本发明涉及β-葡萄糖苷酶在豆奶中的应用。
背景技术：
豆奶和豆粉是传统的大豆制品，有着悠久的发展历史。上世纪70年代开始盛行于中国、日本、韩国等亚洲国家。豆奶和豆粉之所以被广泛认可，因其富含大豆蛋白和不饱和脂肪酸，且不含乳糖和胆固醇。大豆是我国的主要农作物，大豆的加工业正处于不断发展过程中。目前国内生产豆奶和豆粉的大中型加工企业约为90家，年产量为85万吨，年加工大豆65万吨，年产冲调豆粉及豆乳粉35万吨，饮用豆奶50万吨，占大豆蛋白制品的18％左右。2013年我国城镇居民对奶产品的消费达到人均25kg左右，增长率达到18.3％。由于我国的动物奶源有限，进口奶制品价格居高不下，对于植物蛋白源的开发利用将会起到积极作用，尤其是豆奶和豆粉产业的发展将是动物源奶制品的重要的补充。国外，如美国、日本和德国更加重视豆奶和豆粉的研究开发。对豆奶和豆粉的进一步加工，赋予其对人体健康更有益的功能性将是应用创新的重要方向。
近年来研究发现大豆中含有丰富的大豆异黄酮。大豆异黄酮具有一定的雌激素活性，是一种优良的天然抗氧化剂，对衰老、动脉粥样硬化、癌症、骨质疏松等具有显著的预防作用。作为主要大豆制品的豆奶和豆粉因含有特殊生理活性的大豆异黄酮而受到越来越多的关注。大豆中的异黄酮主要以异黄酮糖苷化合物和异黄酮糖苷配基化合物两种形式存在。研究表明，异黄酮糖苷配基化合物的生物活性明显高于异黄酮糖苷化合物，是人体利用的有效形式。而大豆中的异黄酮糖苷化合物的含量远高于异黄酮糖苷配基化合物，所以，天然大豆及其制品中异黄酮生物有效性较低。
技术实现要素：
基于上述技术问题，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶在豆奶中的应用方法。
本发明所采用的技术解决方案是：
一种β-葡萄糖苷酶在豆奶中的应用方法，具体是在豆奶中接入培养的植物乳杆菌，利用植物乳杆菌在豆奶发酵过程中产生的β-葡萄糖苷酶直接转化豆奶的异黄酮糖苷化合物为异黄酮糖苷配基化合物，提高豆奶的生物有效性。
优选的，所述培养的植物乳杆菌的接种量为4％，以体积比计，培养温度为37℃，培养时间为24h。
上述的一种β-葡萄糖苷酶在豆奶中的应用方法，包括以下步骤：
(1)制备豆奶：将大豆置于蒸馏水中浸泡过夜；去除大豆皮，并用蒸馏水洗净；取去皮大豆200g加入500ml蒸馏水，使用豆浆机磨碎；所得浆料于80℃煮15min后，用双层纱布过滤，除去不溶的残渣；将过滤出的豆浆加入锥形瓶中，121℃灭菌15min；冷却至室温，加入蔗糖溶液，得到豆奶培养基；取样测定初始豆奶培养基中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存备用；
(2)菌种培养：取保存于甘油管中的植物乳杆菌菌液300μl，接种于mrs培养基中，盖上厌氧瓶瓶盖，于37℃下静置培养20h；
(3)发酵培养：取植物乳杆菌种子液接种于备用的豆奶培养基中，接种量为4％，以体积分数计，于37℃下培养24h，取样品用于测定β-葡萄糖苷酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的含量。
上述β-葡萄糖苷酶活性测定方法如下：植物乳杆菌发酵产生β-葡萄糖苷酶的酶促反应体系为1.2ml0.1mph为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反应30min后加入2ml0.5m碳酸钠终止反应，在400nm测定对硝基苯酚的吸光值；以不同浓度的对硝基苯酚标样绘制标准曲线，计算对硝基苯酚含量；酶活单位定义为45℃下，在1min内催化水解p-npg产生1μm对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位。
