专利名称：抗体和免疫偶联物及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗⑶22抗体及其免疫偶联物。本发明进一步涉及使用抗⑶22抗体及其免疫偶联物的方法。
背景技术：
淋巴细胞是造血过程中在骨髓中生成的许多类型白血球之一。有两大类淋巴细胞B淋巴细胞(B细胞)和T淋巴细胞(T细胞)。本文中特别感兴趣的淋巴细胞是B细胞。B细胞在骨髓内成熟，然后离开骨髓并在其细胞表面上表达抗原结合抗体。当幼稚B细胞初次遭遇其膜结合抗体对之特异性的抗原时，该细胞开始快速分裂且其后代分化成记忆B细胞和称作“浆细胞”的效应细胞。记忆B细胞具有较长的寿命并继续表达与最初的亲本细胞具有相同特异性的膜结合抗体。浆细胞不生成膜结合抗体，但改为生成可分泌形式的抗体。分泌型抗体是体液免疫的主要效应分子。B细胞相关病症包括但不限于恶性淋巴瘤(非何杰金氏淋巴瘤(Non-Hodgkin’ slymphomas, NHL))、多发性骨髓瘤和慢性淋巴细胞性白血病(CLL，B细胞白血病(⑶5+B淋巴细胞))。非何杰金氏淋巴瘤(NHL)(主要源自B淋巴细胞的不同种类的一组癌症)代表所有新诊断癌症中的大约 4%(Jemal，A.等，CA-Cancer J Clin, 52:23-47, (2002))。攻击性NHL 占据成人 NHL 的大约 30-40%(Harris, N. L.等，Hematol. J. 1:53-66 (2001))，并包括弥散性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、外周T细胞淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤。一线组合化疗治愈不到一半的攻击性NHL患者，而大多数患者最终死于他们所患疾病(Fisher, R.1., Semin.Oncol. 27 (suppll2):2-8(2000))。B细胞相关病症还包括自身免疫性疾病。自身免疫性疾病仍然是临床上重要的人类疾病。顾名思义，自身免疫性疾病通过身体自己的免疫系统起作用。虽然自身免疫性疾病的各个类型间病理学机制不同，但是一种普遍的机制涉及某些抗体(本文中称为自身反应性抗体或自身抗体)对身体的内源性蛋白质的结合。内科医生和科学家已经鉴定了超过70种临床上不同的自身免疫性疾病，包括类风湿性关节炎、多发性硬化、血管炎、免疫介导的糖尿病、和狼疮(诸如系统性红斑狼疮)。虽然许多自身免疫性疾病是罕见的(影响不到200，000个体)，总的来说，这些疾病折磨着数百万美国人(估计占5%的人口)，其中大多数疾病不成比例地影响着妇女。这些疾病的慢性特性导致极大的社会和财政负担。 靶向B细胞表面抗原的细胞毒剂是B细胞相关癌症疗法的重要焦点。这样的一种B 细胞表面抗原是 CD20。利妥昔单抗(Rituximab) (Rituxan; Genentech, Inc. (South SanFrancisco, CA)和 IDEC Pharmaceutical Corp. (SanDiego, CA))(一种嵌合(小鼠 / 人)抗CD20单克隆抗体)是由美国食品和药品管理局批准的第一种用于治疗复发性或顽固性低级或滤泡性 NHL 的治疗性抗体(Leonard, J. P.等，Clin. Cane. Res. 10:5327-5334 (2004))。其它B细胞抗原(诸如⑶19、⑶22和⑶52)代表潜在用于治疗淋巴瘤的治疗剂的革巴物(Grillo-Lopez A. J.等，Curr Pharm Biotechnol, 2:301-11 (2001))。CD22 是仅在分化的成熟期在B细胞表面上表达的135kDaB细胞限定的(B-cell-restricted)唾液酸糖蛋白(Dorken, B.等，J.1mmunol. 136:4470-4479 (1986))。CD22 在人中的最主要形式是CD22 0，其含有胞外结构域中的7个免疫球蛋白超家族结构域(
图1) (Wilson, G. L.等，J.Exp. Med. 173:137-146 (1991)) ο 一种变体形式即CD22a缺乏免疫球蛋白超家族结构域3和 4(Stamenkovic,1.和 Seed, B.，Nature345:74-77 (1990))。已经显示了对人 CD22 的配体结合与免疫球蛋白超家族结构域I和2 (也称为表位I和2)有关(Engel，P.等，J. Exp.Med.181:1581-1586(1995))。在B细胞NHL中，⑶22表达在攻击性和无痛性群体中的范围分别从91%至99%(Cesano1A.等，BloodlOO:350a(2002))。CD22不仅可充当B细胞活化复合体的成分(Sato, S.等，Semin.1mmunol. 10:287-296 (1998))还可充当粘着分子(Engel, P.等，J.1mmunol. 150:4719-4732 (1993))。CD22缺陷小鼠的B细胞具有较短的寿命和增强的凋亡，这表明该抗原在B细胞存活中起关键作用(0tipoby，K. L.等，Nature (Lond) 384:634-637(1996))。在与其天然配体或抗体结合后，CD22被快速地内在化，这在初级B细胞中提供有力的共刺激信号并在赘生性B细胞中提供促凋亡信号(proapoptotic signal) (Sato, S.等，Immunity5:551-562 (1996))。
已经研究了抗⑶22抗体作为用于B细胞癌症和其它B细胞增殖性疾病的潜在疗法。此类抗 CD22 抗体包括 RFB4 (Mansfield, E.等，Blood90:2020-2026 (1997))、CMC-544(DiJoseph, J. F.，Bloodl03:1807-1814 (2004))和 LL2(Pawlak-Byczkowska, E.J.等，Cancer Res. 49:4568-4577 (1989))。LL2 抗体(以前称为 HPB-2)是针对 CD22 抗原的IgG2a小鼠单克隆抗体(Pawlak-Byczkowska, E. J.等(1989)，见上文)。体外免疫组织学评估证明了 LL2抗体对51个所测试的B细胞NHL标本中的50个有反应性，但对其它恶性肿瘤或正常非淋巴样组织没有反应性(Pawlak-Byczkowska (1989)，见上文；Stein, R.等，Cancer Immunol.1mmunother. 37:293-298 (1993))。抗体-药物偶联物用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即在癌症治疗中杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的应用(Syrigos和Epenetos (1999) AnticancerResearch19:605-614;Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv. Drg Del.Rev. 26:151-172;美国专利4975278))容许将药物模块靶向投递至肿瘤并在其中进行胞内蓄积，在那里系统施用这些未偶联的药物可导致在试图消除肿瘤细胞的同时也对正常细胞产生了不可接受的毒性水平(Baldwin 等(1986) Lancetpp. (Mar. 15, 1986) : 603-05; Thorpe, (I985)"Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review",于Monoclonal Antibodies' 84:BiologicalAnd Clinical Applications, A. Pinchera 等编，pp. 475-506)。由此寻求最高的功效与最低的毒性。已经报道多克隆抗体和单克隆抗体在这些策略中都是有用的(Rowland等(1986) Cancer Immunol.1mmunother. ,21:183-87)。用于这些方法的药物包括柔红霉素、多柔比星、甲氨蝶呤和长春地辛(Rowland 等,Cancer Tmmun ο1.1mmunother. 21:183-87 (1986))。用于抗体-毒素偶联物的毒素包括细菌毒素(诸如白喉毒素)、植物毒素(诸如蓖麻毒蛋白)、小分子毒素(诸如格尔德霉素)(Kerr 等(1997)Bioconjugate Chem. 8 (6) : 781-784;Mandler 等(2000) Journal ofthe Nat. Cancer Inst.92 (19):1573-1581;Mandler 等(2000)Bioorganic & Med. Chem.Lettersl0:1025-1028;Mandler 等(2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791)、美登木素生物碱(EP 1391213; Liu 等(1996)Proc. Natl. Acad. Sc1. USA93:8618-8623)和加利车霉素(Lode 等(1998)CancerRes. 58:2928;Hinman 等(1993)Cancer Res. 53:3336-3342)。毒素可以通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制实现其细胞毒性和细胞抑制性效果(Meyer, D. L.和 Senter, P. D.，“Recent Advances in AntibodyDrugConjugates for Cancer Therapy，，，于 Annual Reports in MedicinalChemistry,卷38(2003)章23，页229-237)。有些细胞毒性药物在偶联至大的抗体或蛋白质受体配体时趋于失活或活性降低。