专利名称：用于改善药物保留的脂质体组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及脂质体组合物，它使脂质体中药物的保留改善。特别是，本发明涉及包括氟喹诺酮抗生素化合物的脂质体。
背景技术：
脂质体，或脂质囊泡，是公认的能改善各种药剂的治疗活性并增加安全性的药物转运系统。就用作诊断或治疗化合物的体内载体来说，脂质体一般制备成含有包载在脂质体中的化合物的形式。为了用于医学治疗，脂质体制剂应该具有高的装载效率，即高的药物-脂质比，以减少病人负荷的非治疗性的脂质，并且应该具有实际的贮存期限，使储存期间包载的化合物几乎没有泄漏或活性损失。
有两种制备脂质体制剂的通用方法被动装载，此时药物和脂质在形成脂质囊泡的时候结合；和远距离装载，此时药物在脂质囊泡形成后在装载到脂质体中。在被动装载方法中，干燥的脂质膜一般与含有所需药物的水相介质水合形成多层囊泡，它们在脂质体形成过程中被动包载药物。化合物可以是包括在干燥脂质膜中的亲脂性化合物，或者是包含在水合介质中的水溶性化合物。对于水溶性化合物，这种方法得到的包封效率非常不好，通常在最终的脂质体悬浮液中只有5-20％的总化合物为包封形式。如果对这些囊泡作进一步的加工，即通过挤压以生产更小、更均匀大小的脂质体，则可能还会另外损失化合物。
用于形成装载化合物的脂质体的其他被动包载方法是已知的，现已提出了溶剂注入法和反向蒸发相位法(Szoka，F.C.，Jr.，和Papahadjopoulos，D.，《美国国家科学院院报》754194-4198(1978))。这些方法容易出现相当不好的装载效率和/或难以处理溶剂的问题。
化合物的远距离装载提供了克服被动装载的某些缺点的方式，特别是提供了能达到高药物-脂质比的方法。在远距离装载中，建立起穿过脂质体脂质双层的离子梯度，诸如氢或铵离子梯度，可电离的化合物被装载到脂质体中。
但是，远距离装载存在公认的离子梯度问题，其中一个就是具有可电离基团的药物是有限的。另外，并非所有可电离的药物都响应离子梯度而在脂质体中聚积(Chakrabarti，A.等，美国专利第5,380,532号；Madden，T.D.等，《脂质化学和物理学》5337-46(1990))。另一个问题是有些确实在脂质体中聚积的药剂在聚积后立即就释放了。还有一个问题是有些在体外成功地装载并保留在脂质体中的药剂在体内具有很高的从脂质体的泄漏率，从而失去了以药剂包载在脂质体中的形式给药的优点。
发明概述因此，本发明的目的是提供一种包括以卓越的保留性能包载在脂质体中的可电离化合物、特别是氟喹诺酮的脂质体组合物。
本发明的另一个目的是提供这种脂质体组合物的制备方法。
在一个方面，本发明包括由成囊泡脂质形成的脂质体悬浮液组成的脂质体组合物。包含在脂质体中的是氟喹诺酮化合物和能有效地与氟喹诺酮形成配合物并增强氟喹诺酮在脂质体中的保留的多阴离子聚合物。
在一个实施方案中，氟喹诺酮是6-氟喹诺酮。在优选的实施方案中，6-氟喹诺酮选自以下成员诺氟沙星、环丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟罗沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
在另一个实施方案中，多阴离子聚合物是具有选自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的阴离子基团的聚合物。特别是，该多阴离子聚合物选自葡聚糖硫酸酯、硫酸软骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
在另一个实施方案中，脂质体进一步包括用亲水性聚合物衍生的脂质，诸如聚乙二醇。
在优选的实施方案中，脂质体包括多阴离子聚合物葡聚糖硫酸酯和6-氟喹诺酮环丙氟哌酸。
在另一个方面，本发明包括增强6-氟喹诺酮在脂质体中的保留的方法。该方法包括制备由成囊泡脂质组成的和具有包载的多阴离子聚合物的脂质体；和在6-氟喹诺酮的存在下在能有效地使化合物摄取到脂质体中并使化合物与多阴离子聚合物配合的条件下孵育这些脂质体。
