专利名称：新基因和生产l－氨基酸的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，更具体地说涉及生产氨基酸的方法，特别是用大肠杆菌属细菌生产L-高丝氨酸，L-苏氨酸或L-亮氨酸的方法。
背景技术：
本发明人得到了基于大肠杆菌K-12的突变体thrR(下文称为rhtA23)，该突变体对在基本培养基中对高浓度的苏氨酸或高丝氨酸的耐性相关(Astaurova，O.B.等应用生物化学和微生物学.，21，611-616(1985))。该突变改善了各自的大肠杆菌生成株L-苏氨酸(SU专利号974817)，高丝氨酸和谷氨酸(Astaurova，O.B.等.，应用生物化学和微生物学，27，556-561，1991)的生产。
而且，本发明人发现rthA基因位于大肠杆菌的18分钟处并且该rthA基因与pexB和ompX基因之间的ORF1一致。表达由该ORF所编码的蛋白的表达单元被称为rhtA基因(rht高丝氨酸和苏氨酸耐性)。rhtA基因包括一5’-非编码区，其中有SD序列，ORF1和终止子。再者，本发明人发现如果将野生型rhtA基因克隆为多拷贝状态，则其对耐受苏氨酸和高丝氨酸起作用；而rhtA突变是基于ATG起始密码子在-1位用A替换G(第17届国际生物化学和分子生物学会议暨美国生物化学和分子生物学联合会1997年会摘要，加利福尼亚，旧金山，1997年8月24-29，摘要号457)。
已经发现，至少两个不同的基因在rhtA基因以多拷贝状态存在于大肠杆菌中时赋予细菌对苏氨酸和高丝氨酸的耐性，而另一基因是赋予对高丝氨酸耐性的rhtB基因(俄罗斯专利申请号98118425)。
发明内容
本发明的一个目的是提供以高产率生产氨基酸，特别是L-高丝氨酸，L-苏氨酸和分支氨基酸的方法。
本发明人发现当用多拷贝载体克隆大肠杆菌染色体上的86分钟区域时，其赋予大肠杆菌细胞对L-高丝氨酸的耐性。本发明人还发现在其上游有一参与对苏氨酸耐性的基因rhtC，象扩增rhtA基因一样当这些基因被扩增时，大肠杆菌的氨基酸产率得到提高。基于这些发现，从而完成了本发明。
从而，本发明提供(1)一种大肠杆菌属细菌，其中通过增强在细菌细胞中如下面(A)或(B)所定义的蛋白的活性而使所述细菌对L-苏氨酸的耐性得到增强(A)包括序列表中SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白质；和(B)包括在序列表SEQ ID NO4的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失，替换，插入或添加的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白有使所述细菌耐L-苏氨酸的活性；(2) (1)的细菌，其中通过增强在所述细菌细胞中如下面(C)或(D)所定义的蛋白的活性而使所述细菌对L-高丝氨酸的耐性进一步得到增强；(C)包括序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质；和(D)包括在序列表SEQ ID NO2的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失，替换，插入或添加的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白有使所述细菌耐L-高丝氨酸的活性；(3) (1)或(2)的细菌，其中通过用编码在(A)或(B)定义的蛋白的DNA转化所述细菌而使在(A)或(B)中定义的蛋白的活性得到增强；(4) (2)的细菌，其中通过用编码在(C)或(D)定义的蛋白的DNA转化所述细菌而使在(C)或(D)中定义的蛋白的活性得到增强；(5)一种生产氨基酸的方法，包括如下步骤在培养基中培养(1)-(4)任一项所述的能产生氨基酸的细菌以便于培养基中产生和积聚氨基酸，以及从培养基中回收氨基酸；(6) (5)的方法，其中所述氨基酸选自L-高丝氨酸，L-苏氨酸和分支氨基酸；(7) (6)的方法，其中分支氨基酸是L-缬氨酸或L-亮氨酸；(8)一种编码如下面(A)或(B)定义的蛋白的DNA(A)包括序列表中SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白质；和(B)包括在序列表中SEQ ID NO4的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失，替换，插入或添加的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白有使所述细菌抗L-苏氨酸的活性；(9) (8)的DNA，它是如下述(a)或(b)所定义的DNA(a)包括SEQ ID NO3中核苷酸序号之187-804的核苷酸序列的DNA；(b)在严格条件下能与SEQ ID NO3的187-804核苷酸序列杂交的DNA或从该核苷酸序列制备的探针，并且该DNA编码一种所述细菌具有抗L-苏氨酸活性的蛋白。