ZLVALlN (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性 B淋巴细胞表面上发现的⑶20抗原的鼠IgGl K单克隆抗体与111In或9°Y放射性同位素通过硫脲接头-螯合剂相结合而构成的·抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000) Eur.Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77;Wiseman等(2002)Blood99(12):4336-42;Witzig等(2002)J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63;Witzig 等(2002) J. Clin. Oncol. 20(15) :3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYL0TARG (gemtuzumab ozogamicin, WyethPharmaceuticals)(由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体_药物偶联物)在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future (2000) 25 (7) :686;美国专利 No. 4970198; 5079233; 5585089; 5606040; 5693762; 5739116; 5767285; 5773001)。Cantuzumab mertansine (Immunogen, Inc.)(由 huC242 抗体与美登木素生物喊药物模块DMl经二硫化物接头SPP连接而构成的抗体-药物偶联物)正开发用于治疗表达CanAg抗原的癌症，诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌。MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZLBiologies, Immunogenlnc.)(由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DMl连接而构成的抗体-药物偶联物)正在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。相同的美登木素生物碱药物模块DMl经非二硫化物接头SMCC与小鼠鼠单克隆抗体TA.1连接(Chari等(1992)Cancer Research52:127-131)。据报道,该偶联物的效力比相应的二硫化物接头偶联物的效力低200倍。其中认为SMCC接头是“不可切割的”。已经从海洋软体动物耳状截尾海兔(Dolabella auricularia)中分离出数种短肽化合物，并发现它们具有生物学活性(Pettit等(1993) Tetrahedron49:9151; Nakamura等(1995)Tetrahedron Letters36:5059-5062;Sone 等(1995)Journal Org Chem. 60:4474)。还制备出这些化合物的类似物，并且发现有些具有生物学活性(对于综述，参见Pettit等
(1998)Ant1-Cancer Drug Designl3:243-277)。例如，auristatin E (US5635483)是海洋天然产物多拉司他汀10(—种通过结合至微管蛋白上与抗癌药长春新碱相同的位点来抑制微管蛋白聚合的药剂(G. R. Pettit (1997)Prog. Chem. Org. Nat. Prod. 70:1-79))的合成类似物。多拉司他汀10、auristatin PE和auristatin E是具有四个氨基酸(其中三个对于多拉司他汀类化合物是独特的)和C末端酰胺的线性肽。
将auristatin 妝，auristain E(AE)和 monomethylauristatin(MMAE),多拉司他汀的合成类似物偶联至(i)嵌合单克隆抗体cBR96 (对癌瘤上的Lewis Y特异性的)；
(ii)对血液学恶性肿瘤上的CD30特异性的cACIO (Klussman等(2004), BioconjugateChemistryl5(4):765-773;Doronina 等(2003)NatureBiotechnology21(7):778-784; “MonomethyIvaline Compounds Capable ofConjugation to Ligands，，；Francisco 等(2003)Bloodl02 (4) : 1458-1465; US2004/0018194) ；(iii)抗 CD20 抗体，诸如 Rituxan M利妥昔单抗)(W004/032828)，用于治疗表达⑶20的癌症和免疫病症；(iv)抗EphB2抗体2H9和抗 IL-8,用于治疗结肠直肠癌(Mao 等(2004) Cancer Research64 (3) : 781-788) ;(v)E_ 选择蛋白抗体(Bhaskar 等(2003)Cancer Res. 63:6387-6394);和(vi)其它抗 CD30 抗体(W003/043583)。还已经将 monomethylauristatin (MMAE)偶联至 2H9,即一种针对 EphB2R的抗体，EphB2R是小鼠和人之间具有密切同源性的I型TM酪氨酸激酶受体，而且在结肠直肠癌细胞中过表达(Mao 等(2004)Cancer Res. 64:781-788)。已经报道monomethylauristatin MMAFC一种在C末端具有苯丙氨酸的auristatinE(MMAE)变体)(US5767237;US6124431)比MMAE具有更低的效力，但在偶联至单克隆抗体时具有更高的效力(Senter 等，Proceedings of theAmerican Association for CancerResearch,卷 4δ,摘要号 623，2004 年 3 月 28 日)。将 Auristatin F 苯二胺(AFP) (MMAE的一种苯丙氨酸变体)连接至抗⑶70单克隆抗体1F6，经1F6的C末端通过苯二胺间隔物来实现(Law 等,Proceedingsof the American Association for Cancer Research,卷 45,摘要号625，2004年3月28日)。还已经研究了抗⑶22抗体-毒素偶联物作为潜在的治疗性化合物。例如，早期报道描述了针对抗CD22的含有篤麻毒蛋白A链的免疫毒素作为潜在的抗癌剂(May, R.D.等，Chemical Abstractsl06(21):168656x pages35-36(1987);Ghetie, M. A.等，CancerResearch48:2610-2617 (1988);及 Amlot’P. L.等，Blood82(9) : 2624-2633 (1993))。若毒素是放射性同位素，Epratuzumab即LL2的人源化(⑶R嫁接的)IgGl型式已经显示了放射性免疫偶联物的治疗活性的证据(Juweid, Μ. Ε.等，Clin. Cancer Res. 5 (SuppllO) : 3292s_3303s (1999) ; Griffiths, G. L.等，J. Nucl. Med. 44:77-84 (2003) ; Linden, 0.等,Clin. CancerRes.5(suppll0):3287s_3291s(1999))。本领域中需要别的药物以治疗各种B细胞相关癌症，诸如淋巴瘤，诸如非何杰金氏淋巴瘤和其它B细胞增殖性病症。对于该目的特别有用的药物包括靶向B细胞的抗CD22抗体-药物偶联物，其具有显著更低的毒性，但仍具有有用的治疗功效。本发明解决了过去的这些和其它限制和问题。本申请中的任何参考文献的叙述不是承认该参考文献是本申请的现有技术。将本文中所引用的所有参考文献(包括专利、专利申请和出版物)完整收入本文作为参考。发明 概述本发明提供了抗⑶22抗体及其使用方法。在一个方面，提供了一种结合⑶22的抗体，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种HVR,其选自(I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；