上述有机酸含量测定方法如下：取样品1ml加入1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，取上清液用0.22μm滤膜过滤用于hplc测定；色谱条件：高效液相色谱仪，aminexhpx-87h有机酸和醇分析柱，流动相为0.005mh2so4水溶液，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm，柱温为35℃。
上述异黄酮含量测定方法如下：取5ml样品加入5ml质量百分比浓度70％乙醇溶液混匀后，60℃下超声提取40min，10000rpm离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤用于hplc测定；色谱条件为：高效液相色谱仪，c18色谱柱，流动相为乙腈和0.2％甲酸，梯度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为260nm，柱温为35℃。
本发明接种的植物乳杆菌具有胞外分泌β-葡萄糖苷酶的特性，从而将豆奶中的异黄酮糖苷化合物转化为异黄酮糖苷配基化合物。
本发明的有益技术效果是：
采用本发明应用方法，β-葡萄糖苷酶活性最高为9.24u/ml，ph为4.12，乳酸含量为92.45mm，乙酸含量为10.01mm，大豆苷元的含量为9.06mg/l，提高了1.9倍，染料木素含量为34.14mg/l，提高了4.0倍。本方法有效的提高了豆奶的生物有效性，更利于人体的消化吸收，乳酸和乙酸调节了豆奶的风味，同时益生菌植物乳杆菌的添加，促进了人体肠道健康。
具体实施方式
β-葡萄糖苷酶能够催化大豆中的异黄酮糖苷化合物转化为异黄酮糖苷配基化合物，更利于人体吸收利用，可提高大豆制品中异黄酮的生物有效性。目前市场上未见利用β-葡萄糖苷酶生产的豆奶和豆粉产品出现。所以，将β-葡萄糖苷酶应用于豆奶和豆粉中具有较大的市场潜力。
益生菌在人体吸收利用大豆异黄酮的过程中起着重要作用，相当数量的益生菌能够分泌β-葡萄糖苷酶直接转化异黄酮糖苷化合物为异黄酮糖苷配基化合物，且一些益生菌还能将大豆异黄酮糖苷配基化合物中的大豆苷元进一步代谢成雌马酚，生物活性更高。但人体肠道中的益生菌的种类因年龄、疾病等原因的影响而各不相同，导致每个人每天摄入的大豆异黄酮的量有很大差异。将益生菌直接添加到大豆发酵制品中，在发酵过程中益生菌分泌β-葡萄糖苷酶转化大豆异黄酮糖苷化合物为苷元形式，利于肠道的吸收利用，同时可促进肠道中益生菌群的生长。
为了便于理解本发明，下面将结合具体实施例来进一步说明，然而这些实施例只是起到说明的作用，本发明并不局限于下述实施例。
实施例1
自制豆奶：将大豆置于蒸馏水中浸泡过夜；去除大豆皮，并用蒸馏水洗净；取去皮大豆200g加入500ml蒸馏水，使用豆浆机磨碎；所有浆料于80℃煮15min后，用双层纱布过滤，除去不溶的残渣；将过滤出的豆浆加入锥形瓶中，121℃灭菌15min；冷却至室温，加入过滤除菌的蔗糖溶液，取样测定初始豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存备用。
菌种培养：取保存于甘油管中的植物乳杆菌菌液300μl，接种于mrs培养基中，盖上厌氧瓶瓶盖，于37℃下静置培养20h。发酵培养：取植物乳杆菌种子液接种于准备好的豆奶培养基中，接种量为4％(v/v)，于37℃下培养12h，取样品用于测定β-葡萄糖苷酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的含量。
β-葡萄糖苷酶活性测定：植物乳杆菌发酵产生β-葡萄糖苷酶的酶促反应体系为1.2ml0.1mph为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反应30min后加入2ml0.5m碳酸钠终止反应，在400nm测定对硝基苯酚的吸光值。以不同浓度的对硝基苯酚标样绘制标准曲线，计算对硝基苯酚含量。酶活单位(u)定义为45℃下，在1min内催化水解p-npg产生1μm对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位。
