本发明涉及微生物筛选
技术领域：
，具体提供了一种复合益生菌饮料及其应用。
背景技术：
：益生菌是有益于宿主健康的一类微生物，1965年在Science上首次被提出。肠道菌系平衡是对人体营养和健康至关重要的因素，益生菌对人体肠道菌系有很好的调节作用，这使得益生菌的研究成为食品研究的一大热点。近年来，随着对益生菌的深入研究，益生微生物的种类也越来越多，其主要分为三大类:第一类为乳酸菌，主要包括嗜酸乳杆菌、粪链球菌和乳双歧杆菌等；第二类为芽胞杆菌；第三类为酵母菌。乳酸菌是一类能利用碳水化合物产生乳酸的非病原性、革兰氏阳性细菌的通称,包括乳杆菌、乳球菌和双歧杆菌等至少23个属。在选育乳酸菌菌株时应考虑一下几点:(1)菌体分离的对象应是健康的人或动物,人类使用的菌株最好来源于人。(2)能耐受人的胆汁酸盐和酸性环境。(3)具有适宜的免疫调节作用,不会引起炎症等不良反应。乳酸菌作为微生态制剂的重要菌种，在维护人和动物肠道健康、促进体内微生态平衡方面起着重要的作用，大量研究表明，乳酸菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制机体内毒素，抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。此外,乳酸菌作为重要的益生菌已广泛地用于医药、食品和饲料等行业中,被公认为是安全的食品级微生物。对于健康成年人来说，其肠道内微生物按一定的种群比例定植在肠壁上，处于一种稳定的菌群平衡中。但由于某些因素如抗生素的使用、放疗、化疗、饮食习惯不良、精神压力等原因可能会导致肠道正常菌群种类和数量的改变，肠道微生物生态系统被破坏，所引起的病理状态称为肠道菌群失调。乳酸菌进入肠道后，可以迅速进行生长繁殖，代谢产生的乳酸、二氧化碳使肠内pH值迅速降低，抑制了病原菌和有害人体健康的细菌的繁殖，从而起到预防感染、维持肠内菌群平衡的作用。乳酸菌对人体有特殊的生理作用，是机体内必不可少的正常生理菌群，拓展菌种来源，选育既有优良发酵特性，又有特殊保健功能的活菌数高、优良、安全的乳酸菌菌种；应用分子生物技术开发食品级乳酸菌菌株和工程菌菌株，将为人类带来巨大的经济效益、社会效益和生态效益。技术实现要素：本发明的目的是提供一种复合益生菌饮料及其应用。所述益生菌饮料中选用的干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)筛选自自然发酵的酸菜汁中，耐酸性强，抗菌、抗氧化作用明显，应用前景广阔。本发明一方面提供了一种复合益生菌饮料，包含干酪乳杆菌。所述干酪乳杆菌优选干酪乳杆菌KDB-LC(LactobacilluscaseiKDB-LC)，已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016431。所述复合益生菌饮料还包含植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和布氏乳杆菌中的任意一种或两种或三种的组合。所述植物乳杆菌的菌株编号为CCTCCNO：M2016137。所述嗜酸乳杆菌的菌株编号为CGMCC1.1854。所述布氏乳杆菌的菌株编号为CGMCC1.3108。所述复合益生菌饮料中乳酸菌活菌数超过30亿/mL。一种益生菌饮料的制备方法，具体为：将脱脂乳粉配制成12％的复原脱脂乳，采用95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃；按3％～5％接种量接种干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和布氏乳杆菌的混合菌液，37℃培养20～24h，终点酸度控制在160～175°T；按比例加入经90～110℃/5～10s杀菌的糖和稳定剂的组合物，混合均匀后，20～25MPa均质，然后在72℃/15s条件下热处理，冷却至15～20℃，采用无菌或卫生灌装，即得益生菌饮料。所述的混合菌液中干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和布氏乳杆菌的活菌数比例为2～3：2：0.5～1.0：0.5～1；进一步优选的，所述的混合菌液中干酪乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和布氏乳杆菌的活菌数比例为3：2：0.5：1。所述制备方法中，复原脱脂乳与糖和稳定剂的组合物的质量比为3:7。所述制备方法中，糖和稳定剂的组合物优选蔗糖和果胶。