(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(4)HVR-Ll，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；(5)HVR_L2，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；和(6)HVR_L3，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在另一个方面，结合CD22的抗体包含(a)HVR-Ll，其包含SEQ IDN0:10的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自(I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(4)HVR_L2，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；和(5)HVR_L3，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在另一个方面，结合CD22的抗体包含(a)HVR-Ll，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自(I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(2)HVR-H2，其包 含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(3)HVR-H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；(4)HVR-L2，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；和(5)HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在另一个方面，结合CD22的抗体包含(a)HVR_H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自(I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列；(3)HVR-Ll，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；(4)HVR_L2，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；和(5)HVR_L3，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在另一个方面，结合CD22的抗体包含(a)HVR_H3，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自(I)HVR-Hl，其包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列；(2)HVR-H2，其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列； (3) HVR-Ll，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列；(4)HVR_L2，其包含SEQ ID NO: 12的氨基酸序列；和(5)HVR_L3，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体包含HVR-Ll，其包含SEQ ID NO: 10的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体进一步包含=HVR-Hl，其包含SEQ IDNO: 2的氨基酸序列；和HVR-H2，其包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列。在一个实施方案中，该抗体进一步包含HVR-L2，其包含SEQ NO: 12的氨基酸序列；和HVR-L3，其包含SEQ ID NO: 14的氨基酸序列。在某些实施方案中，任何上述抗体进一步包含至少一种框架，其选自VH亚组III共有框架和VL亚组I共有框架。在一个方面，提供了一种结合⑶22的抗体，其中该抗体包含重链可变域，其与SEQID NO: 16的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQID NO: 16的重链可变域。在一个方面，该抗体进一步包含轻链可变域，其与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO: 17的轻链可变域。在一个方面，该抗体进一步包含轻链可变域，其与SEQ ID NO: 18的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含SEQ ID NO: 18的轻链可变域。在一个实施方案中，该抗体包含重链可变域，其与SEQ ID N0:16的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性；和轻链可变域，其与SEQ ID NO: 17的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一个实施方案中，该抗体包含重链可变域，其与SEQ IDNO: 16的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性；和轻链可变域，其与SEQ ID NO: 18的氨基酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的序列同一性。在一个实施方案中，重链可变域包含SEQID NO: 16的氨基酸序列，且轻链可变域包含SEQ ID NO: 17的氨基酸序列。在一个实施方案中，重链可变域包含SEQ ID NO: 16的氨基酸序列，且轻链可变域包含SEQ ID NO: 18的氨基酸序列。在某些实施方案中,提供了编码任何上述抗体的多核苷酸。在一个实施方案中，提供了包含该多核苷酸的载体。在一个实施方案中，提供了包含该载体的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞是真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方案中，提供了制备抗⑶22抗体的方法,其中该方法包括在适于表达编码该抗体的多核苷酸的条件下培养该宿主细胞，和分离该抗体。在一个方面，提供了一种结合细胞表面上所表达的⑶22的抗体。在一个实施方案中，该抗体结合人或鼠CD22中包含结构域I或结构域2或结构域I和2的区域内的表位。在一个实施方案中，该细胞是哺乳动物细胞。在一个实施方案中，该细胞是人细胞。在一个实施方案中，该细胞是癌细胞。在一个实施方案中，该细胞是B细胞。在一个实施方案中，该癌细胞是B细胞。在某些实施方案中，任何上述抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，该抗体是抗体片段，其选自Fab、Fab’ _SH、Fv、scFv或(Fab’)2片段。在一个实施方案中，该抗体是人源化的。在一个实施方案中，该抗体是人的。在一个方面，提供了一种检测CD22在生物学样品中存在的方法，该方法包括将该生物学样品与任何上述抗体在容许该抗体结合CD22的条件下接触，和检测该抗体和CD22之间是否形成复合物。在一个实施方案中，该生物学样品包含B细胞。在一个实施方案中，该生物学样品来自经历或怀疑经历B细胞病症和/或B细胞增殖性病症的哺乳动物，该病症包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。在一个方面，提供了一种诊断与CD22表达升高有关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括将测试细胞与任何上述抗体接触；通过检测该抗体对CD22的结合来测定CD22的表达水平；和比较该测试细胞的⑶22表达水平和对照细胞的⑶22表达水平，其中测试细胞的⑶22表达水平高于对照细胞的⑶22表达水平表明存在与⑶22表达升高有关的细胞增殖性病症。在一个实施方案中，该测试细胞是来自怀疑患有细胞增殖性病症(诸如B细胞增殖性病症)的患者的细胞。在一个实施方案中，该细胞增殖性病症选自B细胞病症，包括但不限于淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、攻击性NHL、复发性攻击性NHL、复发性无痛性NHL、顽固性NHL、顽固性无痛性NHL、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、小淋巴细胞淋巴瘤、白血病、毛细胞白血病(HCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)和套细胞淋巴瘤。在一个实施方案中，该方法包括测定该测试细胞表面上的⑶22表达水平，和比较测试细胞表面上的⑶22表达水平与对照细胞表面上的⑶22表达水平。在一个方面，提供了一种诊断与表达CD22的细胞(诸如B细胞)增加有关的细胞增殖性病症的方法，该方法包括将生物学样品中的测试细胞与任何上述抗体接触；通过检测该抗体对CD22的结合来测定结合至该样品中测试细胞的抗体的水平；和比较结合至对照样品中细胞的抗体的水平，其中将所结合的抗体的水平相对于测试和对照样品中表达CD22的细胞数进行标准化，且其中测试样品中所结合的抗体的水平高于对照样品中所结合的抗体的水平表明存在与表达CD22的细胞有关的细胞增殖性病症。在一个方面，提供了一种检测血液或血清中的可溶性⑶22的方法，该方法包括将来自怀疑经历B细胞增殖性病症的哺乳动物的血液或血清测试样品与本发明的抗CD22抗体接触，和检测测试样品中可溶性CD22相对于来自正常哺乳动物的血液或血清的对照样品中可溶性CD22的升高。在一个实施方案中，该检测方法可用作一种诊断与哺乳动物血液或血清中可溶性CD22升高有关的B细胞增殖性病症的方法。在一个方面，本 发明的抗体包括半胱氨酸改造抗体，其中用游离半胱氨酸氨基酸替代亲本抗体的一个或多个氨基酸，正如W02006/034488中所披露的(完整收入本文作为参考)。可以对任何形式的抗⑶22抗体进行如此改造，即突变。例如，可以改造亲本Fab抗体片段以形成半胱氨酸改造的Fab，在本文中称为“ThioFab”。类似地，可以改造亲本单克隆抗体以形成“ThioMab”。应当注意，单位点突变在ThioFab中产生单个改造的半胱氨酸残基，而单位点突变在ThioMab中产生两个改造的半胱氨酸残基，由于IgG抗体的二聚体特性。本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体包括单克隆抗体，人源化的或嵌合的单克隆抗体，及抗体的抗原结合片段、融合多肽和类似物，其优先结合细胞相关CD22多肽(cell-associated CD22polypeptide)。