专利名称：用调控方法培养体细胞胚获得人工种子贮藏的方法
技术领域：
本发明名称用调控方法培养体细胞胚获得人工种子贮藏的方法，属于生物技术细胞工程领域。
人工种子(artificialseeds)又称人造种子(syntheticseeds)，这一概念的出现与体细胞胚的实际应用紧密相关。体细胞胚增殖快，产量大，遗传均一同时因其是双极性结构，可直接形成再生植株，而不必经多次继代，分步诱导根和芽。自从Murashige(1978)在第四届国际植物组织和细胞培养会议上，提出体细胞胚可以包理制成人工种子以来，引起了不少科研工作者的极大兴趣。人工种子与天然种子类似具有三个组成部分第一部，体细胞胚，相应于天然种子的合子胚;第二部分，含有营养物质的胶衣组成的人工胚乳，相应于天然种子的胚乳部分;第三部分，种子外包有一层疏水膜以保护胚和胚乳的人工种皮，类似于天然种子的种皮。
人工种子应能象天然种子一样贮藏、播种萌发长成正常植株，而且人工种子对于农业生产有着诱人的应用前景。其优越性在于1、它能超越天然种子的生产，而不受空间和季节气候的影响，实现大规模工厂化机械化生产;2、在制作过程中，可包制植物生长调节剂、固氮菌和抗虫添加剂等，从而实现播种、植保、抗逆一体化;3、对无性繁殖植物杂种后代和工程植株进行快速繁殖等等。
人工种子的这些优点受到一些国家的政府和科技人员的极大重视。美国植物遗传公司(PGI)Redenbaugh领导的一个人工种子研究小组的科学家，从1982年起花了一年半时间筛选了100多种物质，以寻求包制人工种子用的介质。1986年报导了用海藻酸钠(Alginate)作为人工胚乳介质，这种物质在氯化钙溶液中固化成球。后来为大家所采用。但仍有不少缺点，如粘连，较软，贮存后发芽率降低、易失水和营养泄漏等等。1987年Fujii等人提出，在人工胚乳外包裹一层疏水的高分子膜作人工种皮，以避免人工胚乳破碎和很快风干。1988年美国加州植物遗传公司的Nouaille和Petiaral获人工种子包埋2项专利Gel-Coat技术和保护性多聚物;PGI公司又与纽约的Giba-Geigy分公司协作研究除草剂、杀虫和杀菌剂等添加物。新泽西州的DNA植物技术公司与麻萨诸塞州的阿瑟·利特尔(ArthuD·Lettle)公司协作研究生物反应器生产体细胞胚，以及Guelph大学的Mchetsic将苜蓿体细胞胚脱水状态保存，八个月仍有正常萌发率。美国植物基因公司的口号是“将来是我们的现在”！他们的主意是“没有完全搞成功没有关系，先赔上千万美元，把专利申请上，将来会发财的”。欧洲共同体也非常重视。法国是世界上最早利用植物组织培养技术进行无性繁殖，实现试管苗商品化的国家。在农作物种子出口方面，在国际市场上仅次于美国占第二位。所以对人工种子的研究很重视。在欧洲共同体内已纳入尤里卡计划生物技术的人工种子研制就有二个课题。其中西红柿人工种子由三家种子公司投资达二千万法币(合人民币1200万)。在日本也很重视，麒麟啤酒公司与美国PGI公司合作，联合研制生产水稻和蔬菜的人工种子。我国政府在“863”高技术生物领域中也纳入了人工种子研制的课题。北京大学、中山大学、中科院的化学所、植物所和遗传所都承担了这项研究任务。