(10) (9)的DNA，其中严格条件是指漂洗在60℃，盐浓度为1×SSC和0.1％的条件下进行。
编码如上述(A)或(B)中定义的蛋白的DNA片段可以称为“rhtC”基因，rhtC基因编码的蛋白称为“RhtC蛋白”，编码如上述(C)或(D)中定义的蛋白的DNA片可以称为“rhtB”基因，rhtB基因编码的蛋白称为“RhtB蛋白”。RhtC蛋白所起的赋予细菌对L-苏氨酸耐性的活性(即使细菌具有RhtC蛋白L-苏氨酸耐性)可以被称为“Rt活性”，RhtB蛋白所起的赋予细菌对L-高丝酸耐性的活性(即使细菌具有RhtB蛋白L-高丝氨酸耐性)可以被称为“Rh活性”。编码RhtB蛋白或RhtC蛋白的结构基因可以被称为“rthB结构基因”或“rthC结构基因”。术语“增强Rt活性或Rh活性”是指赋予细菌对苏氨酸或高丝氨酸的耐性或通过增加RthC蛋白或RthB蛋白的数目，增加这些蛋白的比活性或使针对这些蛋白的表达或活性的负调节脱敏等方式而增强耐性。术语“编码蛋白的DNA”指该DNA是双链时其中一条链编码蛋白。L-苏氨酸耐性指细菌在含有使野生型菌株不能生长的苏氨酸浓度的基本培养基上生长的特性，通常苏氨酸的浓度大于30mg/ml。L-苏氨酸耐性指细菌在含有使野生型菌株不能生长的苏氨酸浓度的基本培养基上生长的特性，通常苏氨酸的浓度大于5mg/ml。产生氨基酸的能力指细菌在培养基中比野生型菌株以更大量产生和积聚的特性。
根据本发明，可以赋予大肠杆菌属细菌对高浓度苏氨酸，或高浓度苏氨酸和高丝氨酸的耐性。对苏氨酸，或苏氨酸和高丝氨酸抗性增强的大肠杆菌属细菌可以在培养基中以高产率积聚氨基酸特别是L-高丝氨酸，L-苏氨酸，或分支氨基酸如L-缬氨酸和L-亮氨酸。
本发明将详述如下。
<1>用于本发明的DNA用于本发明的第一个DNA编码一个有Rt活性的蛋白并且具有SEQ IDNO4的氨基酸序列(rhtC)基因。具体地说，该DNA可以举例为包括SEQ ID NO3核苷酸序号187-804的核苷酸序列的DNA。
用于本发明的第二个DNA编码一个有Rh活性的蛋白并且具有SEQ IDNO2的氨基酸序列(rhtB)基因。具体地说，该DNA可以举例为包括SEQ ID NO1核苷酸序号557-1171的核苷酸序列的DNA。
含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的rhtB基因对应于一与GenBank登记号M87049序列互补的序列的一部分，而且包含f138(M87049的核苷酸号61959-61543)，该f138是一个位于大肠杆菌染色体86分钟上的已知的但功能未知的ORF(开读框)及其5’-和3’-侧翼区。在5’-侧翼区仅有160核苷酸的f138不能赋予对高丝氨酸的耐性。在M87049的62160和61959核苷酸之间(ORFf138的上游)没有终止密码子。而且，在该序列的一个ATG密码子之前是一个核糖体结合位点(M87049的62171-62166)。因此，编码区的长度为201bp。更大的ORF(M87049的核苷酸序号62160-61546)被称为rhtB基因。
可以通过，例如，如下方法用大肠杆菌可K12或W3110的溶原株裂解液感染大肠杆菌的Mucts溶原株而得到，而在该方法中使用了mini-Mu d5005噬粒(Groisman，E.A.等细菌学杂志.，168，357-364(1986))并从生长在含卡那霉素(40μg/ml)和L-高丝氨酸(10mg/ml)的基本培养基上分离噬粒DNA。正如下文中实施例中所描述的，rhtB基因被定位在大肠杆菌染色体的86分钟处。因此，可以通过克隆杂交或PCR(聚合酶链式反应，参照White，T.J.等，遗传学动态。5，185(1989)，其中使用了含有对应于大肠杆菌染色体上86分钟附近区域序列的寡核苷酸。
可以替代地，可以根据SEQ ID NO1的核苷酸序列设计寡核苷酸。用寡核苷酸对作PCR的引物，可以扩增整个编码区，其中寡核苷酸对的核苷酸序列对应于SEQ ID NO1的核苷酸序号557以上的上游区和核苷酸序号1171以下的下游区。
