乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜及制备方法和用途与流程

本发明属于食品抗菌保鲜领域，具体涉及一种乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜及制备方法和用途。

背景技术：

乳酸链球菌素(nisin)是乳酸链球菌产生的一种多肽物质。乳酸链球菌素能有效地抑制引起食品腐败的许多革兰氏阳性细菌，如金黄色葡萄球菌及单增核李斯特氏菌等的生长和繁殖，且是gras认证安全的食品防腐剂。食用后很快会水解成氨基酸，不会改变人体肠道内正常菌群以及产生如其它抗菌素所出现的抗性问题，是一种高效、无毒、安全、无副作用的天然食品防腐剂。现己广泛应用于乳制品、罐头制品、鱼类制品和酒精饮料中。

但是在食品中直接使用乳酸链球菌素，其生物活性容易减少，因为乳酸链球菌素会与食品中的脂质和蛋白质结合。现在的研究热点是利用食品生物聚合物进行封装来克服乳酸链球菌素直接使用的缺陷，因生物聚合物具有生物可降解性、生物相容性及便宜易得等特点。γ-聚谷氨酸和壳聚糖是生物聚合物的两个代表。

γ-聚谷氨酸(γ-pga)在国际化妆品药典上的命名为纳豆胶。聚谷氨酸是芽孢杆菌属产生的带负电的多聚氨基酸，其结构是由d型和l型谷氨酸通过α-氨基和γ-羧基以肽键形式形成的聚合物。γ-聚谷氨酸具有良好的水溶性、对金属离子的超强吸附性和生物可降解性，在体内会降解为无毒的短肽和氨基酸单体，是一种环保型高分子材料。可作为保水剂、重金属离子吸附剂以及药物载体等，在化妆品、食品及医药等产业均有很大的使用价值。

而壳聚糖是由几丁质经过脱乙酰作用得到的带正电荷的天然碱性多糖，因其具有广谱杀菌活性而在食品工业中备受关注。壳聚糖可溶于稀酸、甲酸及乙酸中，但不溶于水和绝大多数有机溶剂。壳聚糖无毒、无害，因其安全性、微生物可降解性等优点而被各行各业广泛使用。壳聚糖被用作增稠剂、被膜剂列入国家食品添加剂使用标准gb-2760。壳聚糖带有正电，利用此特点在液态介质中与带有负电荷的γ-聚谷氨酸交联制备壳聚糖纳米粒子。可以将一些阳离子分子，例如乳酸链球菌素包封在纳米粒子之中。

然而，纳米粒子直接在食品表面喷洒时很容易出现聚集和下降现象，降低了封装物质的生物活性。因此可以将壳聚糖纳米颗粒载入到纳米纤维中，从而纳米颗粒被固定在纤维膜上。静电纺丝是目前可以连续制备纳米纤维且操作方式较温和的方式，其制备的纳米纤维膜具有比表面积大、纳米级孔隙及活性化合物的高封装性等优点。许多聚合物如聚环氧乙烷、聚乳酸和聚乙烯醇因其优良的性能已被广泛用于制备纳米纤维膜。

国内有很多关于壳聚糖和静电纺丝的专利申请：中国专利cn103706335a公开了一种铁/壳聚糖/聚氧化乙烯复合纳米纤维膜除砷材料及其静电纺丝制备方法；中国专利cn103467772a公开了一种壳聚糖/γ-聚谷氨酸聚电解质海绵及制备方法及用途；中国专利cn105713244a公开了一种去除水中金属离子的聚谷氨酸-壳聚糖凝胶的制备方法；中国专利cn103041714a公开了一种改性壳聚糖复合静电纺丝纳米纤维的复合超滤及其制备方法；中国专利cn102776709a公开了一种静电纺丝制备聚乙烯吡咯烷酮/壳聚糖复合纳米纤维膜。

将负载乳酸链球菌素的壳聚糖纳米粒子与静电纺丝相结合，研究实验原料配方及其工艺参数，对于开发新型的食品活性包装具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜的制备方法和用途，通过将乳酸链球菌素与γ-聚谷氨酸交联，随后加入壳聚糖，使其与γ-聚谷氨酸交联制备得到负载乳酸链球菌素的γ-聚谷氨酸/壳聚糖纳米粒子，以减少乳酸链球菌素使用过程中生物活性的减少。然后将负载乳酸链球菌素的γ-聚谷氨酸/壳聚糖纳米粒子添加到静电纺丝溶液中制备成纳米纤维膜，提高壳聚糖纳米粒子的稳定性，达到长效抗菌与高效利用的目的。