在另一个方面，本发明包括具有以和多阴离子聚合物形成配合物的形式包载在脂质体中的6-氟喹诺酮的脂质体悬浮液的制备方法。该方法包括以下步骤形成脂质体的悬浮液，使具有包括多阴离子聚合物的内部水相和包括多阴离子聚合物的外部相；通过加入能有效地增加外部体相的离子强度并能有效地凝缩聚合物的盐而从外部相除去任何未被包载的多阴离子聚合物；通过在6-氟喹诺酮的存在下在能有效地使6-氟喹诺酮摄取到脂质体的内部水相中的条件下孵育这些脂质体而将6-氟喹诺酮装载到脂质体中；以及从外部相除去任何未被包载的6-氟喹诺酮。
在一个实施方案中，除去是通过缩合的多阴离子聚合物的膜渗滤。
用于去除步骤的盐选自下列成员NaCl、KCl、Na2SO4和K2SO4。
在结合附图阅读了下面对本发明的详细说明后，将更全面地领会本发明的这些以及其他目的和特性。
附图的简要描述
图1A显示了喹诺酮抗生素化合物的一般结构；图1B显示了6-氟-喹诺酮化合物的一般结构；图1C显示了6-氟-喹诺酮环丙氟哌酸的结构；图2显示了在针对水(空心圆)和针对0.15M NaCl(实心方块)、0.35M NaCl(实心三角)、0.45M NaCl(实心圆)和1.0M NaCl(X标记)的渗滤过程中从渗透物收集的各部分中葡聚糖硫酸酯的量；图3显示了关于具有多阴离子聚合物俘获剂的脂质体(实心圆)和不带聚合物俘获剂的脂质体(空心方块，空心菱形)的在血浆中孵育后保留在脂质体中的环丙氟哌酸的百分数作为时间的函数所绘制的图；图4A显示了含有与葡聚糖硫酸酯结合的环丙氟哌酸的脂质体(实心圆)和含有与聚丙烯酸结合的环丙氟哌酸的脂质体(实心三角)和含有环丙氟哌酸但不含聚合物俘获剂的脂质体(空心方块)在体内给药后，保留在血流中的环丙氟哌酸的注射剂量百分数作为时间的函数所绘制的图；图4B显示了葡聚糖硫酸酯/环丙氟哌酸的脂质体制剂(实心圆)、与聚丙烯酸酯配合的环丙氟哌酸的脂质体制剂(实心三角)和具有包载的环丙氟哌酸但没有聚合物俘获剂的对照脂质体的脂质体制剂(空心方块)在静脉给药后，血流中的环丙氟哌酸浓度，以μg/mL表示。
发明详述1、脂质体组合物本发明与提供包括稳定地包载在脂质体中的喹诺酮抗生素、优选6-氟喹诺酮的脂质体组合物有关。这部分描述脂质体的组分，包括被包载的药物和多阴离子聚合物以及脂质体的脂质组分。脂质体的制备和特征描绘将在后面的部分中描述。
A、脂质体包载的喹诺酮化合物喹诺酮是总的4-吡啶酮-3-羧酸结构的一类合成抗微生物剂，如图1A中所示。在图中显示的一般结构中，X为N或C，而R1、R2、R5、R6、R7和R8可以是任何基团。喹诺酮类药物中的有些成员，诸如萘啶酮酸，已可供使用多年了。最近，已采用了氟化喹诺酮，这些衍生物提供了优于此类药物中早期成员的治疗益处，因为氟化的药剂具有宽的抗微生物活性，并且口服给药后能有效地治疗各种各样的感染疾病。这些化合物还具有相对较少的副作用，且对它们的作用产生的微生物抗性不会发展得很快。图1B中显示了6-氟喹诺酮的一般结构。
对6-氟-喹诺酮已进行了广泛的研究，许多结构变体是已知的，其中许多都适用于本发明。更有效的一种6-氟-喹诺酮是环丙氟哌酸，(1-环丙基-6-氟-1，4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉羧酸)，其结构显示在图1C中。与其他喹诺酮一样，环丙氟哌酸通过抑制细菌DNA的复制起作用。药物与DNA复制必需的一种酶-DNA回旋酶的β-亚单位结合，使得超螺旋松弛和重构，并有效地抑制了其活性。
环丙氟哌酸包括R1位的环丙基环和R7位的哌嗪环，这包括具有约8.7pKa的可电离胺。该药物可有效地对抗大多数革兰氏阴性病原菌和一些革兰氏阳性病原菌。但是，该抗菌剂的治疗效力受到了其3-4个小时的短排除半衰期的限制，这使得它难以在血液中保持治疗浓度。
