蛋白水解产物的制作方法
【专利说明】蛋白水解产物
[0001] 酶蛋白水解产物被广泛用于食品产业，它可产自多种蛋白来源（例如乳蛋白或大 豆蛋白）（参见例如 W02002/45524 和 W02008/131008)。
[0002] 可由其得到蛋白水解产物的另一种蛋白来源是血。血含有有价值的蛋白，尤其是 血红蛋白。血红蛋白由与铁结合性血红素化aem)基团相连的球蛋白部分组成。尽管来源 于屠宰场的血红蛋白很丰富，但血红蛋白在食物加工中的用途受到限制。该种情况的主要 原因在于；强烈的颜色、令人不悦的气味和味道在食品中是不期望的。考虑到对便宜的食品 级蛋白的持续兴趣，利用来自屠宰支线的食品级蛋白并提高其产量将是有益和期望的。因 此，对经脱色血红蛋白的脱色、功能、产量和味道方面的任何改进都被认为是极其有利的。 目前，大部分源自动物屠宰支线的血被丢弃，其被视为环境负担。
[0003] 过去已描述了一些使血的血红蛋白级分脱色的方法。它们中有基于利用丙丽、醇 和酸进行化学处理的方法。利用过氧化物漂白也已经被提出。由于其环境因素、食品级特 征、对氨基酸修饰的影响和形成有毒化合物的可能性，所W所有该些化学方法是有争议的。
[0004] 使血红蛋白脱色的替代方法是利用酶法除去血红素基团（参见例如US4, 262, 022 和 I. Aubes-Dufau&D. Combes, Appl. Biochem. Biotechn. , 1997, 67 期.127-137 页）。
[000引 Aubes-Dufau&Combes展示了不同蛋白酶（例如胃蛋白酶、碱性蛋白酶（alcalase) 和曲霉酸性蛋白酶（proctase))对血红蛋白水解产物的苦味的影响。
[0006] US 4, 262, 022公开了利用广谱蛋白酶碱性蛋白酶（Alcalase)(源自 B. licheni化rmis的枯草杆菌蛋白酶）水解血。现有技术所公开的酶法水解血的缺点是W 下风险；过度消化血红蛋白的球蛋白部分，W至于造成苦味水解产物，且所形成的许多小肤 导致其功能有限。
[0007] 血红蛋白还是测定酸性蛋白酶的蛋白水解活性的试验中经常使用的底物。在该个 所谓的皿T试验中，将酸性蛋白酶与变性的血红蛋白一起赔育，赔育之后，用H氯酸沉淀大 的残留肤。然后，通过测量存在于上清液中的小肤的吸光度确定蛋白水解活性。化ang等 人（J. Biochem 80,975-891 (1976)和 Chang&Tak址ashi(L. Biochem 74,231-237(1973)已 应用该种皿T试验来测量来自A. niger的A型和B性酸性蛋白酶的活性，但没有公开该些 酸性蛋白酶在制备用于食物或饲料的蛋白水解产物中的用途。
[0008] US2005/0123932A1涉及核酸馨合剂缀合物，其公开了包含含多组氨酸的重组肤的 肤文库。US2005/0123932未涉及用于食物应用的蛋白水解产物。
[0009] 本发明涉及由血制备蛋白水解产物的经改进方法，其解决了上述难题。
[0010] 发明概沐
[0011] 本公开涉及蛋白水解产物，其具有所述蛋白水解产物中总肤量的至少10%的 C-末端具有组氨酸残基的肤，其中所述肤在C-末端的倒数第二个位置不包含组氨酸残基。 本公开还涉及制备蛋白水解产物的方法和包含所述蛋白水解产物的食物产品。
[0012] 本文所公开的蛋白水解产物的优点为；在所述蛋白水解产物来源于血红蛋白的情 况下，其无色且不展示出与铁相关的苦味和异味；W及具有良好的功能性质，例如保水力 (water-binding capacity)、胶凝性质和乳化性质。
[001引 详细说明
[0014] 本文所公开的蛋白水解产物有利地具有所述蛋白水解产物总肤含量的至少10%， 例如至少15%、20%，例如至少25%或至少30%，或至少35%，例如至少40%的C-末端具 有组氨酸残基的肤。利用LC-MS/MS测量本文中所用的肤含量。
[0015] 本文所公开的蛋白水解产物具有相对于蛋白水解产物中存在的组氨酸的丰度归 一化的至少4个组氨酸C-末端。
[0016] 本文所公开的蛋白水解产物具有至少10%且通常低于25%的水解度值H)。水解 度值H)可在12% -22%之间，或在13% -20%之间，例如在14% -18%之间。有利地，已发 现；在蛋白水解产物来源于血红蛋白的情况下，在该些DH范围内所述水解产物无色。
[0017] 此外，还发现；具有本文所公开的DH范围的蛋白水解产物有利地展示出良好的功 能性（例如乳化作用和凝胶作用）且未显示出苦味。