或者,半胱氨酸改造抗体可以包括下述抗体,其在抗体或Fab中在本文中所公开的位置包含半胱氨酸，该抗体由抗体的序列设计和/或选择产生，而不必改变亲本抗体，诸如通过噬菌体展示抗体设计和选择或经由轻链和/或重链框架序列和恒定区的重新设计。半胱氨酸改造抗体包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，其具有范围为O. 6至1.0 ;0. 7至1.0 ;或O. 8至1. O的硫醇反应性值。游离的半胱氨酸氨基酸指已经被改造入亲本抗体且不是二硫桥的一部分的半胱氨酸残基。半胱氨酸改造抗体可用于在改造的半胱氨酸位点附着细胞毒性化合物和/或成像化合物，例如经由马来酰亚胺或卤代乙酰基。Cys残基的硫醇官能度对马来酰亚胺基团的亲核反应性比蛋白质中任何其它氨基酸官能度(诸如赖氨酸残基的氨基或N末端氨基)高大约1000倍。碘代乙酰基和马来酰亚胺试剂中的硫醇特异性官能度可以与胺基团起反应，但需要较高的pH(>9. O)和较长的反应时间(Garman, 1997, Non-Radioactive Labelling:A Practical Approach, AcademicPress, London)。在一个实施方案中，本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体包含任何一个如下位置的改造的半胱氨酸，其中该位置是轻链中依照Kabat等的编号(参见Kabat等(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版，Public HealthService, National Institutes of Health, Bethesda, MD)和重链(包括 Fe 区)中依照 EU 编号方式(参见Kabat等(1991)，见上文)的编号，其中通过在图17A中划下划线来描述的轻链恒定区开始于第108位(Kabat编号方式)，且通过在图17B和17C中划下划线来描述的重链恒定区开始于第118位(EU编号方式)。该位置还可以通过其在图17A-17C中所示全长轻链或重链的氨基酸顺序编号方式中的位置来提到。依照本发明的一个实施方案，抗CD22抗体包含LC-V205C处的改造的半胱氨酸(Kabat编号Val205 ;图17A中顺序编号210，在那个位置改造成Cys)。在图17A中以粗体、双下划线文本显示了轻链中改造的半胱氨酸。依照一个实施方案，抗⑶22抗体包含HC-Al 18C处的改造的半胱氨酸(EU编号Alall8;图17B中顺序编号121，在那个位置改造成Cys)。在图17B中以粗体、双下划线文本显示了重链中改造的半胱氨酸。依照一个实施方案，抗⑶22抗体包含Fc-S400C处的改造的半胱氨酸(EU编号Ser400;图17C中顺序编号403，在那个位置改造成Cys)。在图17C中以粗体、双下划线文本显示了重链Fe区中的改造的半胱氨酸。在其它实施方案中，重链(包括Fe区)的改造的半胱氨酸位于任何一个下列位置(依照EU编号方式):41、88、116、118、120、171、282、375或400。如此，本发明的亲本抗⑶22抗体在这些位置上的氨基酸改变是A41C、A88C、S116C、A118C、T120C、A171C、V282C、S375C或S400C。在其它实施方案中，轻链的改造的半胱氨酸位于任何一个下列位置(依照Kabat编号方式)15、43、110、144、168、205。如此,本发明的亲本抗CD22抗体在这些位置上的氨基酸改变是V15C、A43C、V110C、A144C、S168C或V205C。
半胱氨酸改造抗CD22抗体包含一个或多个游离的半胱氨酸氨基酸，其中该半胱氨酸改造抗⑶22抗体结合⑶22多肽，且是通过包括用半胱氨酸替代亲本抗⑶22抗体的一个或多个氨基酸残基的方法来制备的，其中该亲本抗体包含至少一种HVR序列，其选自(a) HVR-Ll 序列 RSSQSIVHSNGNTFLE (SEQ ID NO: 9)或序列 RSSQSIVHSVGNTFLE (SEQID NO: 10)(图 2B)；(b)HVR-L2 序列 KVSNRFS(SEQ ID NO: 12)(图 2B)；(c)HVR-L3 序列 FQGSQFPYT(SEQ ID NO: 14)(图 2B)；(d)HVR-Hl 序列 GYEFSRSWMN(SEQ ID NO:2)(图 2A);(e)HVR-H2 序列 GRIYP⑶⑶TNYSGKFKG(SEQ ID NO:4)(图 2A);和(f)HVR-H3 序列 DGSSWDWYFDV(SEQ ID N0:6)(图 2A)。在某个方面中，本发明涉及一种半胱氨酸改造抗CD22抗体，其包含与具有如本文中所公开的全长氨基酸序列的半胱氨酸改造抗体具有至少约80%氨基酸序列同一性，或者至少约 81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%氨基酸序列同一性的氨基酸序列；或缺乏如本文中所公开的信号肽的半胱氨酸改造抗体。在又一个方面中，本发明涉及一种分离的半胱氨酸改造抗⑶22抗体，其包含由如下核苷酸序列所编码的氨基酸序列，该核苷酸序列能与编码下列各项的DNA分子的互补链发生杂交(a)半胱氨酸改造抗体，其具有如本文中所公开的全长氨基酸序列，(b)半胱氨酸改造抗体氨基酸序列，其缺乏如本文中所公开的信号肽，(C)跨膜的半胱氨酸改造抗体蛋白的胞外结构域，其带有或不带有如本文中所公开的信号肽，(d)由任何在本文中所公开的核酸序列所编码的氨基酸序列，或(e)如本文中所公开的全长的半胱氨酸改造抗体氨基酸序列的任何其它明确限定的片段。在一个具体的方面中，本发明提供了一种分离的半胱氨酸改造抗CD22抗体，其不带有N末端信号序列和/或不带有起始甲硫氨酸，并且是由编码如本文中所描述的氨基酸序列的核苷酸序列所编码的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从该细胞培养物中回收半胱氨酸改造抗体。本发明的另一个方面提供了一种分离的半胱氨酸改造抗CD22抗体，其或是跨膜结构域删除的或是跨膜结构域失活的。其产生方法在本文中也有描述，其中那些方法包括在适于表达半胱氨酸改造抗体的条件下培养包含含有合适的编码核酸分子的载体的宿主细胞和从该细胞培养物中回收半胱氨酸改造抗体。
在其它实施方案中，本发明提供了分离的抗CD22嵌合半胱氨酸改造抗体，其包含与异源(非CD22)多肽融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。此类嵌合分子的例子包括与异源多肽(诸如例如表位标签序列或免疫球蛋白Fe区)融合的任何本文所述半胱氨酸改造抗体。半胱氨酸改造抗CD22抗体可以是单克隆抗体、抗体片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、或竞争性抑制抗CD22多肽抗体与其相应抗原表位结合的抗体。本发明的抗体可以任选地偶联至生长抑制剂或细胞毒剂，诸如毒素，包括例如auristatin、抗生素、放射性同位素、核溶酶等。本发明的抗体可以任选地在CHO细胞或细菌细胞中产生，且优选地抑制它们所结合的细胞的生长或增殖或诱导与它们所结合的细胞的死亡。为了诊断目的，本发明的抗体可以带上可检测标记物、附着至固体支持物、等等。在本发明的其它实施方案中，本发明提供了包含编码任何本文所述抗CD22抗体和抗⑶22半胱氨酸改造抗体的DNA的载体。还提供了包含任何此类载体的宿主细胞。举例而言，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌细胞或酵母细胞。用于产生任何本文所述多肽的方法有进一步的提供，且包括在适于表达期望多肽的条件下培养宿主细胞和从该细胞培养物中回收期望多肽。半胱氨酸改造抗体可用于治疗癌症，并包括对细胞表面和跨膜受体及肿瘤相关抗原(TAA)特异性的抗体。此类抗体可以以裸抗体(未偶联至药物或标记物模块)或抗体-药物偶联物(ADC)的形式使用。本发明的半胱氨酸改造抗体可以位点特异性地且高效地偶联有硫醇反应性试剂。该硫醇反应性试剂可以是多功能接头试剂、捕获标记物试剂、荧光团试剂或药物-接头中间体。半胱氨酸改造抗体可以用可检测标记物标记，固定化在固相支持物上和/或与药物模块偶联。可以将硫醇反应性普及至任何抗体，其中可以用反应性半胱氨酸氨基酸进行氨基酸替代，这发生在轻链中选自下列氨基酸范围的范围内=L-1O至 L-20 ；L-38 至 L-48 ;L_105 至 L-115 ;L_139 至 L-149 ;L_163 至 L-173，及重链中选自下列氨基酸范围的范围内H-35至H-45 ;H-83至H-93 ;H_114至H-127 ;和H-170至H-184，及Fe区中选自下组的范围内H-268至H-291 ;H_319至H-344 ;Η_370至H-380 ;和Η-395至Η-405,其中氨基酸位置的编号方式开始于Kabat编号系统(Kabat等(1991) Sequencesof Proteins ofImmunological Interest,第 5版，Public Health Service, NationalInstitutes ofHealth, Bethesda, MD)的第I位并在其后顺序延续，正如W02006034488中所披露的。还可以将硫醇反应性普及至抗体的某些结构域，诸如轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。可以进行导致O. 6和更高的硫醇反应性值的半胱氨酸替代，这分别发生在完整抗体IgA、IgD、IgE、IgG和IgM (包括IgG亚类IgGl、IgG2、IgG3、IgG4，IgAl和IgA2)的重链恒定域α、δ、ε、Y和μ中。