如上所述，将药物包载到脂质体中是提高药物治疗效力的一种途径，有关环丙氟哌酸的包载已有记载(Ryan，J.等，WO91/09616；Wong，J.P.等，EP A1 0652008；Hope，M.等，WO96/26715)。但是，脂质体包载的环丙氟哌酸没有在脂质体中留存足够长的时间，以达到具有亲水性聚合物链表面包衣的长时间循环脂质体的体内生物分布的程度。这在对比实施例1中得到证明，该对比实施例描述了具有聚乙二醇链表面包衣的脂质体的制备和通过远距离装载将环丙氟哌酸包载到脂质体中。对含有环丙氟哌酸的脂质体进行体外测试，以测量从脂质体释放到血浆中的环丙氟哌酸的量(使用如实施例5中所述的方法)。结果发现在血浆中在37℃下孵育4小时后，几乎所有药物都从脂质体中泄漏出来，约75％的药物在1小时内就释放了。
长时间循环脂质体在血流中保持最多24小时。本文中所用的“长时间循环”脂质体是指具有亲水性聚合物链表面包衣的脂质体，诸如美国专利第5,013,556号中所述的聚乙二醇包衣的脂质体。注射给药24小时后，最多有注射剂量30％的长时间循环脂质体保留在血流中，而常规脂质体，例如没有聚合物链包衣的脂质体，它们在数小时内就从血流中清除了。因此，长时间循环脂质体达到了在除了常规脂质体给药后迅速积聚的单核吞噬细胞系统或网状内皮系统以外的包括在器官和组织内的体内生物分布(Paphadjopoulos，D.等，《美国国家科学院院报》8811460-11464(1991))。很清楚，因药物穿过脂质体双层泄漏而导致的一半以上加载的环丙氟哌酸在数小时的期间内释放的环丙氟哌酸-脂质体组合物没有利用长时间循环脂质体的长时间循环寿命和良好的生物分布。
因此，一个方面，本发明提供了具有包载在脂质体中并在脂质体中保持一段足够长的能达到脂质体生物分布的时间的环丙氟哌酸的脂质体组合物。在一个实施方案中，环丙氟哌酸包载在具有亲水性聚合物链表面包衣的脂质体中并且环丙氟哌酸在该脂质体中保持一段足以利用脂质体的长时间血液循环寿命的时间，以实现包载化合物的良好生物分布和持续释放。
更一般而言，本发明包括将许多化合物包载到脂质体中，特别是任何6-氟喹诺酮。再次参照图1B，6-氟-喹诺酮一般其中的R1为C1-C3烷基，诸如甲基、乙基、丙基或环丙基，它们可以在一个或多个位置被F、Cl或Br取代；R7是直链、支链或环状的含氮烷烃，其优选含有可电离氨基；例举性的R7取代基包括环结构诸如1-氮杂环丁烷基、1-哌嗪基、4-甲基-1-哌嗪基、4-乙基-1-哌嗪基、2-哌嗪基、1-吡咯烷基，它们各自可以被NH2、NHCH3、N(CH3)2、2-氨基乙基、乙氨基甲基、1-吡咯烷基或氨基乙氨基甲基取代，其他例举性的饱和和不饱和氮杂环包括单环杂环，例如咪唑、咪唑啉、二氢吡咯、1，2，3，6-四氢吡啶、1，4，5，6-四氢嘧啶、吡咯烷、吗啉、哌啶、哌嗪、1，3，5-三嗪和二环杂环，例如全氢化吲哚、全氢化喹啉、全氢化异喹啉、全氢化-7-氮杂吲哚、全氢化-4-氮杂苯并咪唑、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬烯(DBN)、1，8-二氮杂二环[5.5.0]十一-7-烯(DBU)、1，5-二氮杂二环[4.3.0]壬烷、1，8-二氮杂二环[5.5.0]十一烷、1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(三亚乙基二胺)、3-氮杂二环[3.2.2]壬烷、3-氮杂二环[4.3.0]壬烷、3-氮杂二环[3.3.0]辛烷、2，8-二氮杂二环[4.3.0]壬烷、5-二氮杂二环[4.3.0]壬烷、1，5，7-三氮杂二环[4.4.0]癸-5-烯、2，7-二氮杂螺[4.4]壬烷；X为N或C，当X为N是，没有R8；当X为C时，R8是H、F、Cl或CF3、OCH3或OCH2CH3，或者R1和R8一起构成将喹诺酮环中的1和8位环原子连接分别形成5元或6元环的2个或3个原子的烷基或烷氧基桥。此时有可能是顺式或反式立体异构体，这两种异构体都包括在本发明内。当存在不对称手性中心时，化合物可包括单一立体异构体或立体异构体的混合物，通常是外消旋混合物。