所述制备方法中，糖和稳定剂的组合物优选质量百分比为11.5％～14.8％的蔗糖和1.2％～1.5％的果胶。有益效果本发明提供的复合益生菌饮料中，干酪乳杆菌对大肠杆菌、沙门氏菌和幽门螺旋杆菌均有明显的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径高达24mm。所述干酪乳杆菌对胃酸和胆汁盐的耐受性强，且能在胃酸环境下实现有效增殖。所述干酪乳杆菌KDB-LC还具有很强的抗氧化能力，在1.0mmol/LH2O2中仍能保持97.44％的存活率；其发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达92.3％和87.1％。所述复合益生菌饮料通过四种乳酸菌的有效复配，能明显增加人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有利于维护人体肠道菌群健康，提高机体免疫力，应用前景广阔。具体实施例实施例1干酪乳杆菌KDB-LC分离筛选及鉴定1、筛选样品从沈阳苏家屯农村收集自然发酵的酸菜汁作为分离样品，所述酸菜汁外观无污染、味道纯正，发酵时间超过1年，过滤后备用。2、乳酸菌初筛取过滤后的酸菜汁5mL加入45mL无菌水，混匀，涂布于加0.5％碳酸钙的MRS平板上，37℃培养48h，分离培养有透明圈的菌株，获得42株乳酸菌。3、抑菌型乳酸菌筛选1)乳酸菌液制备：将初筛得到的32株乳酸菌分别接种于100mLMRS液体培养基中，37℃静置培养48h；2)致病菌菌液制备：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌(四种致病菌均由山东大学赠送)，将菌种接种于营养肉汤，37℃摇床培养过夜；3)抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基(50℃左右)加100μL致病菌菌液(菌量106数量级)，混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的乳酸菌菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。结果显示，初筛获得的乳酸菌中对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径均超过15mm的菌株共6株。进一步对其进行抗生素耐受筛选。经过两次删选，最终申请人从上述6株菌中筛选得到对金黄色葡萄球菌的生长抑制作用最强的乳酸菌，命名为KDB-LC。表1乳酸菌KDB-LC对致病菌的抑制作用致病菌大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌幽门螺旋杆菌抑菌圈直径18mm20mm24mm21mm由上表的结果可以看出，本发明筛选出的乳酸菌KDB-LC对大肠杆菌、沙门氏菌和幽门螺旋杆菌均有明显的抑制作用，尤其对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到24mm。3、菌株鉴定利用试剂盒提取上述乳酸菌KDB-LC的基因组DNA，利用PCR技术扩增16SrRNA序列。将测序结果在GenBank核酸数据库中进行blast比对发现，乳酸菌KDB-LC的16SrRNA序列与干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)的序列相似度高于99％。因此，确认其为干酪乳杆菌(Lactobacilluscasei)，命名为干酪乳杆菌KDB-LC(LactobacilluscaseiKDB-LC)，并于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M2016431。实施例2干酪乳杆菌KDB-LC耐酸、耐胆盐实验2.1耐酸实验将MRS液体培养基的pH值分别调整为2.0和3.0；121℃灭菌15min；将活化的干酪乳杆菌KDB-LC按照2％接种量接种到已冷却的培养基中，置于37℃恒温培养箱培养，分别于0h、1h、2h、3h时取样，平板计数测定活菌数，结果见表2。表2干酪乳杆菌KDB-LC耐酸性实验从表2可以看出，本发明所述干酪乳杆菌KDB-LC在pH2.0和pH3.0的酸性条件下培养3h后，活菌率分别高达86.7％和217％，说明干酪乳杆菌KDB-LC不仅有效能耐受pH2.0和pH3.0的酸性环境，而且在pH3.0条件下仍能实现一定的繁殖，因此能够有效抵抗胃液的破坏作用。2.2耐胆汁盐实验微生物对于胆盐的抗性是其能够在肠道存活、生长并发挥功效的先决条件之一。