[0018] 在由血红蛋白制备蛋白水解产物的情况下，还形成血红素级分，可通过在抑为 3-5时沉淀而将其从蛋白水解产物中除去。优选地，在除去血红素级分之后测定来源于血红 蛋白的蛋白水解产物的DH。通常通过测量在405nm的吸光度检测由血红素造成的着色。由 于血红素包含所谓的扑晰中的铁，因此来源于血红蛋白的蛋白水解产物中血红素和铁的存 在是相连的。有利地，获自血红蛋白的蛋白水解产物具有低于l(K)ppm，或低于95或90ppm， 例如低于85ppm的铁含量。铁含量通常高于5、10、20或30ppm。该种低的铁含量有利地降 低了蛋白水解产物的铁味道，并使得蛋白水解产物适用于食物或饲料应用。
[0019] 本文所公开的蛋白水解产物可具有至少为100ml，例如至少500ml，或至少1L或至 少10L或10化或至少1立方米（m 3)的体积。
[0020] 本文所公开的蛋白水解产物可W是液体形式和/或干燥形式（例如冻干形式）。 本领域技术人员知道如何制备液体形式和/或干燥形式的蛋白水解产物。
[002。 本文所公开的蛋白水解产物不包含H氯酸，例如少于l(K)ppm，或少于lOppm或少 于Ippm的H氯酸。如Kim等人（2009) Toxicology, 262期，262号，230-238页中所公开， 可利用HPLC-ESI-MS/MS有利地测定H氯酸。本文所公开的蛋白水解产物可被用于例如制 备食物产品，例如动物产品加工，例如肉和/或器官肉，例如制备香肠或火腿的过程。或者， 可在冷冻肉之前向肉中加入蛋白水解产物，该可使冻肉融化时的水分损失降至最小。
[0022] 或者，本文所公开的蛋白水解产物可被用于制备饲料产品，例如幼愚饲料或宠物 食品。蛋白水解产物可来源于任何合适的来自动物或植物的蛋白来源。来自动物的蛋白来 源可W是血（例如血红蛋白）或乳蛋白（例如酪蛋白）。
[0023] 本公开还涉及制备蛋白水解产物的方法，其特征在于：将蛋白来源与组氨酸特异 性内切蛋白酶一起赔育，W及制备所述蛋白水解产物。我们发现；通过根据本发明将蛋白来 源与组氨酸特异性蛋白酶一起赔育，可W生产出不展示苦味的蛋白水解产物。在蛋白来源 是血红蛋白的情况下，我们发现；可W从血红蛋白水解产物中选择性地除去血红素级分，例 如通过在抑3-5下沉淀。
[0024] 在本文所公开的制备蛋白水解产物的方法中，可W在抑在1-6之间时（例如抑 在2-5之间时，例如抑在2. 5-4. 5之间时）将蛋白来源与组氨酸特异性内切蛋白酶一起赔 育。在根据本发明的方法中蛋白来源包含血红蛋白的情况下，该方法可包括下述步骤；在上 文所公开的抑范围内赔育血红蛋白的步骤和在抑在3-5之间（例如在3. 5-4. 5之间）时 沉淀血红素级分的步骤。
[0025] 在本文所公开的生产蛋白水解产物的方法中，可W使用任意合适量的蛋白来源。 合适量的蛋白来源可W是3-15%重量/体积之间的蛋白质，或者4-12%重量/体积之间的 蛋白质的量，或者5-10%重量/体积之间的蛋白质的量。
[0026] 在根据本发明的方法中，蛋白来源可与蛋白酶一起赔育的合适温度可W在 10-6(TC之间，例如在20-55°C之间，例如在30-5(TC之间。
[0027] 在本文所公开的方法中，组氨酸特异性内切蛋白酶可W纯净形式存在。本文中所 使用的纯净形式的组氨酸特异性内切蛋白酶是组氨酸特异性蛋白酶，或者包含组氨酸特异 性蛋白酶的制剂，其中至少40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的蛋白酶活性 来源于组氨酸特异性蛋白酶，其中蛋白酶活性W如本文所公开的方法中所定义的HPU表 示。曲霉胃蛋白酶（aspergillopepsin)II的生化纯化W及该酶的切割特异性的测定在例 女口 Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J. Barrett, N. D. Rawlings 和 J. F. Woessner 编； Academic Press)中被公开。出乎意料地，我们发现；通过利用曲霉胃蛋白酶II切割组氨 酸残基的C-末端的水解选择性，纯净的曲霉胃蛋白酶II可被用于制备本文所公开的蛋白 水解产物。
[0028] 组氨酸特异性内切蛋白酶可获自任何合适的微生物来源，例如真菌来源。组氨酸 特异性内切蛋白酶可获自Aspergillus sp，例如Aspergillus niger。组氨酸特异性蛋白 酶可W是天冬氨酸内切蛋白酶，术语"曲霉胃蛋白酶II"指的是酶分类EC3. 4. 23. 19。最 近，曲霉胃蛋白酶II还被称为曲霉谷氨酸肤酶，它被归入肤酶家族GUA.J. Barrett, N. D. Rawlings 和 J.F. Woessner 编，2004,化ndbook of Proteolytic Enzymes,第二 片反，Academic Press)。