可以使用商业上可以购得的DNA合成仪(例如，Applied Biosystems生产的380B型DNA合成仪)以常规方法如磷酰亚胺方法进行合成。而且，可以根据生产商提供的方法用Taq DNA合成酶(Takara Shuzo公司提供)以商业上可以买到的PCR设备(如，Takara Shuzo公司的PJ200型热循环仪)继续扩增。
如下面实施方案中所描述的，在克隆rhtB时，偶尔可以在含有rhtB基因的DNA片段中得到rhtC基因。RhtC基因对应于下文所述校正后的序列0128(GenBank登记号M87049核苷酸序号60860-61480)，0128序列是一个已知的但功能未知的ORF。可用根据SEQ ID NO3的核苷酸序列设计的寡核苷酸通过杂交或PCR而得到rhtc基因。用寡核苷酸对作PCR的引物，可以扩增整个编码区，其中寡核苷酸对的核苷酸序列对应于SEQ ID NO3的核苷酸序号187以上的上游区和核苷酸序号804以下的下游区。
在本发明中，编码本发明的RhtB蛋白的DNA编码的RhtB蛋白可以在一个或多个位点有一个或几个氨基酸的缺失，替换，插入或添加，前提条件是所编码的RhtB蛋白的Rh活性没有被降低。类似地，编码本发明的RhtC蛋白的DNA编码的RhtC蛋白可以在一个或多个位点有一个或几个氨基酸的缺失，替换，插入或添加，前提条件是所编码的RhtC蛋白的Rt活性没有被降低。
例如，可以通过定点突变而使特点位点的一或几个被缺失，替换，插入或添加从而对核苷酸序列继续修饰，这样即可以得到变与如上所述的RhtB或RhtC蛋白基本相同的蛋白的DNA。可以用常规的突变处理得到上述的DNA修饰。突变处理包括体外用羟胺处理编码RhtB蛋白或RhtC蛋白的DNA的方法，用紫外线照射或使用常用的突变处理剂N-甲基-N’-硝基-N-硝基胍和亚硝酸处理携带有编码RhtB蛋白的DNA的微生物如大肠杆菌属细菌的方法。
可以通过在合适的细胞中多拷贝表达上述经过突变处理DNA并评价其对高丝氨酸或苏氨酸的耐性和选择耐性增加的DNA，从而得到编码与上述的RhtB或RhtC蛋白基本相同的蛋白的DNA。
一般都知道，蛋白的氨基酸序列和其编码核苷酸序列可能在种类，菌株，突变体或变异体上有轻微的不同。
可以用如下方法获得编码与RhtB蛋白或RhtC蛋白基本相同的蛋白的DNA在合适的细胞中多拷贝表达经过体外突变处理的DNA，评价其对高丝氨酸的耐性，并选择耐性增强的DNA。
大家都知道，蛋白质的氨基酸序列与其编码核苷酸序列在物种，菌株，突变体或变异体之间有少许不同。
因此，可以通过如下方法获得编码与RhtC蛋白质的基本相同的蛋白的DNA从经过突变处理的大肠杆菌属细菌或自发大肠杆菌属细菌的突变体或变异体分离DNA，该DNA在严格条件下与含有SEQ ID NO3核苷酸序列187-804的核苷酸的DNA或与可以从该段核甘酸序列得到的探针杂交，并且其编码的蛋白具有Rt活性。
而且，可以通过如下方法获得编码与RhtB蛋白质的基本相同的蛋白的DNA从经过突变处理的大肠杆菌属细菌或自发大肠杆菌属细菌的突变体或变异体分离DNA，该DNA在严格条件下与含有SEQ ID NO1核甘酸序列557-1171的核甘酸的DNA或与可以从该段核苷酸序列得到的探针杂交，并且其编码的蛋白具有Rh活性。
术语“严格条件”在本文的含义是在该条件下形成了所谓特异的杂交而没有形成非特异的杂交。很难用什么数字来清楚的表达该条件。但是，严格条件可以是，例如，相互之间的同源性不小于70％的DNA之间可以杂交而低于上述数值的DNA之间不能杂交。可以替代地，相对于Southern杂交中普通洗涤条件，可以例举出如下的条件，其盐浓度是例如，60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS。
<2>本发明的大肠杆菌属细菌本发明的大肠杆菌属细菌是属于大肠杆菌属的Rt活性增强的细菌。本发明细菌的优选实施方案是Rh活性也得到增强的细菌。大肠杆菌属细菌的例子是大肠杆菌。可以按如下方法增强Rt活性，例如，扩增细胞中rhtC结构基因的拷贝数，或者用重组DNA转化大肠杆菌属细菌，其中在重组DNA中含有编码RhtC蛋白的rhtC结构基因的DNA片段被与可以在大肠杆菌属细菌中有效起作用的启动子序列相连接。也可以通过用可以在大肠属细菌中有效起作用的启动子序列替换rhtC基因染色体上的启动子序列而使Rt活性得到增强。
另外，可以按如下方法增强Rh活性，例如，扩增细胞中rhtB结构基因的拷贝数，或者用重组DNA转化大肠杆菌属细菌，其中在重组DNA中含有编码RhtB蛋白的rhtB结构基因的DNA片段被与可以在大肠杆菌属细菌中有效起作用的启动子序列相连接。也可以通过用可以在大肠属细菌中有效起作用的启动子序列替换rhtB基因染色体上的启动子序列而使Rh活性得到增强。