此类抗体及其用途在W02006/034488中有披露。本发明的半胱氨酸改造抗体优选地保留它们野生型、亲本抗体对应物的抗原结合能力。如此，半胱氨酸改造抗体能够结合(优选特异性地)抗原。此类抗原包括例如肿瘤相关抗原(TAA)、细胞表面受体蛋白和其它细胞表面分子、跨膜蛋白、信号传导蛋白、细胞存活调节因子、细胞增殖调节因子、与组织发育或分化有关的(例如已知或怀疑在功能上促进的)分子、淋巴因子、细胞因子、牵涉细胞周期调控的分子、牵涉脉管发生(vasculogenesis)的分子、和与血管发生(angiogenesis)有关的(例如已知或怀疑在功能上促进的)分子。肿瘤相关抗原可以是簇分化因子(cluster differentiation factor)(即⑶蛋白，包括但不限于CD22)。本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体保留它们亲本抗CD22抗体对应物的抗原结合能力。如此，本发明的半胱氨酸改造抗CD22抗体能够结合(优选特异性地)CD22抗原，包括人抗CD22同种型β和/或α，包括在细胞(包括但不限于B细胞)表面表达此类抗原时。本发明的抗体可以偶联至其它硫醇反应性试剂，其中该反应性基团是例如马来酰亚胺、碘乙酰胺、卩比唳基二硫化物(pyridyl disulfide)或其它硫醇反应性偶联配偶(Haugland, 2OO3, Molecular Probes Handbook of FluorescentProbes andResearch Chemicals, Molecular Probes,Inc. ;Brinkley, 1992，Bioconjugate Chem.3:2;Garman, 1997，Non-Radioactive LabelIing:A PracticaIApproach，AcademicPress,London;Means (1990)Bioconjugate Chem. 1:2;Hermansonj G.于 BioconjugateTechniques (1996) Academic Press, San Diego，pp. 40-55，643-671) 该配偶可以是细胞毒齐IJ(例如毒素，诸如多柔比星或百日咳毒素)、荧光团(诸如荧光染料，像荧光素或罗丹明)、用于成像或放射性治疗金属的螯合剂、肽基或非肽基标记物或检测标签、或清除调节剂(clearance-modifying agent)(诸如聚乙二醇的各种异构体)、与第三成分结合的肽、或另一种碳水化合物或亲脂剂。在一个方面，本发明的抗体可以与任何标记物模块偶联，所述标记物模块可以通过反应性模块、活化的模块或反应性半胱氨酸硫醇基团共价附着至抗体(Singh等(2002)Anal. Biochem. 304:147-15;Harlow E.和Lane, D. (1999)Using Antibodies:A LaboratoryManual, Cold Springs Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ；LundbladR. L. (1991)Chemical Reagents for ProteinModification,第 2 版,CRC Press, BocaRaton, FL) 0所附着的标记物可以发挥下列功能(i)提供可检测信号；(ii)与第二标记物相互作用以修饰由第一或第二标记物所提供的可检测信号，例如以给出FRET (荧光共振能量转移)稳定与抗原或配体的相互作用或提高与抗原或配体结合的亲和力；(iv)通过电荷、疏水性、形状或其它物理参数来影响迁移率，例如电泳迁移率或细胞通透性；或(v)提供捕获模块以调控配体亲和力、抗体/抗原结合或离子络合。经过标记的半胱氨酸改造抗体可以用于诊断测定法，例如用于在特定细胞、组织或血清中检测感兴趣抗原的表达。为了诊断应用，典型地用可检测模块标记抗体。许多标记物是可获得的，一般可将它们分组成下列种类放射性同位素(放射性核素)，诸如3H、llC、14C、18F、32P、35S、64Cu、68Ga、86Y、99Tc、lllIn、1231、1241、1251、1311、133Xe、177Lu、211At 或 213Bi。放射性同位素标记的抗体可用于受体祀向的成像实验。使用Current Protocols in Immunology,卷I和2，Coligen 等编，Wiley-1nterscience, New York, NY, Pubs. (1991)中记载的技术，可以用结合、螯合或以其它方式络合放射性同位素金属的配体试剂来标记该抗体，其中该试剂与该抗体的改造的半胱氨酸硫醇具有反应性。可以络合金属离子的螯合配体包括D0TA、D0TP、D0TMA、DTPA和TETA (Macrocyclics，Dallas, TX)。放射性核素可以通过与本发明的抗体-药物偶联物络合来革巴向(Wu 等(2005) NatureBiotechnology23 (9) : 1137-1146)。接头试剂，诸如DOTA-马来酰亚胺(4-马来酰亚氨基丁酰亚氨基苄基-D0TA)(4-male imidobutyramidobenzyl-DOTA)可以通过氨基节基-DOTA与用氯甲酸异丙酯(isopropylchloroformate) (Aldrich)活化的4-马来酰亚氨基丁酸(Fluka)反应来制备，其遵循 Axworthy 等(2000) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA97 (4) : 1802-1807)的规程。DOTA-马来酰亚胺试剂与半胱氨酸改造抗体的游离半胱氨酸氨基酸起反应，并在该抗体上提供金属络合配体(Lewis等(1998) Bioconj. Chem. 9:72-86)。螯合接头标记试剂，诸如DOTA-NHS(1,4, 7，10-四氮杂环十二 烷-1，4，7，10-四乙酸单(N-羟基琥珀酰亚胺酯))(1，4，7，10-tetraazacyclododecane-1, 4, 7, 10-tetraacetic acid mono(N-hydroxysuccinimideester))是商品化的(Macrocyclics, Dallas, TX)。用放射性核素标记的抗体进行的受体祀物成像可以通过检测和定量抗体在肿瘤组织中的逐渐积累来提供途径活化的标志(Albert等(1998)Bioorg. Med. Chem. Lett. 8:1207-1210)。在溶酶体降解后，所偶联的放射性金属可以保留在细胞内。适合作为用于成像实验的抗体标记物的金属-螯剂复合体披露于US5342606;US5428155;US5316757;US5480990;US5462725;US5428139;US5385893;US5739294;US5750660;US5834456;Hnatowich 等(1983)J.1mmunol. Methods65:147-157;Meares 等(1984)Anal.Biochem. 142:68-78;Mirzadeh 等(1990)Bioconjugate Chem. 1:59-65;Meares 等(1990)J. Cancerl990, Suppl. 10:21-26;Izard 等(1992)Bioconjugate Chem. 3:346-350;Nikula等(1995)Nucl. Med. Biol. 22:387-90;Camera 等(1993)Nucl. Med. Biol. 20:955-62;Kukis等(1998)J. Nucl. Med. 39:2105-2110;Verel 等(2003) J. Nucl. Med. 44:1663-1670;Camera等(1994)J. Nucl. Med. 21:640-646;Ruegg 等(1990)Cancer Res. 50:4221-4226;Verel 等(2003)J. Nucl. Med. 44:1663-1670;Lee 等(2001)Cancer Res. 61:4474-4482;Mitchell等(2003)J.Nucl.Med.44:1105_1112;Kobayashi 等(1999)BioconjugateChem. 10:103-111;Miederer 等(2004)J. Nucl. Med. 45:129-137;DeNardo 等(1998)ClinicalCancer Research4:2483-90;Blend 等(2003)Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticalsl8:355-363;Nikula 等(1999) J. Nucl. Med. 40:166-76;Kobayashi 等(1998)J. Nucl. Med. 39:829-36;Mardirossian 等(1993)Nucl. Med. Biol. 20:65-74;Roselli 等