有机酸含量测定：取样品(植物乳杆菌在豆奶中发酵产β-葡萄糖苷酶直接转化异黄酮糖苷化合物液)1ml加入1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，取上清液通过0.22μm滤膜过滤用于hplc测定。色谱条件：岛津lc-20a高效液相色谱仪，aminexhpx-87h有机酸和醇分析柱，流动相为0.005mh2so4水溶液，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm，柱温为35℃。
异黄酮含量测定：取5ml样品加入5ml70％乙醇混匀后，60℃下超声提取40min，10000rpm离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤用于hplc测定。色谱条件为：岛津lc-20a高效液相色谱仪，c18色谱柱(150mm×4.6mm,5.0μm)，流动相为乙腈和0.2％甲酸(a：乙腈，b：0.2％甲酸)，梯度洗脱，流速为0.8ml/min，检测波长为260nm，柱温为35℃。
经测定，豆奶中初始大豆苷为5.91mg/ml，染料木苷为28.30mg/ml，大豆苷元为3.09mg/ml，经过植物乳杆菌发酵12h后，豆奶中的大豆苷为3.71mg/ml，染料木苷为11.62mg/ml，大豆苷元为5.36mg/ml，染料木素为23.53mg/ml，β-葡萄糖苷酶为8.64u/ml，乳酸为44.58mm，乙酸为8.79mm，ph为5.11。
实施例2
自制豆奶：将大豆置于蒸馏水中浸泡过夜；去除大豆皮，并用蒸馏水洗净；取去皮大豆200g加入500ml蒸馏水，使用豆浆机磨碎；所有浆料于80℃煮15min后，用双层纱布过滤，除去不溶的残渣；将过滤出的豆浆加入锥形瓶中，121℃高压灭菌15min；冷却至室温，加入的过滤除菌的蔗糖溶液使浓度为2％(w/v)，取样测定初始豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存备用。
菌种培养：取保存于甘油管中的植物乳杆菌lyt-3菌液300μl，接种于mrs培养基中，盖上厌氧瓶瓶盖，于37℃下静置培养20h。
发酵培养：取植物乳杆菌lyt-3种子液接种于准备好的豆奶培养基中，接种量为4％(v/v)，于37℃下培养12h，取样品用于酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的测定。
β-葡萄糖苷酶活性测定：植物乳杆菌lyt-3发酵产生β-葡萄糖苷酶的酶促反应体系为1.2ml0.1mph为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反应30min后加入2ml0.5m碳酸钠终止反应，在400nm测定对硝基苯酚的吸光值。以不同浓度的对硝基苯酚标样绘制标准曲线，计算对硝基苯酚含量。酶活单位(u)定义为45℃下，在1min内催化水解p-npg产生1μm对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位。
有机酸含量测定：取样品(植物乳杆菌lyt-3在豆奶中发酵产β-葡萄糖苷酶直接转化异黄酮糖苷化合物液)1ml加入1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，取上清液于0.22μm滤膜过滤用于hplc测定。色谱条件：岛津lc-20a高效液相色谱仪，aminexhpx-87h有机酸和醇分析柱，流动相为0.005mh2so4水溶液，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm，柱温为35℃。
