，命名为LcS-Mef，保藏于MRS固体培养基（斜面）中。
[0126] (3)BN-NKPQQ-RWX-301 的活化培养
[0127] 将保存于豆芽汁玉米汁固体培养基（斜面）中的BN-NKPQQ-RWX-301取一环，接种 至豆芽汁玉米汁液体培养基活化，培养温度35°C，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0128] (4)LcS-Mef的活化培养
[0129] 将保存于MRS固体培养基（斜面）中的LcS_Met_取一环，接种至MRS液体培养基 37°C活化培养，培养结束菌种密度达到109cfu/mL左右。
[0130] (5)富含NK和PQQ的玉米汁的发酵制备
[0131] 将活化的BN-NKPQQ-RWX-301与LcS-Met_混合，使混合菌液中二者密度比为 1:5 (1X108CFM/mL: 5X108CFM/mL)，混合菌液以5 %接种量接种含玉米汁的发酵培养基， 37°C六层纱布封口培养36h，得到富含NK和PQQ的玉米汁。玉米汁培养基中所含豆芽汁、酪 氨酸、谷氨酸和麦芽糖对BN-NKPQQ-RWX-301合成NK和PQQ进行代谢调控，豆芽汁有利于纳 豆芽孢杆菌增殖，麦芽糖有利于NK合成，而PQQ由酪氨酸和谷氨酸通过肽键连接环化而成。 发酵结束后，玉米汁中NK活力1113U/mL，PQQ含量88ng/mL。所获得的玉米汁富含纳豆激 酶和吡咯喹啉醌，具有玉米汁固有的滋味和发酵后特有的风味。
[0132] 本发明中采用色谱法测定PQQ，具体步骤参照"NojiN,NakamuraT，Kitahata N,etal.Simpleandsensitivemethodforpyrroloquinolinequinone(PQQ)analysis invariousfoodsusingliquidchromatography/electrospray-lonizationtandem massspectrometry.JAgriFoodChem，2007, 55 (18): 7258-7263.'，〇
[0133] 本发明中采用琼脂糖-纤维蛋白原平板法测定NK活力。测定步骤：将发酵液过滤 后点种在琼脂糖-纤维蛋白平板上，37°C孵育18h，以尿激酶作为标准品，通过测量透明圈 直径计算纳豆激酶相当于尿激酶的活力单位（U/mL)。
【主权项】
1. 一种选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉 米汁的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 、将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢杆菌10263分别进 行亚硝基胍诱变；然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳 豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌，命名为纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-301 ; 2) 、将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌， 命名为干酪乳杆菌LcS-Met-; 3) 将纳豆芽孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-301和干酪乳杆菌LcS-Met-共发酵玉米汁，得到富 含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁。
2. 根据权利要求1所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的高通量筛选具体包括：①制 备2个平板豆芽汁玉米汁固体培养基，其中一个将小鼠抗PQQ IgG单抗PQQ-mAb配入，形成 平板A，另一个将琼脂糖-纤维蛋白配入，形成平板B ;②将纳豆芽孢杆菌10261和纳豆芽孢 杆菌10263的诱变融合后代涂布其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平 板A和平板B互为影印平板；③平板A中，高产吡咯喹啉醌的诱变融合后代菌落周围形成肉 眼可见沉淀圈，根据沉淀圈直径大小可肉眼判断产吡咯喹啉醌量大小；④平板B中，高产纳 豆激酶的诱变融合后代菌落周围形成透明圈，根据透明圈直径大小可肉眼判断产纳豆激酶 活力高低；⑤平板A与平板B中，高产吡咯喹啉醌菌落与高产纳豆激酶菌落处于同一位置 者，即为高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌。
3. 根据权利要求2所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的平板豆芽汁玉米汁固体培 养基以IL计，由以下量的组分组成： 玉米汁 100?丨50mL; 蔗糖 4.0?6.0g; 琼脂 1.5?2.0g; 豆芽汁 余量。