人工种子的研制，十多年来在体细胞胚的发生，人工种皮材料的寻找和研制，以及人工种子的贮藏和防腐等方面做了大量的工作，取得了较好的进展，制作了包括模式植物在内的近二十来种人工种子。但从总体水平看仍处于试验阶段，还存在很多技术难题。如人工种子的贮藏问题就是其中之一。以往用常规方法培养的体细胞胚是处于旺盛生长状态，制作人工种子后很难控制住它的生长，曾用液体石蜡浸泡，低温下存放、铝铂和保鲜袋等贮藏，均未达到理想的效果。后来利用脱水控制人工种的生长，但萌发率下降明显。这方面的研究，最早(1978，1980)是用胡萝卜愈伤组织进行的。1985年Kitto等人将胡萝卜体细胞胚的培养物包在树脂薄片中，26℃干燥4天后，20个薄片中得到2棵植株，但未包的胚干燥后未成活。Gray等人(1987，1989)先后将鸭茅和葡萄体细胞胚脱水至天然种子含水量(12%)，然后在室温23℃贮存21天，首次从单个未包裹的体细胞胚获得再生植株以来，目前对贮藏研究较多的集中在体细胞胚上。Sanaratna等人(1989，1991)对紫花苜蓿和油菜小孢子胚，在脱水前用ABA处理，提高体细胞胚对脱水的忍耐力，他们认为苜蓿使用最适浓度为10μM。而油菜2-4mm的子叶期胚处理最适浓度为50μM。并对胚进行了热激和冷激处理，认为热激具ABA类似的效果。Anandarajsh等人(1990，1991)采用通过改变发育和成熟培养基中蔗糖、麦芽糖和铵离子浓度，企图来提高胚对脱水的忍耐力。他们认为当蔗糖浓度由3%增加到6%时，能提高体细胞胚籽苗的活力，而不降低胚的产量和同步性。他们采用热激(36℃10分钟→30℃4分钟→25℃10小时)与高蔗糖相结合的处理或在培养基中加10-5M ABA与高蔗糖结合处理，认为可提高苜蓿体细胞胚对干燥的忍耐力。但是他们报导体细胞胚在6%蔗糖的培养基上处理4天，经干燥后成活力和植株转换率均为零，而热激能提高存活力和植株转换率。因此，他们认为迄今为止，热激最有希望代替ABA。因为热激可诱导蛋白质的瞬时合成，以适应压力(Abernethy al et 1989)。最近，Fujii等人(1992)报导，将在含有5μM ABA的培养基上，25℃黑暗处理4星期左右的苜蓿体细胞胚，再转换在含100μM GA3(24℃散射光下)的SH培养基上预发芽2-4天苜蓿体细胞胚用海藻酸钠包裹。他们把包裹的和露裸的苜蓿体细胞胚同时播于大田与室内混合土盆栽进行比较观察。未包的播于大田并覆盖塑料杯的植株转换率为25%，而播于室内混合土盆中的植株转换率则为60%;而经包裹的体细胞胚植株转换率分别为23%和40%。未包裹的体细胞胚播于大田并覆盖塑料和尼绒布的植株转换率分别为13%和9%;而经包裹的胚则分别为5%和14%。但播于大田未加任何覆盖的植株转换率仅为1%，这些最新资料表明，尽管研究者在包装和播种处理方面做了很多尝试，但并没有涉及人工种子的贮藏问题。
本发明专利的目的及创新之点在于通过调控培养的方法获得具有高活力的静止状态的胚。这为人工种子提供了一条胚贮藏的新途径。由于是静止状态，在贮藏过程中无需特殊条件的控制，方法简易、贮存容积小。
本发明的内容及方案1.调控培养对胡萝卜体细胞胚生长发育的影响通过正常培养细胞大量增殖后，分成二组，一组仍作正常培养为对照组，另一组以提高悬浮培养基中的蔗糖浓度作调控培养，当培养10-20天时，处理组经调控培养全部胚处于Ⅲ级球形胚，而正常培养的对照组只有28.3%处于Ⅲ级小胚，多数为Ⅰ、Ⅱ级的子叶胚和鱼雷胚。当培养45-55天时，对照组全部分化成具根芽的植株，而经调控培养的仍有74.8%处于Ⅲ级胚，Ⅰ、Ⅱ级胚总共为25.2%。由此可见，调控培养延缓了体细胞胚的生长发育的速度，同时也抑制了胚根的伸长。经110-130天的观察调控培养中的体细胞胚仍无胚根伸长。调控培养有效地抑制了初生体细胞胚和高度同步化的次生体细胞胚的胚根伸长，使胚处于相对静止状态。