本发明由壳聚糖，γ-聚谷氨酸，乳酸链球菌素，聚环氧乙烯制成负载乳酸链球菌素的纳米纤维抗菌膜。

纳米纤维抗菌膜的制备方法，包括以下步骤：

(1)自组装的负载乳酸链球菌素的γ-聚谷氨酸/壳聚糖纳米粒子溶液的制备：将壳聚糖溶解乙酸溶液中，常温下搅拌均匀后用去离子水将其稀释制得壳聚糖溶液；分别制备乳酸链球菌素溶液和γ-聚谷氨酸溶液，将乳酸链球菌素溶液缓慢加入到等体积的γ-聚谷氨酸溶液中，第一次磁力搅拌后得到乳酸链球菌素/γ-聚谷氨酸纳米颗粒溶液；随后将乳酸链球菌素/γ-聚谷氨酸纳米颗粒溶液逐滴加到等体积的壳聚糖溶液中，第二次磁力搅拌后用naoh溶液调节ph至6，随后通过离心机离心后获得自组装的负载乳酸链球菌素的γ-聚谷氨酸/壳聚糖纳米粒子，并溶解于与离心前使用的去离子水等体积的去离子水中，制得自组装的负载乳酸链球菌素的γ-聚谷氨酸/壳聚糖纳米粒子溶液，4℃保藏。

所述乙酸溶液中乙酸的体积百分浓度为1％。

所述稀释后的壳聚糖溶液浓度为2mg/ml。

所述壳聚糖的脱乙酰度为80.0～95.0。

所述乳酸链球菌素溶液的浓度为20mg/ml，γ-聚谷氨酸溶液的浓度为2mg/ml。

所述naoh溶液的浓度为2mol/l。

所述常温下搅拌的时间为10min；第一次磁力搅拌的时间为30min；第二次磁力搅拌的时间为12h；离心机离心的时间为40min。

(2)纳米纤维抗菌膜的制备方法：在步骤(1)中制得的自组装的负载乳酸链球菌素的γ-聚谷氨酸/壳聚糖纳米粒子溶液中加入聚环氧乙烯制备得到6wt％(g/g)的聚环氧乙烯静电纺丝溶液，常温搅拌过夜后超声脱气得到纺丝前驱体溶液，注射器吸取纺丝前驱体溶液进行静电纺丝，采用平板收集法，经3h后得到纳米纤维抗菌膜。

所述超声脱气的时间为30min。

所述静电纺丝电压为5kv-30kv，推进速率为0.1-3ml/h，接收距离为10-20cm，空气湿度控制在35％以下。

(4)所制纳米纤维抗菌膜的应用，其用于奶酪制品的保鲜，将经冷等离子体处理后的纳米纤维抗菌膜包封奶酪制品，有效延长其保质期。

(5)本发明的优点：本发明操作简单，所用的材料壳聚糖、γ-聚谷氨酸及乳酸链球菌素生物相容性好，经济、环保。纳米纤维抗菌膜可避免壳聚糖纳米颗粒直接喷洒食品表面时出现的聚集和下降现象。将抗菌膜应用于奶酪制品的保鲜可有效抑制致病微生物的生长，延长制品的保质期。