一些优选的6-氟喹诺酮包括环丙氟哌酸、诺氟沙星、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟罗沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
B、脂质体脂质组分如上所讨论的，喹诺酮化合物包载在脂质体中，此时“包载”指的是化合物螯合在脂质体的中心含水区域中，位于脂质体脂质双层之间的含水空间里，或位于双层本身内。更具体地说，在本发明中，喹诺酮化合物以和如上所述的多阴离子聚合物形成配合物的形式包载在脂质体中。本文中所用的“配合物”是指当聚合物与喹诺酮发生接触时形成的物质。配合物可以是在溶液中稳定的物质，也可以是沉淀。在这部分中，将描述用于本发明的脂质体。
本发明的脂质体由成囊泡脂质组成，通常包括具有疏水性尾基和极性首基的两亲脂质。成囊泡脂质的特点是其在水中自发形成到双层囊泡中的能力，如磷脂所例证的。这种类型的成囊泡脂质优选具有两个烃尾基或链、通常是酰基、和极性首基的那些。这类物质中包括磷脂，诸如磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酸(PA)、磷脂酰甘油(PG)和磷脂酰肌醇(PI)，此时两个烃链一般长度在约14-22个碳原子之间，并且具有不同的不饱和度。优选的磷脂包括PE和PC。例举性的PC是氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)。也可以使用单链脂质，诸如鞘磷脂(SM)。
上述其酰基链具有各种不同饱和度的脂质和磷脂可以从商业上获得，或者按照已公开的方法制备。可包括在本发明中的其他脂质是糖脂。本文中所用的术语“糖脂”包括具有两个烃链、其中一个是鞘氨醇的烃链、和一个或多个糖残基的脂质。
用于本发明的脂质可以是相对“流动的”脂质，意思是脂质相具有相对低的脂质熔化温度，例如为室温或低于室温，或者另一方面，是相对“刚性的”脂质，意思是脂质具有相对高的熔点，例如不超过50℃的温度。根据普遍规则，更刚性的、即饱和的脂质有助于脂质双层结构中更大的膜刚度，并因此有助于活性药物装载后更稳定的药物保留。优选的这种类型的脂质是具有约37℃以上的相变温度的那些。
脂质体另外可包括能稳定囊泡的脂质或主要由磷脂组成的脂质体。来自这组的最常用的脂质是25至45摩尔百分数浓度的胆固醇。
在一个实施方案中，本发明的脂质体包括亲水性聚合物链表面包衣。“表面包衣”指的是脂质体表面上的任何亲水性聚合物包衣。亲水性聚合物通过在脂质体组合物中包含一种或多种用亲水性聚合物链衍生的成囊泡脂质而包括到脂质体中。可以使用的成囊泡脂质是上文中对第一成囊泡脂质组分所描述的那些中的任何一种，不过，优选具有二酰基链的成囊泡脂质，诸如磷脂。一种优选的磷脂是磷脂酰乙醇胺(PE)，它含有适于与活化聚合物偶联的活性氨基。一种例举性的PE是二硬脂酰PE(DSPE)。
用于与成囊泡脂质偶联的优选的亲水性聚合物是聚乙二醇(PEG)，最好是分子量在1,000-10,000道尔顿之间、更优选在1,000-5,000道尔顿之间的PEG链。
其他可能合适的亲水性聚合物包括聚乳酸、聚乙醇酸、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基噁唑啉、聚乙基噁唑啉、聚羟基丙基甲基丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺和衍生衍生物，诸如羟甲基纤维素或羟乙基纤维素。
含有与适宜的脂质诸如PE结合的这些聚合物的脂质-聚合物共轭物的制备已有过记载，例如在美国专利第5,395,619号中，该专利清楚地结合在此作为参考，以及Zalipsky在STEALTH LIPOSOMES(D.Lasic和F.Martin编辑，CRC出版社，第9章(1995))中描述的。通常，在脂质体形成过程中包括在成脂质体组分中的是约1-20摩尔百分数之间的聚合物衍生脂质。
亲水性聚合物链提供了亲水性链的表面包衣，足以延长没有这种包衣的脂质体的血液循环时间。血液循环时间增加的程度是没有聚合物包衣时的数倍，如在我们共同拥有的美国专利第5,013,556号中所述的，该专利清楚地结合在此作为参考。