胆盐对菌株的抑制作用取决于胆盐的浓度和菌株本身的特性，不同消化道部位胆盐的含量不同，人体小肠中胆盐含量在0.03％～0.3％之间波动。能够在正常生理胆盐浓度中生长和代谢的菌株才可能在肠道中存活。在MRS液体培养基中加入牛胆汁粉，使其质量分数分别为0.0％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％和0.5％，按照2％接种量接种本发明的干酪乳杆菌KDB-LC，37℃厌氧培养，以溴甲酚紫为指示剂，观察培养基颜色变化，结果见表3。原理：干酪乳杆菌产酸，会导致培养基pH值下降，指示剂将由紫色变为黄色。表3干酪乳杆菌KDB-LC耐胆盐实验注：++为培养基在24h之内变色，+为在48h之内变色，-为培养基不变色从表3的结果可以看出，本发明提供的干酪乳杆菌KDB-LC在胆盐浓度为0.4％的环境中仍能存活，并生长良好，使培养基在48小时内变色，从而说明该菌株对胆盐具有很强的耐受性，能够在小肠环境(胆盐含量0.03％～0.3％)中有效定殖。实施例3干酪乳杆菌KDB-LC体外抗氧化实验将干酪乳杆菌KDB-LC进行传代活化后，以5％(质量比)接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18h，3000r/min，离心15min，分别收集发酵上清和菌体。制备无细胞提取物：用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤菌体3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109cfu/ml；然后超声波冰浴破碎菌体，10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。3.1干酪乳杆菌KDB-LC对过氧化氢的耐受能力过氧化氢是一种弱的氧化剂，但具有很好的扩散性，因此半衰期很长。由于这两个基本特性，过氧化氢本身就能造成氧化损伤，或者作为羟自由基的前体物质造成氧化损伤。将60mL的MRS培养基加入到灭过菌的三角瓶中，添加H2O2，使培养基中的起始H2O2浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L。按照1％的比例接种上述干酪乳杆菌KDB-LC到液体培养基中，37℃培养24h，测定600nm波长处的吸光度A600nm，以吸光度反映其菌体浓度的变化，确定菌株对H2O2耐受性。实验结果显示，240min后，干酪乳杆菌KDB-LC在1.0mmol/LH2O2中仍能保持97.44％的存活率，从而说明干酪乳杆菌KDB-LC具有很强的抗氧化能力。3.2干酪乳杆菌KDB-LC对羟基自由基的清除能力ROS自由基中，羟基自由基是最有活性的，在金属离子(如铜离子或铁离子)存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢能生成羟基自由基。羟基自由基是一种氧化性很强的自由基，会对生物细胞大分子造成损伤而影响细胞的正常功能。因此，对羟基自由基的清除能力是抗氧化性能的一个主要指标。ESR法测定清除羟基自由基的能力：分别将50μL干酪乳杆菌KDB-LC的发酵上清液和无细胞提取物各加入到50μL浓度为0.3mol/L的DMPO后，把反应的体系转入到密封的石英毛细管中，然后加50μL浓度为10mol/L的H2O2启动反应。反应2.5min后，通过ER200DSRCESR光谱仪分析。对照为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)。样品对·OH的清除作用以清除率表示。清除率＝(H0—H)/H0×100％式中：H和H0分别表示样品与对照波谱信号强度，信号的相对强度用波谱信号的第二个峰值来表示。结果显示：干酪乳杆菌KDB-LC的发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达92.3％和87.1％，从而说明本发明提供的干酪乳杆菌KDB-LC的发酵液上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，能有效清除羟基自由基，而且该菌株发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物，这说明干酪乳杆菌KDB-LC生长期间的代谢产物对羟基自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。