(1999)Cancer Biotherapy &Radiopharmaceuticals, 14:209-20。(b)荧光标记物，诸如稀土螯合物，铕螯合物；荧光素类，包括FITC、5_羧基荧光素、6-羧基荧光素；罗丹明类，包括TAMRA ;丹酰；丽丝胺；花青；藻红蛋白；德克萨斯红；和它们的类似物。使用例如Current Protocols inlmmunology (见上文)中披露的技术,可以将突光标记物偶联至抗体。突光染料和突光标记物试剂包括可购自Invitrogen/MolecularProbes (Eugene, OR)和 Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL)的那些。(c)各种酶-底物标记物是可获得的或有披露的(US4275149)。该酶一般催化显色底物的化学改变，其可以采用各种技术来测量。例如，该酶可以催化底物的颜色变化，其可以用分光光度法来测量。或者，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于定量荧光变化的技术在上文有描述。化学发光底物通过化学反应而成为电子激发的，然后可以发射可测量的光(例如使用化学发光计)或给荧光受体贡献能量。酶标记物的例子包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；US4737456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶，诸如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶偶联至抗体的技术披露于 0’ Sullivan 等(1981) “Methods for the Preparation ofEnzyme-AntibodyConjugates for use in Enzyme Immunoassay，，，于 Methods in Enzym.(J. Langone 和 H. Van Vunakis 编)，Academic Press, New York, 73:147-166。酶-底物组合的例子包括例如(i)辣根过氧化物酶(HRP)与作为底物的过氧化氢，其中该过氧化氢氧化染料前体(例如邻苯二胺(OPD)或3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；(ii)碱性磷酸酶(AP)与作为显色底物的对硝基苯基磷酸酯；和(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)与显色底物(例如对硝基苯基-β -D-半乳糖苷酶)或荧光底物4-甲基伞形基-β -D-半乳糖苷)。许多其它的酶-底物组合对本领域技术人员而言是可获得的。一般综述参见US4275149 和 US4318980。标记物可以间接地与氨基酸侧链、活化的氨基酸侧链、半胱氨酸改造抗体等偶联。例如，抗体可以与生物素偶联，并且任何上述三大类标记物可以与亲合素或链霉亲合素偶联，反之亦然。生物素选择性结合链霉亲合素，如此，标记物可以以该间接方式与抗体偶联。或者，为了实现标记物与多肽变体的间接偶联，多肽变体与小的半抗原(例如地高辛)偶联，并且上述不同类型的标记物之一与抗半抗原多肽变体(例如抗地高辛抗体)偶联。如此，可以实现标记物与多肽变体的间接偶联(Hermanson, G. (1996)于Bioconjugate TechniquesAcademic Press, San Diego)。可以在任何已知的测定方法中使用本发明的抗体，诸如ELISA、竞争性结合测定法、直接和间接三明治式测定法或夹心式测定法、和免疫沉淀测定法(Zola，(1987)Monoclonal Antibodies:A Manual of Techniques, pp. 147-158, CRC Press,Inc.)。
检测标记物可用于对结合或识别事件进行定位、显现和定量。经过标记的本发明抗体可检测细胞表面受体。经过可检测标记的抗体的另一种用途是基于珠子的免疫捕获方法，其包括将珠子与荧光标记的抗体偶联，和在配体结合后检测荧光信号。类似的结合检测方法学利用表面等离振子共振(SPR)效应来测量和检测抗体-抗原相互作用。 检测标记物(诸如突光染料和化学发光染料)(Briggs等(1997) 〃SynthesisofFunctionalised Fluorescent Dyes and Their Coupling to Amines and AminoAcids^, J.Chem. Soc.，Perkin-Trans. 1:1051-1058)提供可检测的信号，并且一般可用于标记抗体，优先具有下列性质(i)经过标记的抗体应产生很高的信号但低的背景，使得在无细胞测定法和基于细胞的测定法中都能灵敏地检测出少量的抗体；和(ii)经过标记的抗体应是光稳定的，使得可以观察、监测和记录荧光信号，但没有显著的光漂白。对于涉及经标记抗体对膜或细胞表面(尤其是活细胞)的细胞表面结合的应用，标记物优选地(iii)具有优良的水溶性以实现有效的偶联物浓度和检测灵敏度，且(iv)对活细胞是无毒性的，免得破坏细胞的正常代谢过程或引起过早的细胞死亡。可以在用活细胞或珠子自动实施混合和读取(mix-and-read)、非放射性测定法的系统( ;ΜΑ1 8100HTS System, Applied Biosystems, Foster City, Calif.)上进行细胞荧光强度的直接定量和荧光标记事件(例如肽-染料偶联物的细胞表面结合)的点查(Miraglia, "Homogeneous cell-and bead-based assays forhigh throughput screeningusing fluorometric microvolume assay technology", (1999)J. ofBiomolecularScreening4:193-204)。经过标记的抗体的用途还包括细胞表面受体结合测定法、免疫捕获测定法、荧光连接的免疫吸附测定法(FLISA)、胱天蛋白酶切割(Zheng，"Caspase-3controls both cytoplasmic andnuclear events associated with Fas-mediatedapoptosis in vivo", (1998) Proc. Natl. Acad. Sc1. USA95:618-23;US6372907),凋亡(Vermes,〃A novel assay forapoptosis. Flow cytometric detection ofphosphatidyl serine expression on earlyapoptotic cells using fluoresceinlabelled Annexin V〃(1995) J.1mmunol. Methodsl84:39-51)和细胞毒性测定法。可以使用突光计量微体积测定法(fluorometric microvolume assay)技术鉴定由革巴向细胞表面的分子所引起的上调或下调(Swartzman, 〃A homogeneous and multiplexedimmunoassay forhigh-throughput screening using fluorometric microvolume assaytechnology", (1999)Anal. Biochem. 271:143-51)。经过标记的本发明抗体可通过生物医学和分子成像的各种方法和技术用作成像生物标志物和探针，诸如(i)MRI (磁共振成像)；(ii)microCT (计算机化断层成像)；(iii)SPECT (单光子发射计算机化断层成像)；(iv) PET (正电子发射断层成像)Chen等(2004)Bioconjugate Chem. 15:41-49 ； (v)生物发光；(vi)突光；和(vii)超声。免疫闪烁照相术是一种成像规程，其中给动物或人患者施用用放射性物质标记的抗体，并拍摄身体中该抗体定位的部位的照片(US6528624)。可以将成像生物标志物作为正常生物学过程、病理学过程、或对治疗性干涉的药理学应答的指示客观地测量并评估。生物标志物可以是数种类型类型O是疾病的天然历史标志物，并与已知临床指标(例如类风湿性关节炎中滑膜炎症的MRI评估)纵向相关；类型I标志物捕获依照作用机制(mechanism-of-action)的干涉效应，即使该机制可能与临床结果无关；类型II标志物充当代用终点(surrogate endpoint),其中该生物标志物的改变或来自该生物标志物的信号预示临床益处以“证实”靶向应答，诸如通过CT在类风湿性关节炎中测量到的骨侵蚀。如此，成像生物标志物可以提供关于下列各项的药效学(PD)治疗信息(i)靶蛋白的表达，(ii)治疗剂对靶蛋白的结合，即选择性，和
(iii)清除和半衰期药动学数据。体内成像生物标志物相对于基于实验室的生物标志物的优点包括非侵入性处理(non-1nvasivetreatment),可定量,全身评估，重复定量给药和评估(即多个时间点)，及从临床前结果(小动物)结果至临床结果(人)的潜在可转换效应。对于一些应用，生物成像代替或最少化临床前研究中动物实验的数目。妝标记方法是公知的。参见Haugland, 2003，Molecular Probes HandbookofFluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes,Inc. ;Brinkley, 1992, Bioconjugate Chem. 3:2;Garman, (1997)Non-Radioactive Labelling:APracticalApproach,Academic Press,London;Means(1990)Bioconjugate Chem.1:2;Glazer 等(1975)Chemical Modification of Proteins. Laboratory Techniquesin Biochemistryand Molecular Biology (T. S.Work 和 E.Work 编)AmericanElsevier PublishingCo. , New York;Lundblad, R. L.