]正向引物:cagagcaagactccgtctca ；
[0024]反向引物:TTGTGCTCATGGCAGATTTC。
[0025]BRCA2基因第10外显子正向和反向引物:
[0026]正向引物:GTCTTTGGCCTGTGAATGGT；
[0027]反向引物:gacagaggtacCTGAATCAGCA。
[0028]BRCA2基因第11外显子正向和反向引物:
[0029]正向引物:ACTGTCAATCCAGACTCTGAAGAA；
[0030]反向引物:CTCTTCTGCAATATGTAGCTTGGT。
[0031]然后在ABI9700型PCR扩增仪上进行，对应八联管7的4个反应孔，每个反应孔内含I对引物，每对正反向引物各0.5ul (引物浓度为lOumol/L)，各加入检测样品2ul，PCR反应液7.5ul，去离子水4.5ul，反应孔总体积15ul。
[0032]反应条件为95°C预热10分钟；再进行35个循环的95°C、45秒，60°C、45秒，72°C、60秒；72°C、7分钟后，降温至4°C。
[0033]步骤4 =PCR产物纯化
[0034]每一个反应孔反应体系总体积为7ul，由PCR产物纯化试剂4ul和PCR产物3ul组成。反应条件为:37°C、60分钟；80°C、15分钟。
[0035]步骤5 =DNA测序反应
[0036]每一个反应孔反应体系总体积为5ul，由PCR纯化产物Iul、DNA测序试剂Iul、测序引物Iul和去离子水2ul组成。反应条件为:96°C 2分钟；25个循环的96°C、10秒；50°C、5 秒；60°C、4 分钟；60°C、4 分钟。
[0037]反应结束后每管加入Iul 125mM乙二胺四乙酸EDTA和无水乙醇15ul，室温沉淀15分钟；3650转/分，4°C离心30分钟，轻轻倒去上清液；每孔加30ul 70%乙醇，3650转/分，4°C离心15分钟，倒去上清液；室温放置20分钟后加入HIDI溶液8ul，上测序仪。
[0038]步骤4:结果分析
[0039]在测序仪上进行结果读取，用软件Chromas查阅测序检测结果。
[0040]1.未检出突变:未发现BRCAl和BRCA2基因存在突变；
[0041]2.检出突变:发现BRCAl或BRCA2基因存在突变。
【权利要求】
1.家族性乳腺癌BRCAl和BRCA2基因检测试剂盒，其特征在于，包括包装盒体(I )，包装盒体(I)内的中间设有口腔拭子(2)，口腔拭子(2)的一侧设有样本保存管(3)、含有PCR扩增试剂的试管(4 )、含有PCR产物纯化试剂的试管(5 )和含DNA测序试剂的试管(6 )，另一侧设有含有PCR扩增引物的八联管(7)和含测序引物的八联管(8)。
【文档编号】C12M1/00GK204097454SQ201420522419
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年9月12日 优先权日:2014年9月12日
【发明者】张奕, 傅咏南, 毛丹丹 申请人:上海中优医药高科技有限公司