4. 根据权利要求1所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的从中筛选出甲硫氨酸营养 缺陷型的干酪乳杆菌，具体包括：①制备2个平板MRS固体培养基，其中一个将甲硫氨酸配 入，为平板C，另一个为单纯MRS固体培养基平板，为平板D ;②将诱变后的干酪乳杆菌涂布 其中一个平板后，再用纤维素膜影印至另一个平板，使平板C和平板D互为影印平板；③在 平板C与平板D的同一位置，平板C出现菌落而平板D未出现菌落，或平板C上的菌落显著 大于平板D上的菌落，则该菌落为甲硫氨酸营养缺陷型干酪乳杆菌。
5. 根据权利要求4所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的平板MRS固体培养基以IL 计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸猛 0.25g; 琼脂 20g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS固体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
6. 根据权利要求1所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆 激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤3)中，在共发酵之前，将纳豆芽 孢杆菌BN-NKPQQ-RWX-301和干酪乳杆菌LcS-Met-分别进行活化培养，纳豆芽孢杆菌 BN-NKPQQ-RWX-301在豆芽汁玉米汁液体培养基中进行活化培养，培养温度为34?36°C，干 酪乳杆菌LcS-Met-在MRS液体培养基中进行活化培养，培养温度为36?38 °C。
7. 根据权利要求6所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的豆芽汁玉米汁液体培养基 以IL计，由以下量的组分组成： 玉米汁 100?150mL ; 鹿糖 4. 0?6. Og ; 豆芽汁 余量； 所述的MRS液体培养基以IL计，由以下量的组分组成： 蛋白胨 lO.Og; 牛肉膏 lO.Og; 酵母膏 5.0g; 柠檬酸氢二铵 2.0g; 葡萄糖 20.0g; 乙酸钠 5.0g; 磷酸氢二钾 2.0g; 硫酸镁 0.58g; 硫酸锰 0.25g; 吐温 80 l.OmL； 水 余量； 该MRS液体培养基的pH值保持在6. 2?6. 4。
8. 根据权利要求1所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含 纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤3)中，将纳豆芽孢杆菌 BN-NKPQQ-RWX-301和干酪乳杆菌LcS-Met-共发酵玉米汁，具体包括：将活化后的纳豆芽孢 杆菌BN-NKPQQ-RWX-301和干酪乳杆菌LcS-Met-混合，形成混合菌液，将混合菌液接种至含 玉米汁的发酵培养基，纱布封口培养后得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁。
9. 根据权利要求8所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的含玉米汁的发酵培养基以 IL计，由以下量的组分组成： 蔗糖 50.0g; 酪氨酸 〇.5g; 谷氨酸 〇.5g; 麦芽糖 20.0g; 口.芽汁 I OOinL; 玉米汁 余量。
10. 根据权利要求1所述的选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶 和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的玉米汁的制备包括：水中加 玉米粒，浸泡2?12小时后，90°C?99°C碾磨成浆汁，得到玉米汁，其中，所述的水的体积与 玉米粒的质量之比为IOOmL : 10?25g。
【专利摘要】本发明公开了一种选育纳豆芽孢杆菌与干酪乳杆菌共发酵制备富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁的方法，包括：将产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌10261和10263分别进行亚硝基胍诱变，然后混合二者诱变后代，进行细胞融合传代培养，高通量筛选得到高产纳豆激酶兼吡咯喹啉醌的纳豆芽孢杆菌；将干酪乳杆菌进行亚硝基胍诱变，从中筛选出甲硫氨酸营养缺陷型的干酪乳杆菌；将筛选出的纳豆芽孢杆菌和干酪乳杆菌共发酵玉米汁，得到富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁。本发明得到的富含纳豆激酶和吡咯喹啉醌的玉米汁中，吡咯喹啉醌含量达到61-88ng/mL，纳豆激酶活力达到737-1113U/mL。
【IPC分类】C12R1-245, C12N15-01, C12R1-07, A23L2-04, A23L1-29, C12N15-03
【公开号】CN104522789
【申请号】CN201410751014
【发明人】阮晖, 徐薇薇, 蔡宇晶, 林永华, 胡慧雯, 张哲滔, 莫凡
【申请人】浙江大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月10日