一种苦荞麦活性肽的制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于动物食品领域，尤其涉及一种添加剂，具体来说是一种苦荞麦活性肽 的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 现代养猪生产中，由于养殖环境和养殖技术水平滞后，使得动物在繁殖生长过程 中很难发挥它应有的遗传潜能。为发挥母猪最佳生产性能、减少乳猪疾病感染几率并提高 乳猪生产性能，常采用早期隔离断奶技术。早期断奶乳猪的消化系统尚未发育完善，难以承 受由液体母乳向谷物性固体饲料变换带来的营养应激；乳猪与母畜骤然分离引起的心理应 激；以及重新建群和等级地位确定过程中乳猪个体之间的争斗引起的环境应激。营养、心 理和环境三重应激不可避免地增加断奶后乳猪对环境中潜在病原微生物的敏感性，导致断 奶后乳猪腹泻、采食量下降、烦躁不安、攻击性加强、生长停滞、并发水肿病和抗病力下降等 综合应激，更容易发生消化道菌群失调，引起消化道正常微生物区系被破坏，大肠杆菌、沙 门氏杆菌等致病菌株大量繁殖引发细菌性肠炎。研宄表明，猪是最容易应激的动物种类，而 在集约化养殖过程中，断奶又是最易诱发乳猪应激的关键环节。断奶乳猪的应激往往伴随 乳猪生长的停滞，情况严重时产生僵猪，甚至造成乳猪死亡，给养猪生产业造成巨大经济损 失。
[0003] 长期以来，抗生素在保证动物健康、促进生长、节省饲料和提高经济效益方面起着 非常重要的作用，但长期大量滥用抗生素会带来诸多问题，如病原菌产生耐药性，限制了动 物免疫机能的发挥，降低了动物的免疫力和抗病力，抑制动物肠道有益菌的生长，破坏肠道 微生态平衡，限制动物的生长。很多研宄表明，如果人类长期食用抗生素过量残留的肉类食 品，将会使人类产生对抗生素的耐药性，这不但会产生所谓的'耐药宝宝'、'超级细菌'，而 且给人类健康生存带来严重威胁，因此，世界上很多国家纷纷禁止或限制饲用抗生素的使 用。欧盟自2006年1月1日起，全面禁止在动物饲料中使用抗生素，日本从2008年就开始 禁止所有抗生素动物饲料中使用，韩国政府从2011年7月1日全面禁止在动物饲料中添加 抗生素，而我国在饲料行业中，乳猪饲料添加剂中大量添加抗生素现象仍然比较普遍，造成 动物产生耐药性或抗药性、免疫功能降低、抗病能力下降、猪肉中有抗生素残留等问题，给 人们生活带来了恐慌。另外，由于微量元素在动物生长和肠道健康控制中起到非常关键的 作用，在饲料行业中过量添加现象也普遍存在，尤其是铜和锌。而且由于传统的无机微量元 素消化利用率低，过量添加必然产生过量排放，这不但造成浪费，而且给环境造成污染，近 年来出现的海水赤潮和毒粮食现象都跟畜牧业有关联。因此，提供一种腹泻率低、消化利用 率高、采食量和生长发育较为良好适用于集约化养殖模式下非抗生素类环保饲料或环保饲 料添加剂显得尤为重要。
[0004] 荞麦全植株含有多种营养化学成分，包括丰富的蛋白质、脂肪、膳食纤维、矿物元 素以及植物留醇、黄酮类物质等稀有化合物，尤其是苦荞优质的氨基酸组成比例平衡，营养 价值明显比小麦、玉米等其他谷类作物高得多。从荞麦种子种分离得到的活性肽具有抗菌、 抗氧化、降胆固醇和抗肿瘤等作用。荞麦种子蛋白含量丰富，种类较多，包括清蛋白、球蛋 白、谷蛋白和醇溶蛋白四种类型，研宄表明将荞麦蛋白提取物水解成小的多肽片段后，能显 著增强抗氧化等生理活性。 CN 101701036 A提供了一种抗真菌肽，是从苦荞种子水溶性提取物中纯化得到的， 分子量为3. 909kDa的多肽。该抗真菌肽的制备方法是取苦荞种子粉碎，脱脂，使用缓冲 液抽提，经抽提获得粗蛋白后，经过热处理，蛋白质层析分离即Resource S阳离子交换和 Superdex peptide凝胶排阻层析纯化而获得。该抗真菌肽对白腐菌，绿色木霉和链格孢霉 的生长有显著的抑制作用。该抗真菌肽可作为食品防腐添加剂，农作物抗真菌侵害的药物 等，在食品防腐以及农作物防病、抗病方面具有实用价值。