实施例4体内抗氧化动物实验4.1实验设计体内抗氧化功能实验采用高脂氧化应激模型。实验动物使用健康昆明种小鼠40只，雌雄各半，体重23士2g，由江苏无锡惠山江南实验动物场提供。小鼠在室温下饲养，自由采食饮水，经3d的适应性饲养后，随机分成4组，每组10只，饲喂基础饲料(配方：89.5％普通饲料、10％猪油、0.5％胆固醇)，对照组每日灌胃0.2mL生理盐水，其余三组分低中高三剂量灌胃不同浓度干酪乳杆菌KDB-LC，如表4所示，每日0.2mL/只，连续4周。末次给样后禁食24h，迅速采集血液，分离红细胞和血清，检测红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性、全血谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、血浆过氧化氢酶(CAT)活性、血浆丙二醛(MDA)含量，所有数据均用统计软件SPSS进行统计学处理。试剂盒购于南京建成生物工程公司。表4抗氧化功能评价的动物实验组别饲喂方式对照组0.3ml生理盐水/只+基础饲料低剂量0.3ml菌液(细胞浓度0.01g/ml)/只+高脂饲料中剂量0.3ml菌液(细胞浓度0.02g/ml)/只+高脂饲料高剂量0.3ml菌液(细胞浓度0.04g/ml)/只+高脂饲料4.2结果分析4.2.1超氧化物歧化酶(SOD)超氧化物歧化酶(SOD)，是具有专一清除生物体内的超氧离子，能平衡机体的氧自由基。它可以清除过度超氧阴离子自由基，减少由超氧阴离子自由基产生的疾病。本发明中灌胃干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性的影响见表5。表5干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠红细胞SOD活力影响*P＜0.05从表5可以看出，相对于对照组，中剂量和高剂量小鼠的红细胞SOD酶活力存在显著性差异，酶活力得到较大提高，从而说明本发明的干酪乳杆菌KDB-LC能显著提高SOD酶活力，具有较强的抗氧化能力。4.2.2谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是机体内广泛存在的一种重要的催化过氧化氢分解的酶，催化还原型谷胱甘肽对过氧化氢的还原反应，起到保护细胞膜结构和功能的作用。灌胃干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力的影响见表6。表6干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力影响组别GSH-Px(酶活力单位)对照组132.23±0.87低剂量150.21±2.45中剂量172.33±4.02*高剂量187.67±2.44**P＜0.05从表6可以看出，高剂量组小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶活力高达187.67，比对照组提高了29.4％，从而说明本发明的干酪乳杆菌KDB-LC可以显著提高小鼠红细胞谷胱甘肽过氧化物酶的活力。4.2.3过氧化氢酶过氧化氢酶在机体内普遍存在，催化过氧化氢分解为水和氧气。过氧化氢是机体代谢的有毒副产物，经过过氧化氢酶催化转化成其它低毒的化学物，防止机体受到损伤。灌胃干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠过氧化氢酶活性影响见表7。表7灌胃干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠过氧化氢酶活性影响组别CAT活性(U/ml)对照组1.66±1.21低剂量1.89±2.61中剂量2.72±3.87*高剂量2.91±3.32**P＜0.05从表7可以看出，三个处理组的过氧化氢酶活性均明显高于对照组，且相对于对照组，中剂量和高剂量组过氧化氢酶的活性分别提高了63.9％和75.3％，从而说明本发明的干酪乳杆菌KDB-LC能显著提高小鼠机体内过氧化氢酶的活性，高剂量的干酪乳杆菌KDB-LC可以有效改善小鼠的抗氧化能力。4.2.4丙二醛丙二醛水平反应了机体内脂质过氧化，间接地反映出细胞损伤的程度。灌胃干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠红细胞丙二醛水平的影响见表8。