和 Noyes, C. M. (1984)Chemical Reagents for ProteinModification,卷 I 和 II，CRC Press,New York;Pfleiderer, G. (1985) “ChemicalModification of Proteins”，Modern Methods inProtein Chemistry, H. Tschesche编，Walter DeGryter,Berlin 和 New York;及 Wong(1991)Chemistry of ProteinConjugation and Cross-linking, CRC Press, Boca Raton, Fla. );De Leon-Rodriguez 等(2004)Chem. Eur. J. 10:1149-1155;Lewis 等(2001)Bioconjugate Chem. 12:320-324;Li 等(2002)BioconjugateChem. 13:110-115;Mier 等(2005)Bioconjugate Chem. 16:240-237。用两种模块即荧光报道物和淬灭剂标记的肽和蛋白质在足够接近时经历荧光共振能量转移(FRET)。报道物基团典型地是荧光染料，其由某个波长的光激发并转移能量给受体或淬灭剂基团，其具有合适的斯托克司频移(Stokes shift)以在最高亮度发光。荧光染料包括具有延伸芳香性的分子，诸如荧光素和罗丹明及其衍生物。荧光报道物可以由完整肽中的淬灭剂模块部分地或 显著地淬灭。在肽酶或蛋白酶切割肽后，可以测量可检测的突光增加(Knight, C. (1995) ^Fluorimetric Assays of Proteolytic Enzymes”，MethodsinEnzymology, Academic Press, 248:18-34)。经过标记的本发明抗体还可以用作亲和纯化剂。在该方法中，使用本领域公知的方法将经过标记的抗体固定化在固相(诸如Sephadex树脂或滤纸)上。使固定化的抗体与含有待纯化抗原的样品接触，其后用合适的溶剂清洗支持物，这会清除该样品中除待纯化抗原(其结合至固定化的多肽变体)以外的基本上所有材料。最后，用另一种合适的溶剂(诸如甘氨酸缓冲液，PH5. O)清洗支持物，这会从多肽变体中释放抗原。标记试剂典型地具有反应性官能度，其可以(i)与半胱氨酸改造抗体的半胱氨酸硫醇直接反应以形成经过标记的抗体，(ii)与接头试剂反应以形成接头-标记物中间体，或(iii)与接头抗体反应以形成经过标记的抗体。标记试剂的反应性官能度包括马来酰亚胺、卤乙酰基、碘乙酰胺琥珀酰亚氨基酯(例如NHS，N-羟基琥珀酰亚胺)、异硫氰酸、磺酰氯、2，6-二氯三嗪基、五氟苯基酯、和亚磷酰胺，尽管还可以使用其它官能团。例示性的反应性官能团是可检测标记物(例如生物素或荧光染料)的羧基取代基的N-羟基琥珀酰亚氨基酯(NHS)。可以预制、分离、纯化和/或表征该标记物的NHS酯，或者可以使其原位形成，并与抗体的亲核基团起反应。典型地，将羧基形式的标记物通过与碳二亚胺试剂(例如二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺)、或脲阳离子试剂(例如TSTU (0-(N-琥珀酰亚氨基)-N，N，N’，N’ -四甲基脲四氟化硼盐)、HBTU ( (O-苯并三唑-1-基)-N，N，N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐)或HATU ((0-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N，N, N’，N’ -四甲基脲六氟磷酸盐)、活化剂(诸如1-羟基苯并三唑(HOBt)和N-羟基琥珀酰亚胺)的一些组合起反应而活化以给出该标记物的NHS酯。在一些情况中，可以通过标记物的原位活化和与抗体反应来偶联标记物和抗体以在一个步骤中形成标记物-抗体偶联物。其它活化和偶联试剂包括TBTU (2-(1H-苯并三唑-1-基)-1_1，3，3-四甲基脲六氟磷酸盐)、TFFH(N，N’，N”，N’ ” -四甲基脲2-氟-六氟磷酸盐)、PyB0P (苯并三唑-1-基-氧代-二卩比略烧勝六氣憐酸盐)、EEDQ (2-乙氧基-1-乙氧擬基-1，2- 二氧-喧啉)、DCC (二环己基碳二亚胺)、DIP⑶I ( 二异丙基碳二亚胺)、MSNT(1-(均三甲基苯-2-磺酰)-3-硝基-1H-1，2，4-三唑和芳基磺酰卤化物，例如三异丙基苯磺酰氯。本发明的清蛋白结合肽-Fab化合物在一个方面，·本发明的抗体融合至清蛋白结合蛋白。血浆蛋白结合可以是改善短命分子的药动学性质的有效手段。清蛋白是血浆中最丰富的蛋白质。血清清蛋白结合肽(ABP)可以改变所融合的活性结构域蛋白质的药效学，包括改变组织摄取、渗透和扩散。可以通过合适的血清清蛋白结合肽序列的具体选择来调控这些药效学参数(US20040001827)。通过噬菌体展示筛选鉴定了一系列清蛋白结合肽(Dennis等(2002)“Albumin Binding As A GeneralStrategy For Improving The PharmacokineticsOf Proteins” J Biol Chem. 277:35035-35043;W001/45746)。本发明的化合物包括由下列文献所教导的 ABP 序列(i)Dennis 等(2002) J Biol Chem. 277:35035-35043 表 III 和IV，第 35038 页；(ii)US20040001827 段
SEQ ID NOS:9-22 -M (iii)W001/45746，第12-13页，都收入本文作为参考。通过以1:1化学计量比(认8 /^&13)将清蛋白结合肽融合至Fab重链的C末端来改造清蛋白结合(ABP)-Fab。显示了这些ABP-Fab与清蛋白的结合使抗体在家兔和小鼠中的半衰期增加了 25倍多。因此，可以将上述反应性Cys残基导入这些ABP-Fab，并用于与细胞毒性药物的位点特异性偶联，接着是体内动物研究。例示性的清蛋白结合肽序列包括但不限于SEQ ID NO:42-46中列出的氨基酸序列CDKTHTGGGSQRLMEDICLPRWGCLWEDDFSEQ ID NO:42QRLMEDICLPRffGCLffEDDFSEQ ID NO:43QRLIEDICLPRffGCLffEDDFSEQ ID NO:44RLIEDICLPRffGCLffEDDSEQ ID NO:45DICLPRffGCLffSEQ ID NO:46抗体-药物偶联物在另一个方面，本发明提供了包含偶联有细胞毒剂的抗体的免疫偶联物或抗体-药物偶联物(ADC)，所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。在另一个方面，本发明还提供了使用免疫偶联物的方法。在一个方面，免疫偶联物包含共价附着至细胞毒剂或可检测试剂的任何上述抗CD22抗体。
抗体-药物偶联物在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂或细胞抑制剂(即杀死或抑制肿瘤细胞的药物)的用途(Syrigos和Epenetos (1999) Anticancer Research19:605-614;Niculescu-Duvaz 和 Springer(1997)Adv. DrgDel. Rev. 26:151-172;US4，975，278)容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用这些未经偶联的药物试剂在试图消除的肿瘤细胞以外可导致不可接受的对正常细胞的毒性水平(Baldwin 等(1986)Lancet(Mar. 15，1986):603-05;Thorpe (1985)〃Antibody Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy:A Review",于 MonoclonalAntibodies’ 84:BiologicalAnd Clinical Applications (A. Pinchera等编)pp. 475-506)。由此寻求最大功效及最小毒性。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报道可用于这些策略(Rowland 等(I986)Cancer Immunol.1mmunother. 21:183-87) 这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine) (Rowland等(1986)见上文)。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)(Mandler 等(2000)Jour. · of the Nat. Cancerlnst. 92(19):1573-1581 ；Mandler 等(2000)Bioorganic & Med. Chem. LetterslO:1025-1028 ；Mandler 等(2002)Bioconjugate Chem. 13:786-791)、美登木素生物碱(EP1391213 ;Liu 等(1996) Proc. Natl.Acad. Sc1. USA93:8618-8623)、和加利车霉素(Lode 等(1998) Cancer Res. 58:2928 ；Hinman等(1993) CancerRes. 53:3336-3342)。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性和细胞抑制性效应。有些细胞毒性药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。