可以通过将携带有rhtC或rhtB结构基因的多拷贝载体导入至大肠杆菌属的细菌中而在细胞中扩增rhtC或rhtB结构基因的拷贝数。具体地说，可以通过将携带有rhtC或rhtB结构基因的质粒，噬菌体或转座子(Berg，D.E.，Berg，C.M.，Bio/Techol.，1，417(1983))导入至大肠杆菌属的细菌中而增加拷贝数。
多拷贝载体的例子有质粒载体pBR322，pMW118，pUC19等，噬菌体载体λ1059，λBF101，M13mp9等。转座子有例如Mu，Tn10，Tn5等。
可以用例如，D.A.M.Morrison等的方法(酶学方法，68，32(1979))将DNA导入到大肠杆俊属细菌，或使用以氯化钙处理受体菌以增加对DNA的通透性的方法(Mandel，M.和Higa，A.，分子生物学杂志，53，159，(1970))。
如上所述，如果增强了产氨基酸的大肠杆属细菌中的Rt活性或Rt和Rh二者的活性，则氨基酸的产量可以得到增加。由于增强了大肠杆属细菌中的Rt活性或Rt和Rh二者的活性，则能够产生目的氨基酸的菌株得到了使用。另外，可以将产生氨基酸的能力赋予其中的Rt活性或Rt和Rh二者的活性得到增强的细菌中。
以rhtC DNA片段的扩增为基础，得到了比不含扩增的rhtC DNA片段能积聚更高量的氨基酸的新菌株产高丝氨酸的大肠杆菌MG442/pRhtC；产苏氨酸的大肠杆菌MG442/pVIC40，pRhtC；产高丝氨酸，缬氨酸和亮氨酸的大肠杆菌NZ10/pRhtBC；NZ10/pRhtB，pRhtC。
新菌株已经根据布达佩斯条约进行了国际保藏，保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。大肠杆菌MG442/pRhtC的登记号为VKPMB-7700；大肠杆菌MG442/pVIC40，pRhtC的登记号是VKPM不是B-7680；大肠杆菌NZ10/pRhtB，pRhtC的登记号是VKPM B-7681；大肠杆菌NZ10/pRhtBC的登记号是VKPM B-7682。
菌株MG442/pRhtC(VKPM B-7700)表现出如下的培养形态学和生物化学特征。
细胞形态学革兰氏阴性，圆头的微弱能动的杆状。长度，1.5-2.0μm。
培养特征牛肉提取物琼脂37℃培养24小时后，产生直径1-3mm的圆的苍白的半透明的克隆，其特征在于表面光滑，边缘规则或稍微呈波纹状，中间稍微突起，结构均一，粥状粘稠，容易乳化。
Luria’s琼脂37℃培养24小时后，产生直径1.5-2.5mm的苍白的半透明的克隆，其表面光滑，结构均一，粥状粘稠，容易乳化。
基本的琼脂粘稠培养基M937℃培养40-48小时后，产生直径0.5-1.5mm克隆，其颜色是微灰白色，半透明的克隆，稍微突起，表面光泽。
培养在牛肉提取物肉汤中37℃培养24小时后，很混浊，气味特殊。
生理和生物化学特征穿刺接种培养在牛肉提取物琼脂中在整个接种区生长良好。证明该微生物是兼性厌氧的。
不液化明胶。
在牛奶上生长很好，并使牛奶凝固。
不产生吲哚。
温度条件在百忙之中0-2℃生长与牛肉提取物肉汤中，最适温度33-37℃。
培养基的pH值在液体培养基中pH6-8，最适值7.2。
碳源在葡萄糖，果糖，乳糖，甘露糖，半乳糖，木糖，甘油，甘露糖醇上生长良好，产生气和酸。
氮源以氨盐，硝酸盐以及一些有机化合物来源的可同化氮。
对氨苄青霉素有抗性。
L-异亮氨酸被用作生长因子。但是，该菌株可以在没有亮氨酸的情况下缓慢生长。
所含的质粒该细胞含有多拷贝的杂种质粒pRhtC以保证对氨苄青霉素(100mg/ml)的抗性，并带有rhtC基因以增加对苏氨酸(50mg/ml)的耐性。
除了pRhtC之外，菌株大肠杆菌MG442/pVIC40，pRhtC(VKPM B-7680)和菌株VKPM B-7700的培养形态和生物化学特征相同，其含有多拷贝的杂种质粒pVIC40以保证对链霉素(100mg/ml)的抗性并带有苏氨酸操纵子基因。
除了用L-苏氨酸(0.1-5mg/ml)代替L-异亮氨酸作为生长因子外，菌株大肠杆菌NZ10/pRhtB，pRhtC(VKPM B-7681)和菌株VKPM B-7700的培养形态和生物化学特征相同。此外，其含有多拷贝的杂种质粒pRhtB以保证对卡那霉素(50mg/ml)的抗性并带有rhtB基因以赋予对高丝氨酸(10mg/ml)的耐性。
