一种食源性富硒抗氧化肽及其制备方法与流程

本发明属于农产品加工技术领域，具体地说，涉及一种食源性富硒抗氧化肽及其制备方法。

背景技术：

生命的存在依赖于氧，机体内的氧化代谢是细胞存活所必需的。与此同时，机体内氧化代谢会产生大量的自由基和其他活性氧，它们在体内的过量积累能破坏DNA、蛋白质、脂肪酸等生物大分子，导致其结构和功能的氧化损伤，并引发癌症、心血管疾病等一系列疾病。清除机体内过量的由基和其他活性氧，对于预防疾病的发生，维持机体健康具有十分重要的意义。人工合成的抗氧化剂如丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、叔丁基对苯二酚(TBHQ)和没食子酸丙酯(PG)虽然具有较强的抗氧化作用，但是它们在体内存在潜在风险，它们在食品、医药等领域中的应用受到了严格的限制。因此，探索天然来源特别是食源性抗氧化剂的制备方法和技术显得尤为重要。

硒是人体必需的微量元素，具有多种生物学功能，如抗氧化作用、增强机体免疫力、防止心脑血管疾病、预防糖尿病、解毒排毒、保护肝脏等。其中，抗氧化作用是硒及其化合物最为重要的功能。硒的抗氧化作用主要通过含硒酶实现的。硒在人体内参与谷胱甘肽过氧化物酶、谷胱甘肽磷脂氢过氧化物酶等多种含硒酶的合成。现已证实，硒以硒代半胱氨酸的形式位于谷胱甘肽过氧化物酶的活性中心，调节谷胱甘肽过氧化物酶清除机体内不断产生的过氧化氢和有机氢过氧化物等，催化它们转变为水及相应的醇类物质，从而消除过量的自由基对机体的损伤。因此，谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶、过氧化氢酶一起构成了机体内抗氧化损伤的“第一道防线”。

长期以来，人们对于硒的抗氧化作用研究多集中于含硒酶方面。然而食品中的硒酶具有复杂的一级结构和空间结构，极易受贮藏环境、加工条件等因素的影响而变性，甚至失活；即使以完整的形式被人体摄入，也容易受胃/肠消化体系内蛋白酶的分解而导致活性降低，甚至丧失。与含硒酶相比，小分子硒抗氧化肽由于分子量小、结构简单，稳定性好，并且食源性的富硒抗氧化肽具有安全、活性高、分子量低、易于吸收、无有害的免疫反应等优点。

目前，公开发表的研究成果及专利中，对于富硒抗氧化肽的研究较少，且主要是经人工合成的富硒肽，而食源性、富硒抗氧化肽的研究及相关专利尚未见报道。

由于硒具有突出的生物学功能，以及我国人口硒摄入量普遍较低的现状(据报道，我国约72％的地区属缺硒区，我国成人平均硒摄入量为26μg/d，远低于国际营养协会推荐摄入量55μg/d/人)，不少学者对富硒食品进行了研究。其中，大米作为食用最为广泛的主食之一，是人们膳食结构中硒元素的重要来源，因此富硒大米国内外学者重点研究的内容之一。但是，硒在富硒米中的分布具有不均匀性，主要分布于米糠及外层胚乳中，在碾米过程中，大量硒及其化合物随米糠被碾磨下来。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题是提供了一种食源性富硒抗氧化肽及其制备方法，从硒糙米加工副产物——富硒米糠中提取硒蛋白，采用可控复合酶解技术对硒蛋白进行水解，并通过分离、纯化、活性验证等步骤制备富硒抗氧化肽。本方法具有安全性高、条件温和、工艺简单、产品活性高等优点，所得富硒抗氧化肽在食品特别是功能性食品中的应用，既能发挥活性肽的抗氧化作用，又能提高人们饮食中硒的摄入量，具有多重有益作用。此外，本发明所用富硒米糠为富硒糙米加工副产物，由富硒米糠中制备富硒抗氧化肽可以有效提高资源利用率，增加产品附加值。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种食源性富硒抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

1)富硒米糠粉碎后过筛，加入食品级磷酸缓冲液中，浸提，浸提两次，离心，合并上清液；上清液用稀盐酸调节pH值至4.5，沉淀蛋白，离心，弃上清，沉淀蛋白水洗两次备用；

2)在步骤1)所得沉淀蛋白中，加入水，搅拌、匀浆，然后加入中性蛋白酶酶解，酶解结束后用稀盐酸将酶解液调至中性，然后加入风味蛋白酶酶解，灭酶、离心、收集上清液；

3)将步骤2)所得上清液浓缩至蛋白质浓度为1.0～1.5mg/mL，经DEAE-Sepharose离子交换色谱分离，收集洗脱液，并采用氧自由基吸收能力检测方法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取抗氧化能力高的组分，再次浓缩至蛋白质浓度为1.0～1.5mg/mL，经Sephadex G-25凝胶再次分离、脱盐，收集洗脱液，并采用氧自由基吸收能力检测方法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取抗氧化能力高的组分，经冷冻干燥后即为富硒抗氧化肽。