附图说明

表1乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子的表征。

图1聚环氧乙烯纤维膜和乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜。

图2乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜的抑菌圈图。

图3乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜的抗菌效果图。

图4乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜在奶酪中的实际应用。

具体实施方式

通过下面实例说明本发明的具体实施方式，但本发明的保护内容，不仅局限于此。

实施例1乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子的表征

1实验材料

2实验方法

1)乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子的制备与表征

①吸取500μl乙酸加入去离子水配成50ml的1％(v/v)的乙酸溶液，磁力搅拌20min。

②称取200mg壳聚糖加入到上述乙酸溶液中配制成4mg/ml的壳聚糖溶液，搅拌30min，然后吸取25ml壳聚糖溶液加25ml去离子水稀释。

③称取50mg的γ-聚谷氨酸加到25ml去离子水中，搅拌10min。

④称取500mg的乳酸链球菌素加到到25ml去离子水中，搅拌15min。

⑤将乳酸链球菌素溶液(20mg/ml)滴加到γ-聚谷氨酸溶液(2mg/ml)中，搅拌30min。

⑥将50ml的上述溶液逐滴加到50ml的壳聚糖溶液(2mg/ml)中，搅拌12h。

⑦搅拌完成后用2mol/l的naoh调节ph至6。

⑧通过离心机(9659×g)离心40min后获得自组装的乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子，并重悬于99.75ml去离子水中，并保藏与4℃冰箱。

2)包封率的测定

将制备得到的壳聚糖纳米粒子的溶液通过离心机(9659×g)离心40min获得上清溶液，按法国微量蛋白检测试剂盒的要求配制工作液，在空白孔中加10μl双蒸水，标准孔中加10μl标准品，测定孔中加10μl上清液，随后三孔中分别加250μl工作液混合，37℃孵育30min后用酶标仪测定562nm处的吸光度值，根据吸光度值计算出未包封的乳酸链球菌素的含量，由此可以计算出乳酸链球菌素的包封率。则：

3)粒径、多分散系数(pdi)值及zeta电位的测定

用美国布鲁克海文仪器公司产的，型号为bi-9000的高浓度激光粒度仪测定壳聚糖纳米粒子的粒径、多分散系数(pdi)值和zeta电位，所测样品放入样品池直接测量即可。

4)实验结果

表1乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子的表征

由表1可看出，乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子包封率为49.3％，包封效果较好。多分散系数(pdi)直接反映纳米粒子的稳定性，因此是主要参考指标，pdi＜0.3较好，当pdi>0.8时，不予考虑。空白壳聚糖纳米粒子的粒径为228.3nm、pdi为0.134，乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子的粒径为412.1nm、pdi为0.196，粒径明显变大。zeta电位也可以直接反映乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子的稳定性，因此也是主要参考指标，zeta电位的绝对值越大说明脂质体越稳定性，zeta电位的绝对值在0～30范围内属于不稳定，在大于30时脂质体较稳定性。如表1所示，空白壳聚糖纳米粒子的zeta电位为35.8mv，负载乳酸链球菌素的壳聚糖纳米粒子的zeta电位为46.1mv，两种壳聚糖纳米粒子都较稳定。

实施例2乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜的表征

1实验材料

聚环氧乙烯sigma-aldrich

实施例1壳聚糖纳米粒子

2实验方法

1)乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜的制备

①将离心得到的壳聚糖纳米粒子溶解于99.75ml去离子水中。

②称取600mg的聚环氧乙烯慢慢加入到9.4g的壳聚糖纳米粒子溶液中搅拌过夜，制备得到6wt％(g/g)的聚环氧乙烯纺丝前驱体溶液。

③注射器吸取5ml纺丝前驱体溶液，静电纺丝电压为20kv，推进速率为0.6ml/h，接收距离为15.5cm，空气湿度控制在35％以下，采用平板收集法，经3h后得到纳米纤维膜。

④按纺丝步骤，不加壳聚糖纳米粒子溶液，称取600mg的聚环氧乙烯慢慢加入到9.4g的去离子水中搅拌过夜，然后纺丝可得到空白聚环氧乙烯纤维膜；称取500mg的乳酸链球菌素溶于99.75ml去离子水中，搅拌均匀，随后称取600mg的聚环氧乙烯慢慢加入到9.4g的上述溶液中搅拌过夜，纺丝可得到乳酸链球菌素抗菌膜。

2)sem观察静电纺丝纤维膜

使用jsm-7001f扫描电子显微镜检查纳米纤维膜的形态。在真空下用au/pd混合物溅射不同的样品，且所有的sem实验在30kv下进行。

3)实验结果

扫描电镜图如图1所示，聚环氧乙烯纤维膜表面光滑，而乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子纤维膜有明显的突起，表明壳聚糖纳米粒子被包裹其中。