异黄酮含量测定：取5ml样品加入5ml70％乙醇混匀后，60℃下超声提取40min，10000rpm离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤用于hplc测定。色谱条件为：岛津lc-20a高效液相色谱仪，c18色谱柱(150mm×4.6mm,5.0μm)，流动相为乙腈和0.2％甲酸(a：乙腈，b：0.2％甲酸)，梯度洗脱程序为0-10min，b5％-80％；10-16min，b80％；16-22min，b80％-5％，流速为0.8ml/min，检测波长为260nm，柱温为35℃。
经测定，豆奶中初始大豆苷为5.91mg/ml，染料木苷为28.30mg/ml，大豆苷元为3.09mg/ml，经过植物乳杆菌lyt-3发酵18h后，豆奶中的大豆苷为1.23mg/ml，染料木苷为2.97mg/ml，大豆苷元为7.63mg/ml，染料木素为32.45mg/ml，β-葡萄糖苷酶为8.49u/ml，乳酸为74.24mm，乙酸为9.05mm，ph为4.71。
实施例3
自制豆奶：将大豆置于蒸馏水中浸泡过夜；去除大豆皮，并用蒸馏水洗净；取去皮大豆200g加入500ml蒸馏水，使用豆浆机磨碎；所有浆料于80℃煮15min后，用双层纱布过滤，除去不溶的残渣；将过滤出的豆浆加入锥形瓶中，121℃高压灭菌15min；冷却至室温，加入的过滤除菌的蔗糖溶液使浓度为2％(w/v)，取样测定初始豆奶中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量，其余4℃冰箱保存备用。
菌种培养：取保存于甘油管中的植物乳杆菌lyt-3菌液300μl，接种于mrs培养基中，盖上厌氧瓶瓶盖，于37℃下静置培养20h。
发酵培养：取植物乳杆菌lyt-3种子液接种于准备好的豆奶培养基中，接种量为4％(v/v)，于37℃下培养24h，取样品用于酶活性、ph、大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素、乳酸、乙酸的测定。
β-葡萄糖苷酶活性测定：植物乳杆菌lyt-3发酵产生β-葡萄糖苷酶的酶促反应体系为1.2ml0.1mph为5.0的磷酸-柠檬酸缓冲液、0.4ml8mm的p-npg、0.4ml酶液，45℃反应30min后加入2ml0.5m碳酸钠终止反应，在400nm测定对硝基苯酚的吸光值。以不同浓度的对硝基苯酚标样绘制标准曲线，计算对硝基苯酚含量。酶活单位(u)定义为45℃下，在1min内催化水解p-npg产生1μm对硝基苯酚所需的酶量为1个酶活单位。
有机酸含量测定：取植物乳杆菌lyt-3在豆奶中发酵产β-葡萄糖苷酶直接转化异黄酮糖苷化合物液1ml加入1.5ml离心管中，10000rpm离心1min，取上清液于0.22μm滤膜过滤用于hplc测定。色谱条件：岛津lc-20a高效液相色谱仪，aminexhpx-87h有机酸和醇分析柱，流动相为0.005mh2so4水溶液，流速为0.6ml/min，检测波长为210nm，柱温为35℃。
异黄酮含量测定：取5ml样品加入5ml70％乙醇混匀后，60℃下超声提取40min，10000rpm离心5min，取上清液经0.22μm滤膜过滤用于hplc测定。色谱条件为：岛津lc-20a高效液相色谱仪，c18色谱柱(150mm×4.6mm,5.0μm)，流动相为乙腈和0.2％甲酸(a：乙腈，b：0.2％甲酸)，梯度洗脱程序为0-10min，b5％-80％；10-16min，b80％；16-22min，b80％-5％，流速为0.8ml/min，检测波长为260nm，柱温为35℃。
经测定，豆奶中初始大豆苷为5.91mg/ml，染料木苷为28.30mg/ml，大豆苷元为3.09mg/ml，经过植物乳杆菌lyt-3发酵24h后，豆奶中的大豆苷为0mg/ml，染料木苷为0mg/ml，大豆苷元为9.05mg/ml，染料木素为34.14mg/ml，β-葡萄糖苷酶为7.52u/ml，乳酸为92.45mm，乙酸为10.01mm，ph为4.12。