2.静止状态胚的特点静止状态胚短粗、手感硬呈鲜黄色;细胞排列致密，液泡消失，淀粉等贮存物质增多;鲜重比对照胚高2.12倍，干物质高3.8倍。调控培养45-50天时，淀粉积累达高峰，相当于对照组的1.9倍，而可溶性糖60-70天时达到高峰，相当于对照组的1.7倍。静止状态胚呼吸一直较低，仅为对照组最高时的1/40。
3.静止状态胚抗逆性强静止状态胚在含水量54%，室温贮存4-5个月，植株转换率为78%，而对照组贮存一个月便全失去活力。经慢脱水至17%，室温贮存4-5个月，植株转换率为67%，而正常培养的对照组不经贮存即失去活力。由此可见，调控培养的静止状态的体细胞胚具耐脱水和贮存抗逆性强之优点。而最为突出的优点是，由于生理上处于静止状态，胚根不伸长，在含水量较高(50%左右)的室温下，也能贮存，而且植株转换率较干胚还高。贮存过程无需特殊条件来控制胚的生长。
从经贮存的静止状态胚与正常培养未经贮存对照组胚的苗期生长来看，正常植株率前者比后者高1.4倍，植株高度为2倍，真叶数为10倍，根和根系均比对照组好，植株生长健壮。
优点及效果综上所述，由调控培养法获得的静止状态的体细胞胚，为人工种子有效贮藏开辟了胚贮藏的新途径。我们认为，只要建立好的体细胞胚的发生系统，采用我们提供的调控培养方法，适时地转入调控培养，即可获得适于贮藏的具高活力的静止状态的体细胞胚。
实施例1材料日本用商用胡萝卜(DaucascarotaL.)品种日本国分大长人参。
1.愈伤细胞的诱导，将胡萝卜种子表面消毒后，播种在1/2MS琼脂培养基上发芽，取5-7日龄实生苗的下胚轴和子叶，切成3-4mm的片段，接种在附加有1.5-2.0mg/L2.4-D的MS固体培养基上诱导愈伤细胞。
2.正常悬浮培养。取诱导8-12天膨大切段作起始材料，按每瓶6-8切段的接种量，转接在装有35ml的20-35S培养基(含20-35克/升蔗糖的MS无激素培养基)的100ML三角瓶中，置24-27℃下，以90-100rpm的转速振荡培养。每隔6-8天更换一次新鲜培养基。
3.调控培养。在正常培养10-20天后，细胞增殖加快。细胞长成形态小内含物丰富的胚性细胞团，当球形胚出现时，转入高蔗糖40-60克/升(即每升含40-60克蔗糖的MS无激素培养基)的调控培养，(定时观察胚的生长状态)。其他培养条件同上述2，每隔6-8天更换一次培养基。调控培养时期体细胞胚生长发育延缓，细胞排列变致密，液泡逐渐消失，贮存物质增多，胚的硬度加大，胚根伸长受抑制处于呼吸较低的静止状态。
4.收获静止状态胚。调控培养50-90天，体细胞胚包括初级体细胞胚和次生体细胞胚已处于胚根受抑制的静止状态，淀粉及可溶性糖已达高峰期后，及时收获。经无菌滤纸吸干，放置无菌瓶中，用封口膜封住瓶口，室温下贮存(有条件也可放在冰箱4℃贮存)，供制作人工种子或胚播种用。
实施例2材料美国商用胡萝卜品种DanversHalflong。
1.愈伤细胞的诱导。种子经表面消毒后(70%酒精1分钟，0.1%HgCl12分钟)后播种在双层湿滤纸上发芽，取5-6日龄的实生苗子叶或胚轴，切成3-4mm的片段，在含1-1.5mg/L2.4-D的MS固体培养基上诱导愈伤细胞，每20天左右继代1次。
2.正常悬浮培养。取继代2-3次疏松愈伤细胞作悬浮培养的起始材料，按每瓶200mg愈伤细胞的接种量，接种在装有35ml的20-35S(含20-35克/升蔗糖的MS无激素培养基)的100ML三角瓶中，置24-27℃下，以90-100rpm的转速振荡培养。每隔6-8天更换一次新鲜培养基。