除了含有多拷贝的杂种质粒pRhtBC以保证对氨苄青霉素(100mg/ml)的抗性并带有rhtB和rhtC基因以赋予对高丝氨酸(10mg/ml)和L-苏氨酸(50mg/ml)的耐性外，菌株大肠杆菌NZ10/pRhtBC(VKPMB-7682)和菌株VKPM B-7681的培养形态和生物化学特征相同。
<3>产生氨基酸的方法可以通过在培养基中培养一种细菌以在培养基中产生和积聚氨基酸并从培养基中回收氨基酸从而有有效地产生氨基酸，其中该种细菌由于拷贝了多个rhtC基因，或rhtC和rhtB基因两者而使其Rt活性，或Rt和Rh两者的活性都得到增强。氨基酸的例子优选是L-苏氨酸，L-高丝氨酸和分支链氨基酸。分支链氨基酸的例子有L-缬氨酸，L-亮氨酸和L-异亮氨酸，优选L-缬氨酸和L-亮氨酸。
在本发明的方法中，大肠杆菌属细菌的培养，从液体培养基收集和纯化氨基酸都可以用与传统细菌发酵生产氨基酸相似的方式进行。用于培养的培养基可以是合成的或天然的培养基，只要其中含有碳源，氮源和矿物质以及细菌生长时需要的合适的量的营养即可。根据细菌的同化能力，碳源可以包含葡萄糖，蔗糖和各种有机酸。氮源可以使用氨，各种铵盐如硫酸铵，其他含氮化合物如胺，天然氮源如胨，大豆水解产物和分解的发酵微生物。矿物质有，磷酸二氢钾，硫酸镁，氯化钠，硫酸亚铁，硫酸锰和碳酸钙。
培养优选在有氧条件下如摇动，通气和搅拌的情况下进行。培养温度通常是20-40℃，优选30-38℃。培养的pH值通常是5-9，优选6.5和7.2。培养物的pH可以用氨，碳酸钙，各种酸，各种碱和缓冲液进行调整。通常1-3天的培养就可以在培养基中积聚起靶氨基酸。
可以按如下方法回收氨基酸通过在培养后离心或膜过滤去掉固体如细胞，然后通过离子交换，浓缩和结晶分离方法收集和纯化靶氨基酸。
附图简述
图1示rhtB基因和rhtC基因的克隆和鉴定。
图2示带有rhtB基因的质粒pRhtB的结构。
图3示带有rhtB基因的质粒pRhtB的结构。
图4示带有rhtB和rhtC基因的质粒pRhtBC的结构。
实施发明的最佳方式下面将参照实施例对本发明进行具体解释。在下面的实施例中，除非特别指出，氨基酸是指L-构型。
实施例1获得rhtB和rhtC DNA片段第一步将有高丝氨酸和苏氨酸耐性的基因克隆进mini-Mu噬粒将有高丝氨酸和苏氨酸耐性的基因体内克隆进mini-Mu d5005噬粒(Groisman，E.A.，等，细菌学杂志.，168，357-364(1986))。菌株MG442的MUCts62溶原体(Guayatiner等.，Genetika(在俄罗斯)，14，947-956(1978))被用作供体。用新鲜制备的裂解物去感染菌株VKPM B-513(hfr K10 metB)的MuCts的溶原衍生物。将细胞种在含甲硫氨酸(50μg/ml)，卡那霉素(40μg/ml)和高丝氨酸(10μg/ml)的M9基本培养基中。48小时后挑取和分离菌落。分离质粒DNA并用标准技术转化菌株VKPM B-513。在带有卡那霉素的L-肉汤琼脂培养板上筛选菌落。从耐高丝氨酸的菌落中分离质粒DNA，并对插入片段进行限制性图谱分析。结果发现，从供体克隆了两种类型的属于不同染色体区域的插入子。因此，在大肠杆菌中至少两种不同的基因以多拷贝形式赋予对高丝氨酸的耐性。两种插入子中的一个是已经报道过的rhtA基因第17届国际生物化学和分子生物学会议暨美国生物化学和分子生物学联合会1997年年会，旧金山，加利福尼亚，1997年8月24-29〕。两种插入子中的另一个是赋予高丝氨酸的0.8kb的MluI-MluI片段(图1)。
第二步rhtB和rhtC基因的鉴定用Sanger的双脱氧链终止法测定插入子片段的序列。对DNA的两条链进行全长测序，所有的接头都重叠。测序结果表面包括f138(GenBank登记号M87049的核苷酸号61543-61959)，该f138是一个已知的但功能未知的ORF，其位于大肠杆菌染色体的86分钟处及其上游350bp的区域(M87049的下游处)。在5’-侧翼区仅有160核苷酸的f138不能赋予对高丝氨酸的耐性。在f138的上游M87049的核苷酸的62160和61950之间没有终止子。而且，在该序列中，在一个ATG后接着一个核糖体结合位点。较大的ORF(核苷酸号62160-61546)称为rhtB基因。从该基因推导出的RhtB蛋白含有高度亲水的区域并可能含有跨膜区。