【发明内容】
[0005] 针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种苦荞麦活性肽的制备方法和 应用，通过本发明的方法获得的苦荞麦活性肽具有抗菌、抗氧化和吸附胆酸盐活性，饲喂仔 猪后能提高生长性能，降低腹泻率、死亡率。
[0006] 本发明还提供了一种苦荞麦活性肽的制备方法，包括如下步骤： 1) 一个制备苦荞蛋白提取物的步骤，苦荞种子经干燥、粉碎、脱脂得到苦荞粉；以苦荞 粉为原料，用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，得到苦荞蛋白提取物； 2) -个酶解苦荞蛋白提取物的步骤，将步骤1)制备得到的苦荞蛋白提取物分别经胃蛋 白酶和胰蛋白酶依次酶解制备得到多肽酶解片段； 3) -个制备苦荞麦活性肽的步骤，将多肽酶解片段经过凝胶过滤进行分离纯化，紫外 检测仪280nm检测，并收集分离峰，即可得到苦荞麦活性肽。
[0007] 进一步的，在所述的一个制备苦荞蛋白提取物的步骤中，采用硫酸铵盐析法制备 苦荞蛋白提取物，苦荞籽粒经干燥后粉碎制备得苦荞粉，采用石油醚脱脂，将脱脂后的苦荞 粉采用PH7. 0磷酸盐缓冲液室温下搅拌提取1~4小时，然后1~6 °C离心分离收集上清液， 其中离心转速为3000~7000 r/min，离心时间为20~60 min ;向上清液中加入硫酸按使饱和 度达到80%以上，搅拌0. 5~2小时，1~6°C离心，离心转速为3000~7000r/min，离心时间为 20~40 min，收集沉淀得苦荞蛋白提取物。
[0008] 进一步的，在一个酶解苦荞蛋白提取物的步骤中，将苦荞蛋白提取物复溶得苦荞 蛋白水溶液，向苦荞蛋白水溶液加入质量百分比浓度为3~5%的胃蛋白酶酶解液，调节pH至 2. 0,30~40°C水浴震荡酶解0. 5~1. 5小时；然后加入质量百分比浓度为3~5%的胰蛋白酶酶 解液，调节pH至7. 5, 30~40°C水浴继续酶解1~3小时，接着将水解液加热至90~98°C煮3~6 分钟终止酶解，冻干保存。
[0009] 进一步的，在一个制备苦荞麦活性肽的步骤中，将苦荞蛋白酶解产物的冻干粉溶 解后经凝胶色谱层析，用磷酸盐缓冲液以0. 5~1. 2mL/min流速进行洗脱，每18~22分钟收集 一管，紫外检测仪280nm检测吸光值，收集主要分离峰，过夜透析，冻干保存。
[0010] 进一步的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为〇. 02 M，pH为7. 4。
[0011] 本发明还提供了一种苦荞麦活性肽，其氨基酸序列为丝氨酸-谷氨酸-丙氨 酸-甘氨酸-缬氨酸-苏氨酸-谷氨酸-异亮氨酸-色氨酸。（如SEQ ID NO: 1所示。） 本发明还提供了另外一种苦荞麦活性肽，其氨基酸序列为天冬氨酸-丙氨酸-异亮氨 酸-异亮氨酸-甘氨酸-脯氨酸-精氨酸。（如SEQ ID NO :2所示。） 本发明还提供了上述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。
[0012] 本发明还提供了上述的苦荞麦活性肽作为饲料添加剂的应用。
[0013] 本发明通过采用硫酸铵盐析法提取苦荞水溶性蛋白，经过1小时胃蛋白酶酶解和 2小时胰蛋白酶酶解制备多肽酶