进一步地，在步骤(1)中，所述的富硒米糠是富硒糙米碾米过程中所得副产物，经粉碎后过60～100目筛制得；所述的食品级磷酸缓冲液的pH为8.0～9.5，是由食品级Na₂HPO₄与K₂HPO₄或NaH₂PO₄与Na₂HPO₄配制得到，浓度为75～100mmol/L。

进一步地，在步骤(1)中，所述的富硒米糠与食品级磷酸缓冲液的料液比(g/mL)为1 4～1 8。

进一步地，浸提条件为：于20～45℃下浸提2～4小时，浸提两次。

进一步地，离心条件为6000转/分离心20min。

进一步地，在步骤2)中，所述的沉淀蛋白与水的质量体积比(g/mL)为1 6～1 12；所述中性蛋白酶与沉淀蛋白质量比为2％～5％；所述加入中性蛋白酶的酶解条件为：温度为45～55℃、pH值为6.5～7.5条件下酶解1.0～1.5小时。

进一步地，在步骤2)中，所述的风味蛋白酶与沉淀蛋白质量比为2％～4％；所述加入风味蛋白酶的酶解条件为：温度为45～55℃、pH值为6.5～7.5条件下酶解1.0～1.5小时。

本发明公开了一种由上述的制备方法制备得到的食源性富硒抗氧化肽。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明利用硒糙米加工副产物——富硒米糠为原料，成本低廉，可显著提高其附加值；

2)经本发明所述方法制备的富硒抗氧化肽，来源于富硒米糠，是天然的、食源性活性肽，不存在化学残留、毒副作用等，易于被人们接受；

3)经本发明所述方法制备的富硒抗氧化肽，既具有抗氧化肽所具备的天然抗氧化活性，又具有硒的生物学功能，两者间存在良好的协同作用，其在食品、特别是功能性食品中应用后，可起到抗氧化与补硒的双重效果；

4)本发明方法中，蛋白质的酶解步骤采用中性蛋白酶和风味蛋白酶的复合酶解，既可以提高酶解效率，又可以显著降低酶解产物中苦味肽的生成；同时，pH值为6.5～7.5时，恰在两种蛋白酶的最适pH范围，不需要额外的缓冲溶液调节pH值，显著减少了缓冲盐的使用，既能降低成本，又能减少后序脱盐步骤；

5)本发明方法中，所使用的Sephadex G-25凝胶过滤色谱是利用分子筛分离物质的一种方法。由于凝胶本身具有三维空间网状结构，样品混合物中的小分子物质可自由渗入凝胶颗粒内部，通过色谱柱时阻力增大、流速变缓，保留时间长；而样品中大分子物质由于受凝胶网孔半径的限制，不能渗入凝胶颗粒内部，即被排阻在凝胶粒子外部，故在凝胶颗粒间隙移动，流动速度快，保留时间短。本发明采用此方法，既能有效分离蛋白质的酶解产物，又能脱除产物中残留的盐离子，改善产物口感，提高产物质量。

当然，实施本发明的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

图1为本发明所述一种食源性富硒抗氧化肽的制备方法的工艺流程图。

图2为DEAE-Sepharose离子交换色谱分离纯化富硒抗氧化肽图谱。

图3为经DEAE-Sepharose离子交换色谱分离出的各组分的抗氧化活性。

图4为Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离纯化富硒抗氧化肽图谱。

图5为经Sephadex G-25凝胶过滤色谱分离出的各组分的抗氧化活性。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

本发明提供一种食源性富硒抗氧化肽的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：

1)富硒米糠粉碎后过60～100目筛，在料液比(g/mL)为1 4～1 8、pH为8.0～9.5的食品级磷酸缓冲液中，于20～45℃下浸提2～4小时，浸提两次，6000转/分离心20min离心，合并上清液；上清液用稀盐酸调节pH值至4.5，沉淀蛋白，离心，弃上清，沉淀蛋白水洗两次备用；

2)在步骤1)所得沉淀蛋白中，加入质量/体积比为1 6～1 12的水，搅拌、匀浆，然后在中性蛋白酶与沉淀蛋白质量比为2％～5％、温度为45～55℃、pH值为6.5～7.5条件下酶解1.0～1.5小时，酶解结束后用稀盐酸将酶解液调至中性，然后在风味蛋白酶与沉淀蛋白质量比为2％～4％、温度为45～55℃、pH值为6.5～7.5条件下酶解1.0～1.5小时，灭酶、离心、收集上清液；

3)将步骤2)所得上清液浓缩至蛋白质浓度为1.0～1.5mg/mL，经DEAE-Sepharose离子交换色谱分离，收集洗脱液，并采用国际公认的氧自由基吸收能力(ORAC)方法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取抗氧化能力最高的组分，再次浓缩至蛋白质浓度为1.0～1.5mg/mL，经Sephadex G-25凝胶再次分离、脱盐，收集洗脱液，并采用ORAC法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取ORAC值高于2000μmoL TE/mg的组分，经冷冻干燥后即得到富硒抗氧化肽。