如上所述，含有该基因的质粒仅仅赋予细胞对高浓度高丝氨酸的耐性。由于开始的SacI-SacII DNA片段含有第二个未经鉴定的ORF，0128，故将该基因亚克隆以检测其赋予对高丝氨酸和苏氨酸耐性的稳定性。已经证明，含有0128的质粒(ClaI-Eco47III片段)赋予对50mg/ml的苏氨酸的耐性(图1)。将亚克隆片段测序后发现它在M87049的核苷酸61213和61214之间还另有一个核苷酸G。序列中核苷酸的增加消除了移码并使ORF的5-侧翼区到达60860核苷酸。该新基因称为rhtC。发现rhtB和rhtC基因两者对参与谷氨酸棒杆菌(Corneybacteriumglutamicum)的赖氨酸外运的转运蛋白一致。
实施例2rhtB和rhtC基因扩增对高丝氨酸基因产生的影响<1>构建L-高丝氨酸生产菌株大肠杆菌NZ10/pAL4，pRhtB和高丝氨酸的生产将rhtB基因插入到pUK21(Vieira，J.和Messing，J.，基因，100，189-194(1991))以得到pRhtB(图2)。
用质粒pAL4转化大肠杆菌菌株NZ10以得到菌株NZ10/pAL4，其中pAL4质粒是插入了编码天冬氨酸激酶-高丝氨酸脱氢酶的thrA基因的pBR322载体。菌株NZ10是从大肠杆菌C600(thrB，leuB)(Appleyard R.K.，遗传学，39，440-452，1954)得到的leuB+恢复突变体thrB。
用pUK21或pRhtB转化菌株NZ10/pAL4以得到菌株NZ10/pAL4，pUK21和NZ10/pAL4，pRhtB。
将得到的转化体分别培养在含50mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨苄青霉素的营养肉汤中于37℃培养18小时，将0.3ml培养物接种到20×200mm的试管的3ml的发酵培养基(其组成如下)中并且在发酵培养基中含有50mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨苄青霉素，于37℃在转台上培养48小时。培养后，用已知方法测定培养基中积聚的高丝氨酸量和在560nm处的吸收值。
发酵培养基组成(g/L)葡萄糖 80(NH4)2SO422K2HPO42NaCl 0.8MgSO4.7H2O 0.8FeSO4.7H2O 0.02MnSO4.5H2O 0.02盐酸硫胺素 0.2
酵母提取物1.0CaCO330(CaCO3单独灭菌)结果如表1所示。如表1所示，菌株NZ10/pAL4，pRhtB比rhtB基因没有增强的菌株NZ10/pAL4，pUK21积聚了更大量的高丝氨酸。
表1
><2>高丝氨酸生产菌大肠杆菌MG442/pRhtC的构建和高丝氨酸的生产将rhtC基因插入到pUC21(Vieira，J.和Messing，J.，基因，100，189-194(1991))以得到pRhtC(图3)。
已知大肠杆菌MG442产生苏氨酸的量小于3g/L(Gusyatiner，等.，1978，Gentika(俄罗斯)14947-956)，用质粒pUC21或pRhtC该菌株以得到菌株MG442/pUC21和MG442/pRhtC。
将得到的转化体分别培养在含100mg/ml氨苄青霉素的营养肉汤中于37℃培养18小时，将0.3ml培养物接种到20×200mm的试管的3ml的发酵培养基(其组成如下)中并且在发酵培养基中含有50mg/ml卡那酶素和100mg/ml氨苄青霉素，于37℃在转台上培养48小时。培养后，用已知方法测定培养基中积聚的高丝氨酸量和在560nm处的吸收值。结果如表2所示。
表2.<
实施例3rhtB和rhtC基因扩增对苏氨酸基因产生的影响<1>构建苏氨酸生产菌株大肠杆菌VG442/pVIC40，pRhtB(VKPM B-7660)和苏氨酸的生产用常规的转化方法，将已知质粒pVIC40(美国专利号5,175,107)转化菌株MG442。在含0.1mg/ml的链霉素的LB琼脂平板上筛选转化体。由此得到新菌株MG442/pVIC40。
用pUK21或pRhtB转化菌株MG442/pVIC40以得到菌株MG442/pVIC40，pUK21和MG442/pVIC40，pRhtB。
将得到的转化体分别培养在含50mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨苄青霉素的营养肉汤中于37℃培养18小时，将0.3ml培养物接种到20×200mm的试管的3ml的实施例2所述的发酵培养基中并且在发酵培养基中含有50mg/ml卡那霉素和100mg/ml氨苄青霉素，于37℃在转台上培养68小时。培养后，用已知方法测定培养基中积聚的高丝氨酸量和在560nm处的吸收值。
结果如表3所示。如表3所示，菌株MG442/pVIC40，pRhtB比rhtB基因没有增强的菌株MG442/pVIC40，pUK21积聚了更大量的苏氨酸。
表3.