表8灌胃干酪乳杆菌KDB-LC对小鼠红细胞丙二醛水平影响组别丙二醛含量(nmol/ml)对照组3.45±1.57低剂量3.02±1.56中剂量2.64±0.45高剂量1.49±2.09**P＜0.05从表8可以看出，与对照组相比，三个剂量的处理组丙二醛含量均明显降低，其中高剂量干酪乳杆菌KDB-LC使小鼠红细胞内丙二醛的含量降低了42.2％，从而说明本发明的干酪乳杆菌KDB-LC可以有效减轻小鼠体内自由基对细胞的损伤，保护小鼠的正常细胞。综上所述，本发明提供的干酪乳杆菌KDB-LC可以显著提高高脂氧化模型小鼠体内超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的酶活性，降低机体内丙二醛的水平，从而有效提高小鼠的抗氧化能力，增强机体免疫力。实施例5利用干酪乳杆菌KDB-LC制备益生菌乳饮料将脱脂乳粉配制成12％的复原脱脂乳150kg，采用95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃；按3％～5％接种量接种本发明所述干酪乳杆菌KDB-LC，37℃培养20～24h，终点酸度控制在160～175°T；加入350kg经90～110℃/5～10s杀菌的糖、稳定剂的混合物(该混合物的组成为1.2％～1.5％的果胶和11.5％～14.8％的蔗糖)，混合均匀后，20～25MPa均质，然后在72℃/15s条件下热处理，冷却至15～20℃，采用无菌或卫生灌装，即得到500kg干酪乳杆菌KDB-LC乳饮料，其中活菌数超过30亿/mL。实施例6益生菌乳饮料的效果评价从健康人群中随机挑选成年男女各20名，收集其新鲜粪便检测其中的乳酸菌及双歧杆菌数平均为2.21×108CFU/g和8.12×109CFU/g。40名健康成年人每天食用本发明所述益生菌乳饮料50ml，一周后检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数平均为9.34×109CFU/g和8.88×1011CFU/g。从结果看，食用该益生菌乳饮料能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有效改善胃肠道健康，提高机体免疫力，取得了意料不到的技术效果。实施例7复合益生菌饮料的制备方法将脱脂乳粉配制成12％的复原脱脂乳150kg，采用95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃；按3％～5％接种量接种干酪乳杆菌KDB-LC、植物乳杆菌DY-1CCTCCNO：M2016137、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)CGMCC1.1854和布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)CGMCC1.3108的混合液(其中四种菌的活菌数比例为2～3：2：0.5～1.0：0.5～1，优选3：2：0.5：1)，37℃培养20～24h，终点酸度控制在160～175°T；加入350kg经90～110℃/5～10s杀菌的糖、稳定剂的混合物(该混合物的组成为1.2％～1.5％的果胶和11.5％～14.8％的蔗糖)，混合均匀后，20～25MPa均质，然后在72℃/15s条件下热处理，冷却至15～20℃，采用无菌或卫生灌装，即得到500kg干酪乳杆菌KDB-LC乳饮料，其中活菌数超过30亿/mL。实施例8复合益生菌饮料的效果评价从健康人群中随机挑选成年男女各20名，收集其新鲜粪便检测其中的乳酸菌及双歧杆菌数平均为2.35×108CFU/g和8.41×109CFU/g。这40名健康成年人每人每天食用上述复合益生菌饮料50ml，一周后检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数。结果显示：食用乳酸菌饮料后，40名健康成年人新鲜粪便中益生菌及双歧杆菌数平均达到9.23×109CFU/g和9.04×1011CFU/g，远远高于食用复合益生菌饮料之前的菌数。从而说明，食用本发明提供的复合益生菌饮料能明显增加人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有利于维护人体肠道菌群健康。此外，长期研究数据表明，每日饮用本发明提供的复合益生菌饮料，不仅能大幅增加肠道中益生菌的数量，改善胃肠道的消化与吸收功能，还能有效降低人体血液中胆固醇的含量，清除自由基，增强机体的免疫力，维护身体健康。当前第1页1 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