解片段，经过G-25凝胶过滤进行分离纯化，得到生理活性 较强的分离峰用LC-MS-MS液相色谱气质联用仪鉴定活性肽的一级结构。
[0014] 本发明采用活性检测平台测试各组分的生理活性。抗氧化能力采用羟基自由基 (0HO清除率评价，抗菌活性采用纸平板扩散法检测对金黄色葡萄球菌的抑制作用，降胆固 醇效应采用体外吸附胆酸盐的方法进行评价。
[0015] 本发明将上述活性强的组分用LC-MS-MS液相色谱气质联用法测定活性肽的氨基 酸序列，得到了两个多功能生物活性小肽，经鉴定其一级结构分别是TBHM (丝氨酸-谷氨 酸-丙氨酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-色氨酸）和TBTO5 (天冬氨 酸-丙氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸)。
[0016] 本发明所述苦荞麦生物肽作为饲料添加剂时，其添加比例为基础日粮的1%。本发 明的生物活性肽不仅能调节仔猪肠道菌群平衡、降低仔猪腹泻率和死亡率，还能促进仔猪 生长、提高饲料转化利用率，同时降低血液胆固醇甘油三酯，改善仔猪血液生化指标，提高 免疫力和抗病能力，因此具有较好的市场开发利用前景。
[0017] 本发明所述的苦荞麦生物肽及其制备方法与应用，与现有技术相比具有如下技术 优势： 1、 采用了两步消化酶酶解方法，得到了荞麦生物活性肽； 2、 采用G25分离和LC-MS-MS液相色谱气质联用法确定了活性肽的氨基酸序列； 3、 所获得的活性肽具有多种功能，如抗菌、抗氧化和降胆固醇。
[0018] 本发明的生物活性肽
【具体实施方式】
[0019] 以下通过具体实施例进一步描述本发明，但本领域技术人员应该知晓，所述实施 例并不以任何方式限定本发明的保护范围。
[0020] 实施例1 一种苦荞蛋白提取物酶解产生的抗菌肽的制备方法 苦荞种子粉碎后制得1000 g苦荞粉，脱脂后的用PH7.0磷酸盐缓冲液溶解，室温下搅 拌提取2小时，4 °C离心分离（5000 r/min，30 min)，取上清液。加入硫酸铵使饱和度达到 80%，搅拌1小时，4 °C离心（5000 r/min，30 min)，收集沉淀后复溶，透析48小时候，冻干备 用。将4%胃蛋白酶酶解液加入到苦荞蛋白水溶液，调节pH至2. 0, 37°C水浴震荡酶解1小 时。然后加入4%的胰蛋白酶酶解液，调节pH至7. 5, 37°C水浴继续酶解2小时。接着将水解 液加热至96°C煮5分钟终止酶解，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶解后经Sephadex G-25 凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液（0.02 M，pH7.4)以0.9mL/min流速进行洗脱，紫外检测仪 280nm检测吸光值，收集主要分离峰。过夜透析，冻干保存。将菌种接种于Luria-Bertani (LB)固体培养基上，37°C培养箱中倒置培养。待菌落长出后，用接种环挑取单菌落均匀涂布 于LB固体培养基表面，将经过灭菌的直径为0. 5 cm的小滤纸片粘贴于培养基表面，取10 ML待测样品滴加于滤纸片上。37°C培养箱中倒置培养18-20 h，观察抑菌圈的形成，采用倍 半稀释法计算最小抑菌浓度（MIC)。所得试验结果如下：
【主权项】
1. 一种苦荞麦活性肽的制备方法，其特征在于：包括如下步骤： 一个制备苦荞蛋白提取物的步骤，苦荞种子经干燥、粉碎、脱脂得到苦荞粉；以苦荞粉 为原料，用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，得到苦荞蛋白提取物； 一个酶解苦荞蛋白提取物的步骤，将步骤1)制备得到的苦荞蛋白提取物分别经胃蛋白 酶和胰蛋白酶依次酶解制备得到多肽酶解片段； 一个制备苦荞麦活性肽的步骤，将多肽酶解片段经过凝胶过滤进行分离纯化，紫外检 测仪280nm检测，并收集分离峰，即可得到苦荞麦活性肽。
2. 如权利要求1所述的苦荞麦活性肽的制备方法，其特征在于：在所述的一个制备苦 荞蛋白提取物的步骤中，采用硫酸铵盐析法制备苦荞蛋白提取物，苦荞籽粒经干燥后粉碎 制备得苦荞粉，采用石油醚脱脂，将脱脂后的苦荞粉采用PH7. O磷酸盐缓冲液室温下搅拌 提取1~4小时，然后1~6 °C离心分离收集上清液，其中离心转速为3000~7000 r/min，离心 时间为20~60 min ;向上清液中加入硫酸铵使饱和度达到80%以上，搅拌0. 5~2小时，1~6°C 离心，离心转速为3000~7000r/min，离心时间为20~40 min，收集沉淀得苦荞蛋白提取物。
3. 如权利要求1所述的苦荞麦活性肽的制备方法，其特征在于：在一个酶解苦荞蛋白 提取物的步骤中，将苦荞蛋白提取物复溶得苦荞蛋白水溶液，向苦荞蛋白水溶液加入质量 百分比浓度为3~5%的胃蛋白酶酶解液，调节pH至2. 0, 30~40°C水浴震荡酶解0. 5~1. 5小 时；然后加入质量百分比浓度为3~5%的胰蛋白酶酶解液，调节pH至7. 5, 30~40°C水浴继续 酶解1~3小时，接着将水解液加热至，90~98°C煮3~6分钟终止酶解，冻干保存。
4. 如权利要求1所述的苦荞麦活性肽的制备方法，其特征在于：在一个制备苦荞麦活 性肽的步骤中，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶解后经凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液以 0. 5~1. 2mL/min流速进行洗脱，每18~22分钟收集一管，紫外检测仪280nm检测吸光值，收 集主要分离峰，过夜透析，冻干保存。
5. 如权利要求4所述的苦荞麦活性肽的制备方法，其特征在于：所述的磷酸盐缓冲液 的浓度为0.02 M，pH为7. 4。
6. -种苦荞麦活性肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
7. -种苦荞麦活性肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。
8. 权利要求6所述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。
9. 权利要求7所述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。
【专利摘要】本发明一种苦荞麦活性肽的制备方法，将苦荞种子经干燥、粉碎、脱脂得到苦荞粉；以苦荞粉为原料，用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，得到苦荞蛋白提取物；将苦荞蛋白提取物经胃蛋白酶和胰蛋白酶依次酶解制备得到多肽酶解片段；将多肽酶解片段经过凝胶过滤进行分离纯化，紫外检测仪280nm检测，并收集分离峰，即可得到苦荞麦活性肽。本发明通过上述的方法获得了两种新的苦荞麦活性肽。本发明还提供了上述的两种苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。本发明的生物活性肽不仅能调节仔猪肠道菌群平衡、降低仔猪腹泻率和死亡率，还能促进仔猪生长、提高饲料转化利用率，同时降低血液胆固醇甘油三酯，改善仔猪血液生化指标，提高免疫力和抗病能力。
【IPC分类】A23K1-16, A23J3-34, A23J1-12
【公开号】CN104738305
【申请号】CN201510116261
【发明人】李宗杰, 周小理, 夏珂, 周一鸣, 商祥淑
【申请人】上海应用技术学院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月17日