<2>苏氨酸生产菌大肠杆菌MG442/pVIC40，pRhtC(VKPM B-7680)的构建和苏氨酸的生产用pRhtC和pUC21转化菌株MG442/pVIC40。由此得到转化体MG442/pVIC40，pRhtC和MG442/pVIC40，pUC21。
用上述同样的方法，将MG442/pVIC40，pRhtC和MG442/pVIC40，pUC21，将得到的转化体分别培养在含100mg/ml氨苄青霉素的营养肉汤中于37℃培养18小时，将0.3ml培养物接种到20×200mm的试管的3ml的上述发酵培养基中并且在发酵培养基中含有50mg/ml卡那酶素和100mg/ml氨苄青霉素，于37度在转台上培养46小时。培养后，用已知方法测定培养基中积聚的苏氨酸量和在560nm处的吸收值。
结果如表4所示。
表4.
<p>实施例4rhtB基因和rhtC基因在氨基酸生产中的协调作用含有rhtB和rhtC基因的ScaII-SacII DNA片段被插入到pUC21中。由此得到了携带有rhtC和rhtB基因的质粒pRhtBC(图4)。
然后用pUC21，pRhtB，pRhtC或pRhtBC转化菌株NZ10，从而得到转化体NZ10/pUC21(VKPM B-7685)，NZ10/pRhtB(VKPM B-7683)，NZ10/pRhtC(VKPM B-7684)，NZ10/pRhtB，pRhtC(VKPM B-7681)和NZ10/pRhtBC(VKPM B-7682)。其中NZ10/pUC21(VKPM B-7685)，NZ10/pRhtB(VKPM B-7683)，NZ10/pRhtC(VKPM B-7684)，根据布达佩斯条约进行国际保藏，保藏在俄罗斯国立工业微生物保藏中心(VKPM)。
用如上所述的方式培养得到的转化体，并用已知的方法测定培养基中积聚的各种氨基酸的量以及在540nm处的吸收。
结果如表5所示。从表5可知，pRhtB和pRhtC在生产高丝氨酸，缬氨酸和亮氨酸中的协调作用。这些结果表面，rhtB基因和rhtC基因的产物可能在细胞内相互作用。
表5
实施例5rhtB基因和rhtC基因对氨基酸耐性的作用如上所述，带有rhtB和rhtC基因的质粒在不同的菌株中对一些氨基酸在培养肉汤中的积聚有正影响。已经证明，积聚氨基酸的模式依赖于菌株的基因型。RhtB和rhtC基因产物与谷氨酸棒杆菌赖氨酸转运蛋白LysE的一致性(Vrljic，M.，Sahm，H和Eggeling，L.(1996)分子微生物学.22，815-826.)表面这些蛋白的类似功能。
因此，测试了pRhtB和pRhtC质粒对菌株N99的敏感性，而N99菌株已知是已知对一些氨基酸和氨基酸类似物耐性的菌株W3350(VKPM B-1557)的链霉素耐性(StrR)突变体。将菌株N99/pUC21，N99/pUK21，N99/pRhtB和N99/pRhtC的过夜肉汤培养物(109cfu/ml)以1∶100稀释在M9基本培养基中并在相同的培养基中培养5小时。然后将得到的对数期培养物稀释，并将约104存活细胞使用到干燥的测试板上，其中测试板上是含加倍量的氨基酸或类似物的M9琼脂(2％)。因此，可以测试这些化合物的基本抑制浓度(MIC)。
结果如表6所示。从表6可知，除了高丝氨酸外，多拷贝的rhtB赋予对α-氨基-β-羟基缬氨酸(AHVA)和S-(2-氨乙基)-L-半胱氨酸(AEC)，和4-迭氮基-DL-亮氨酸的耐性；除了苏氨酸外，多拷贝的rhtC基因增加对缬氨酸，组氨酸和AHVA的耐性。这些结果表面，每个推定的转运蛋白RhtB和RhtC对几个底物(氨基酸)有特异性，或者由于扩增的原因而不表现出特异性的结果。
表6.