实施例3乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜的抑菌圈实验

1实验材料

聚环氧乙烯纤维膜；乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜

李斯特菌

2实验方法

1)制备菌液

接种李斯特菌于pyg液体培养基中,置于空气摇床中，在37℃、140rpm的条件下震荡培养24h，获得对数生长期的菌悬液。振荡器混匀后用0.03mol/l磷酸盐缓冲液10倍梯度稀释10000倍(约为10⁴cfu/ml)。

2)静电纺丝纤维膜处理

按照实施例1和2制备乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜和聚环氧乙烯纤维膜，烘箱干燥4h。将膜切成1cm×1cm的规格并放置于紫外灯下灭菌处理1h以备用。

3)抑菌圈实验

将灭菌后的聚环氧乙烯膜和抗菌膜经冷等离子体500w处理4min，用移液枪吸取100μl的李斯特菌液(约为10⁴cfu/ml)涂布于pyg固体培养基上。20min后将制备的空白纤维膜和抗菌膜无菌操作放置于固体培养基中心处，恒温培养箱37℃正置培养48h后观察抑菌圈。

4)实验结果

抑菌圈实验的结果如图2所示，空白组没有明显的抑制区，乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜有较大的抑制区(直径26-41mm)。结果表明，乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜表现出明显的李斯特菌抗菌活性。

实施例4乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜抗李斯特菌活性测定

1实验材料

聚环氧乙烯纤维膜；乳酸链球菌素抗菌膜；乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜

李斯特菌

2实验方法

1)静电纺丝纤维膜处理

按照实施例1和2制备聚环氧乙烯纤维膜、乳酸链球菌素抗菌膜和乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜，烘箱干燥4h。将膜切成2cm×2cm的规格并放置于紫外灯下灭菌处理1h以备用。

2)实验测定

将灭菌后的聚环氧乙烯纤维膜、乳酸链球菌素抗菌膜和乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜经冷等离子体500w处理4min。50ml的离心管中加入15ml磷酸盐缓冲液灭菌处理，将三种纤维膜分别置于含有李斯特菌(约为10⁵cfu/ml)的磷酸盐缓冲液中，离心管置于37℃的空气摇床中震荡反应。采用平板菌落计数法测定，每隔24h后取适量培养液进行10倍梯度稀释到合适的浓度，然后移取100μl稀释液滴到固体培养基上，涂布均匀之后放入37℃恒温恒湿培养箱中倒置培养。24h后进行平板菌落计数，从而对壳聚糖纳米粒子抗菌膜的抗菌活性进行评价。实验一式三份，结果取平均值。

3)实验结果

由图3清晰可知，乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜对李斯特菌具有较好的抗菌活性。而且乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜具有明显的缓释作用，且比单纺乳酸链球菌素的效果要好。

实施例5乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜在奶酪中的实际应用

1实验材料

聚环氧乙烯纤维膜；乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜

李斯特菌、奶酪(切成切成30×25×5mm大小)

2实验方法

1)静电纺丝纤维膜处理

按照实施例1和2制备乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜和聚环氧乙烯纤维膜，烘箱干燥4h，放置于紫外灯下灭菌处理1h以备用。

2)实验测定

将灭菌后的聚环氧乙烯纤维膜膜和抗菌膜经冷等离子体500w处理4min。用李斯特菌(约10³cfu/ml)接种奶酪样品，在无菌条件下保持20min后，用聚环氧乙烯纤维膜膜和抗菌膜包装接种的奶酪样品，将样品在4℃下储存。采用李斯特菌显色培养基通过平板菌落计数法测定，每隔72h后取出奶酪试样后于无菌环境下晾干，再转移到无菌均质袋中，并向装有奶酪试样的无菌均质袋中加入9倍的磷酸缓冲液均质。吸取上清液测定奶酪试样中的李斯特菌数，从而对抗菌膜的抗菌活性进行评价。实验一式三份，结果取平均值。

3)实验结果

由图4清晰可知乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜对奶酪中的李斯特菌具有较好的抗菌活性。而且从时间上可以看出，乳酸链球菌素/壳聚糖纳米粒子抗菌膜具有明显的缓释作用，从而保证乳酸链球菌素能够发挥长效的抗菌活性以及更好的杀菌效果。