3.调控培养。在正常培养10-15天后，细胞增殖加快。细胞长成胚性细胞团，球形胚立即出现时，提高蔗糖浓度为70-90S(即每升含70-90克蔗糖的MS无激素培养基)进行调控培养，培养条件同正常培养。每隔6-8天更换一次新鲜培养基。随着胚的生长及时分瓶或转250ml锥形瓶进行培养。进入调控培养，体细胞胚的生长发育速度延缓，细胞逐渐脱水，液泡变小细胞排列致密硬度加强，内部贮存物质增多而呼吸降低胚伸长受抑制。
4.收获静止状态的体细胞胚。经50-90天调控培养，初级体细胞胚和大量同步的次生体细胞胚均处于胚根生长受抑制的静止状态。淀粉和其他贮存物质已达到高峰期。及时收获，经过滤收获，滤纸吸干置无菌烧杯中，用封口膜封住烧杯口放置室温贮存。
权利要求
1.一种用调控方法培养体细胞胚获得人工种子贮藏的方法，其特征在于所述方法包括(1)取材日本商用胡萝卜(Daucas carotaL·)品种日本国分大长人参；(2)愈伤细胞的诱导，将胡萝卜种子表面消毒后，播种在1/2MS琼脂培养基上发芽，取5-7日龄实生苗的下胚轴和子叶，切成3-4mm的片段，接种在附加有1.5-2.0mg/L，2.4-D的MS固体培养基上诱导愈伤细胞；(3)正常的悬浮培养，取上述(2)中诱导8-12天膨大切段作起始材料，按每瓶6-8切段的接种量转接在装有35ml的20-35S培养基(含20-35克/升蔗糖的MS无激素培养基)的三角瓶中，在24-27℃下，以90-100rpm的转速振荡培养。每隔6-8天更换一次新鲜培养基；(4)调控培养，按上述(3)培养10-20天后，当球形胚出现时，转入高蔗糖40-90(即每升含40-90克蔗糖的MS无激素培养基)的培养基中进行调控培养，其他培养条件同上述(3)，每隔6-8天更换一次培养基；(5)收获静止状态胚，按上述(4)调控培养50-90天后及时收获，用无菌滤纸将体细胞胚(包括初级体细胞胚和次生体细胞胚)吸干，放置无菌瓶中，用封口膜封住瓶口在室温或冰箱3-6℃贮存，供制作人工种子或胚播种使用。
2.根据权利要求1(1)中所述用调控方法培养体细胞胚获得人工种子贮藏的方法，其特征在于取材为美国商用胡萝卜品种Danvers Half long。
3.根据权利要求1(3)中所述用调控方法培养体细胞胚获得人工种子贮藏的方法，其特征在于作正常悬浮培养时起始材料为继代2-3次疏松愈伤细胞。
4.根据权利要求1所述用调控方法培养体细胞胚获得人工种子贮藏的方法，其特征在于对已建立了悬浮培养能获得大量的高质量的体细胞胚的农业作物以及蔬菜类品种，采用此调控培养方法就可以得到静止状态的体细胞胚。
全文摘要
采用我们发明的调控培养方法，使悬浮培养中的体细胞胚生长发育延缓，获得呼吸较低，胚根生长受抑制的静止状态的体细胞胚。其特点是胚的细胞排列致密硬度增大；贮存物质积累增多，抗逆性强；脱水至含水量为50％左右，贮存4个月植株转换率为78％；脱水至含水量17％，贮存4个月植株转换率为67％；经贮存后的胚生长的植株较常规培养的体细胞胚生长的植株健壮。这种静止状态的体细胞胚具有耐贮藏容积小，无需特殊条件控制等优点，为人工种子贮存问题开辟了新途径。
文档编号C12N5/04GK1074482SQ9310027
公开日1993年7月21日 申请日期1993年1月15日 优先权日1993年1月15日
发明者黄美娟, 黄绍兴, 朱澄, 苏都莫日根 申请人:北京大学