*N99/pUK21得到的数据相同。
序列表<110>味之素公司<120>新基因和生产L-氨基酸的方法<130>OP851<141>1999-12-<150>RU-98123511<151>1998-12-23<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1231<212>DNA<213>大肠杆菌<220><221>CDS<222>(557)..(1171)<400>1agaaataatg tggagatcgc accgcccatc gaatgtgcca gtatatagcg tttacgccac 60ggaccgggct gaacctcctg ctgccagaat gccgccagat catcaacata atcattaaag 120cgattaacat gcccgagatg cggatcggct aacaggcgac cggaacgtcc ctgcccgcga 180tggtcgatga ttaagacatc aaaccccaaa tggaacaggt cataggccag ttccgcatat 240tttacgtagc tctcaatacg ccccgggcag atgactacca cccggtcatg gtgctgtgcg 300cgaaaacgga caaagcgcac cggaatgtca tccacaccag taaactctgc ttcatcacgc 360tgacgccaga aatcagtcag cggtcccatg gtaaaagcag caaacgcgtt ttctcttgtt 420tcccagtctt tttgctgctg aaacatcggg taatctgcct cttaaaccac gtaaaatcgt 480tttttttagc gtgcctgaca caacgctgcg acagtagcgt attgtggcac aaaaatagac 540acaccgggag ttcatc atg acc tta gaa tgg tgg ttt gcc tac ctg ctg aca 592Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr1 5 10tcg atc att tta acg ctg tcg cca ggc tct ggt gca atc aac act atg 640Ser Ile 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权利要求
1.一种大肠杆菌属的细菌，其中通过增强在细菌细胞中如下面(A)或(B)所定义的蛋白的活性而使所述细菌对L-苏氨酸的耐性得到增强(A)包括序列表中SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白质；和(B)包括在序列表SEQ ID NO4的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失，替换，插入或添加的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白有使所述细菌耐L-苏氨酸的活性。
2.权利要求1的细菌，其中通过增强在所述细菌细胞中如下面(C)或(D)所定义的蛋白的活性而使所述细菌对L-高丝氨酸的耐性进一步得到增强(C)包括序列表中SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白质；和(D)包括在序列表SEQ ID NO2的氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸的缺失，替换，插入或添加的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白有使所述细菌耐L-高丝氨酸的活性。
3.权利要求1或2的细菌，其中通过用编码(A)或(B)定义的蛋白的DNA转化所述细菌而使(A)或(B)中定义的蛋白的活性得到增强。
4.权利要求2的细菌，其中通过用编码(C)或(D)定义的蛋白的DNA转化所述细菌而使(C)或(D)中定义的蛋白的活性得到增强。
5.一种生产氨基酸的方法，包括如下步骤在培养基中培养如权利要求1-4任一项所述的能产生氨基酸的细菌以便于培养基中产生和积聚氨基酸，以及从培养基中回收氨基酸。
6.权利要求5的方法，其中所述氨基酸选自L-高丝氨酸，L-苏氨酸和分支氨基酸。
7.权利要求6的方法，其中分支氨基酸是L-缬氨酸或L-亮氨酸。
8.一种编码如下面(A)或(B)定义的蛋白的DNA(A)包括序列表中SEQ ID NO4的氨基酸序列的蛋白质；和(B)包括在序列表中SEQ ID NO4的氨基酸序列中的含有一个或多个氨基酸的缺失，替换，插入或添加的氨基酸序列的蛋白，并且该蛋白有使所述细菌具有抗L-苏氨酸的活性。
9.权利要求8的DNA，它是如下述(a)或(b)所定义的DNA(a)包括SEQ ID NO3中核苷酸序号之187-804的核苷酸序列的DNA；(b)在严格条件下能与SEQ ID NO3的187-804核苷酸序列杂交的DNA或从该核苷酸序列制备的探针，并且该DNA编码一种所述细菌具有抗L-苏氨酸活性的蛋白。
10.权利要求9的DNA，其中严格条件是指漂洗在60℃，盐浓度为1×SSC和0.1％的条件下进行。
全文摘要
在培养基中培养能产生氨基酸的一种细菌以便在培养基中产生和积聚该氨基酸并从该培养基中回收该氨基酸,其中编码一种能使细菌具有L－苏氨酸耐性的蛋白的rhtC基因被增强,优选地,其中编码一种能使细菌具有L－高丝氨酸耐性的蛋白的rhtB基因被增强。
文档编号C12N15/09GK1260393SQ99126909
公开日2000年7月19日 申请日期1999年12月23日 优先权日1998年12月23日
发明者V·A·利夫希特斯, N·P·扎卡塔伊瓦, V·V·阿列伸, A·V·贝拉雷瓦, I·L·托赫马科瓦 申请人:味之素株式会社 被以下专利引用 (3),