实施例1

本发明提供一种食源性富硒抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

1)富硒米糠粉碎后过80目筛，在料液比(g/mL)为1 6、pH为8.5的食品级磷酸缓冲液中，于35℃下浸提3小时，浸提两次，6000转/分离心20min离心，合并上清液；上清液用稀盐酸调节pH值至4.5，沉淀蛋白，离心，弃上清，沉淀蛋白水洗两次备用；

2)在步骤1)所得沉淀蛋白中，加入质量/体积比为1 8的水，搅拌、匀浆，然后在中性蛋白酶与沉淀蛋白质量比为4％、温度为50℃、pH值为7.0条件下酶解1.2小时，酶解结束后用稀盐酸将酶解液调至中性，然后在风味蛋白酶与沉淀蛋白质量比为3％、温度为50℃、pH值为7条件下酶解1.2小时，灭酶、离心、收集上清液；

3)将步骤2)所得上清液浓缩至蛋白质浓度为1.2mg/mL，经DEAE-Sepharose离子交换色谱分离，收集洗脱液，并采用国际公认的氧自由基吸收能力(ORAC)方法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取抗氧化能力最高的组分B(ORAC值为1780μmoL TE/mg)(见图2、图3)，再次浓缩至蛋白质浓度为1.0～1.5mg/mL，经Sephadex G-25凝胶再次分离、脱盐，收集洗脱液，并采用ORAC法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取ORAC值高于2000μmoL TE/mg的组分B-3及B-4(见图4和图5)，经冷冻干燥后即得到富硒抗氧化肽。

实施例2

本发明提供一种食源性富硒抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

1)富硒米糠粉碎后过60目筛，在料液比(g/mL)为1 8、pH为8.0的食品级磷酸缓冲液中，于45℃下浸提2小时，浸提两次，6000转/分离心20min离心，合并上清液；上清液用稀盐酸调节pH值至4.5，沉淀蛋白，离心，弃上清，沉淀蛋白水洗两次备用；

2)在步骤1)所得沉淀蛋白中，加入质量/体积比为1 6的水，搅拌、匀浆，然后在中性蛋白酶与沉淀蛋白质量比为5％、温度为45℃、pH值为7.5条件下酶解1.0小时，酶解结束后用稀盐酸将酶解液调至中性，然后在风味蛋白酶与沉淀蛋白质量比为4％、温度为45℃、pH值为6.5条件下酶解1.0～1.5小时，灭酶、离心、收集上清液；

3)将步骤2)所得上清液浓缩至蛋白质浓度为1.5mg/mL，经DEAE-Sepharose离子交换色谱分离，收集洗脱液，并采用国际公认的氧自由基吸收能力(ORAC)方法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取抗氧化能力最高的组分，再次浓缩至蛋白质浓度为1.5mg/mL，经Sephadex G-25凝胶再次分离、脱盐，收集洗脱液，并采用ORAC法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取ORAC值高于2000μmoL TE/mg的组分，经冷冻干燥后即得到富硒抗氧化肽。

实施例3

本发明提供一种食源性富硒抗氧化肽的制备方法，包括以下步骤：

1)富硒米糠粉碎后过100目筛，在料液比(g/mL)为1 4、pH为9.5的食品级磷酸缓冲液中，于20℃下浸提4小时，浸提两次，6000转/分离心20min离心，合并上清液；上清液用稀盐酸调节pH值至4.5，沉淀蛋白，离心，弃上清，沉淀蛋白水洗两次备用；

2)在步骤1)所得沉淀蛋白中，加入质量/体积比为1 12的水，搅拌、匀浆，然后在中性蛋白酶与沉淀蛋白质量比为2％、温度为55℃、pH值为6.5条件下酶解1.5小时，酶解结束后用稀盐酸将酶解液调至中性，然后在风味蛋白酶与沉淀蛋白质量比为2％、温度为55℃、pH值为7.5条件下酶解1.0小时，灭酶、离心、收集上清液；

3)将步骤2)所得上清液浓缩至蛋白质浓度为1.0mg/mL，经DEAE-Sepharose离子交换色谱分离，收集洗脱液，并采用国际公认的氧自由基吸收能力(ORAC)方法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取抗氧化能力最高的组分，再次浓缩至蛋白质浓度为1.0mg/mL，经Sephadex G-25凝胶再次分离、脱盐，收集洗脱液，并采用ORAC法检测各洗脱组分的抗氧化能力，选取ORAC值高于2000μmoL TE/mg的组分，经冷冻干燥后即得到富硒抗氧化肽。

本发明以富硒糙米加工副产物——富硒米糠为原料，并提取硒蛋白，采用可控复合酶解技术对硒蛋白进行水解，并通过分离、纯化、活性验证步骤制备富硒抗氧化肽。本方法具有安全性高、条件温和、工艺简单、产品活性高等优点，所得富硒抗氧化肽在食品特别是功能性食品中的应用，既能发挥活性肽的抗氧化作用，又能提高人们饮食中硒的摄入量，具有多重有益作用。此外，本发明所用富硒米糠为富硒糙米加工副产物，由富硒米糠中制备富硒抗氧化肽可以有效提高资源利用率，增加产品附加值。

上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。