ZEVALIN (ibritumomab tiuxetan, Biogen/Idec)是由针对在正常和恶性 B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgGlK单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的mIn或9°Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物(Wiseman等(2000)Eur.Jour. Nucl. Med. 27(7):766-77;Wiseman等(2002) Blood99(12):4336-42;Witzig等(2002)J. Clin. Oncol. 20(10) :2453-63;Witzig 等(2002) J. Clin. Oncol. 20(15) :3262-69)。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且持久的血细胞减少。MYL0TARG (gemtuzumab ozogamicin, Wyeth Pharmaceuticals),即由hu CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病(Drugs of the Future (2000) 25 (7) :686;美国专利No.4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001)。 Cantuzumabmertansine (Immunogen, Inc.),即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物部分DMl连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进入用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。 MLN-2704 (Millennium Pharm. , BZLBiologies, Immunogen Inc.),即由抗前列腺特异膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物部分DMl连接而构成的抗体-药物偶联物，在开发用于前列腺肿瘤的潜在治疗。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatinE(AE)和单甲基auristatin (MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96 (对癌瘤上的Lewis Y特异)和cACIO (对血液学恶性肿瘤上的0)30特异)偶联(Doronina等(2003) NatureBiotechnology21(7) : 778-784)，且正在进行治疗性开发。
本文中描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin) A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白(PAP1、PAPII 和 PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酌·霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的W093/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括212B1、1311、131In、9°Y、和186Re。抗体和细胞毒剂的偶联物使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)_乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6- 二异氰酸酯)、和双活性氟化合物(诸如1，5- 二氟-2，4- 二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等(1987) Science, 238:1098中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂(W094/11026)。本文还涵盖抗体和一种或多种小分子毒素(诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、auristatin、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的片段)的偶联物。(I)美登素和美登木素生物碱在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的本发明抗体(全长抗体或抗体片段)。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离得到(美国专利No. 3,896，111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No. 4，151，042)。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物4，137，230;4，248，870; 4，256，746; 4，260，608 ; 4，265，814; 4，294，757; 4，307，016; 4，308，268; 4，308，269; 4，309，428; 4，313，946; 4，315，929; 4，317，821; 4，322，348 ; 4，331，598; 4，361，650; 4，364，866; 4, 424，219; 4，450，254; 4, 362，663;及 4，371，533。美登木素生物碱药物模块是有吸引力的抗体-药物偶联物中药物模块，因为它们(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头偶联抗体的官能团衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。适于用作美登木素生物碱药物模块的美登素化合物是本领域公知的，而且可以依照已知方法从天然来源分离，使用遗传工程技术生产(参见Yu等(2002)PNAS99:7968-7973)，或者美登醇和美登醇类似物也可以依照已知方法合成制备。 例示性的美登木素生物碱药物模块包括那些具有修饰的芳香环的，诸如C-19-脱氯(US4256746)(通过安丝菌素(ansamytocin)P2的氢化招锂还原来制备)；C-20-羟基(或C-20-脱甲基)+/-C-19-脱氯(美国专利No. 4361650和4307016)(通过使用链霉菌或放线菌的脱甲基化或使用LAH的脱氯化来制备)；及C-20-脱甲氧基，C-20-酰氧基(-0C0R)，+/-脱氯(美国专利No. 4，294，757)(通过使用酰氯的酰化来制备)，以及那些在其它位置具有修饰的。例示性的美登木素生物碱药物模块还包括那些具有修饰的，诸如C-9-SH(US4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5的反应来制备);C_14-烷氧基甲基(脱甲氧基/CH2OR) (US4331598) ;C_14-羟甲基或酰氧甲基(CH2OH 或 CH2OAc) (US4450254)(自诺卡氏菌制备);C-15-羟基/酰氧基(US4364866)(通过链霉菌对美登醇的转化来制备);C_15_甲氧基(美国专利 No. 4313946 和 4315929)(自 Trewia nudlflora 分离)；C-18_N-脱甲基(美国专利No. 4362663和4322348)(通过链霉菌对美登醇的脱甲基化来制备);及4，5-脱氧(US4371533)(通过美登醇的三氯化钛/LAH还原来制备)。美登木素生物碱药物模块的例示性实施方案包括具有如下结构的DM1、DM3和DM4
权利要求
1.一种结合CD22的抗体，其中该抗体包含(a)HVR-Ll，其包含选自SEQID N0:9、10、19-23、32和33的氨基酸序列，和(b)至少一种、两种、三种、四种或五种HVR，其选自 (1)HVR-Hl，其包含SEQID NO:2的氨基酸序列； (2)HVR-H2，其包含SEQID NO:4的氨基酸序列； (3)HVR-H3，其包含SEQID NO:6的氨基酸序列； (4)HVR-L2，其包含SEQID NO: 12的氨基酸序列；和 (5)HVR-L3，其包含SEQID NO: 14的氨基酸序列。
2.权利要求1的抗体，其中该抗体包含重链可变域，其包含一种、两种、三种或四种选自SEQ ID NO:1、3、5和7的框架氨基酸序列。
3.权利要求1的抗体，其中该抗体包含轻链可变域，其包含一种、两种、三种或四种选自SEQ ID N0:8、ll、13和15的框架氨基酸序列。
4.权利要求1的抗体，其中该抗体包含具有SEQID NO: 88的氨基酸序列的重链和具有SEQ ID N0:87的氨基酸序列的轻链。
5.一种免疫偶联物，其包含共价附着至细胞毒剂的权利要求1的抗体。
6.权利要求1的抗体，其中该抗体进一步包含在一个或多个选自下组的位置上的半胱氨酸依照Kabat编号规则的轻链第15位、第43位、第110位、第144位、第168位和第205位和依照EU编号规则的重链第41位、第88位、第115位、第118位、第120位、第171位、第172位、第282位、第375位和第400位。
全文摘要
本发明涉及抗体和免疫偶联物及其用途。提供了抗CD22抗体及其免疫偶联物。提供了使用抗CD22抗体及其免疫偶联物的方法。
文档编号C07K16/28GK103030696SQ20121052821
公开日2013年4月10日 申请日期2007年5月29日 优先权日2006年5月30日
发明者小艾伦.J.埃本斯, 阿兰.M.格雷, 梁伟庆, 吴雁, 于尚凡 申请人:健泰科生物技术公司