另外，脂质体可以制备成含有表面基团，诸如抗体或抗体片段、用于与细胞表面受体相互作用的小效应器分子、抗原和其他象用于实现所需的对特定细胞群的靶结合性能的化合物。此时，包括在脂质体中的脂质组分将包括用靶向分子衍生的脂质，或具有能用按照已知方法预先形成在脂质体中的靶向分子衍生的极性首化学基团的脂质。
C、多阴离子聚合物本发明的脂质体还包括包载在脂质体中的多阴离子聚合物。该聚合物是由优选类似化学结构的重复单元组成并具有可电离基团、也就是说能电离导致形成离子电荷、优选阴离子电荷的化学官能团的任何分子。分子量在从400-2,000,000道尔顿的较宽范围内的聚合物都可考虑。
适合用于本发明的多阴离子聚合物包括硫酸化的、磺化的、羧化的或磷酸化的亲水性聚合物。例如，硫酸化蛋白聚糖，诸如硫酸化肝素，硫酸化多糖，诸如硫酸化纤维素或纤维素衍生物，角叉菜胶，葡聚糖硫酸酯，粘蛋白，硫酸化多肽，诸如带有硫酸化氨基的聚赖氨酸，具有磺酸衍生糖类或肽亚单位的糖肽，和透明质酸。还可考虑硫酸软骨素A、B和C，硫酸角蛋白，硫酸皮肤素。
该聚合物也可以是经过修饰后包括阴离子官能团的中性聚合物。例如，直链淀粉、果胶、支链淀粉、纤维素和葡聚糖可以修饰成包括阴离子亚单位。
带有磺基的聚合物诸如聚乙烯硫酸酯、聚乙烯磺酸酯、聚苯乙烯磺酸酯和硫酸化松香树胶也是合适的。
如下文中所述，多阴离子聚合物在脂质囊泡形成过程中包载到脂质体中。药物一旦装载到脂质体中，聚合物就可将药物俘获或保留在脂质体中。在为支持本发明而进行的研究中，葡聚糖硫酸酯用作例举性的多阴离子聚合物。葡聚糖硫酸酯是每个葡糖酰基残基带有大约2.3个硫酸根的葡糖酐聚合物。它由占葡聚糖分支的大约95％的α-D-(1-6)键和剩余的(1-3)键组成。分子量在从5,000至500,000道尔顿范围内的该聚合物可轻易地获得。
II、脂质体制备用于本发明的脂质体制备成具有从内到外穿过脂质双层的离子梯度。该离子梯度然后用于将所需化合物装载到脂质体中。具有这种离子梯度包括氢离子和铵离子梯度的脂质体是本领域技术人员熟知的，并且容易使用已知方法制备。
在为支持本发明所进行的研究中，制备具有穿过脂质膜的铵离子梯度的脂质体。这类脂质体的制备先前已有过描述，例如在美国专利第5,192,549号中。此时，脂质体在含有铵盐的含水缓冲液中在合适的pH例如5.5至7.5下制备，所述铵盐一般是0.1至0.4M的铵盐，诸如硫酸铵或葡聚糖硫酸铵。脂质体形成并定型后，将外部介质转换为一种没有铵离子的介质，例如其中的硫酸铵被NaCl或能提供相同脂质体内外克分子渗透压浓度的糖取代的同一种缓冲液。
脂质体形成后，脂质体内部的铵离子与氨和质子达到平衡。氨能穿透脂质体双层，从脂质体内部逃逸。氨的逃逸使脂质体内的平衡不断向右移动，以产生质子。
按照本发明的另一个方面，描述了具有以和多阴离子聚合物形成配合物的形式包载在其中的喹诺酮抗生素的脂质体悬浮液的制备方法。如实施例2中所述，制备由氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和mPEG-DSPE(N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)组成的脂质体。这些脂质以50∶45.2∶4.8的摩尔比溶于乙醇中。将溶解的脂质加入到如实施例2中所述制备的葡聚糖硫酸酯铵盐溶液中，并混合1小时以形成大小不均匀且具有包载在脂质体中的葡聚糖硫酸酯铵盐的多层脂质体。
如实施例中所述，将该水合脂质体在压力下挤出，使脂质体的大小为约100-150nm直径。
脂质体形成后，将选定的药物装载到囊泡中。不过，该药物将在多阴离子聚合物的存在下配合或沉淀。因此在药物装载之前必须从外部悬浮液介质中除去任何未被包载的聚合物，以防止在脂质体外部介质中形成不期望的配合物。就环丙氟哌酸而言，沉淀在甚至非常少量例如0.1μg/mL的葡聚糖硫酸酯的存在下发生。从外部介质中事实上除去所有未被包载的聚合物是很重要的。
根据本发明这一方面的重要特性，未被包载的多阴离子聚合物在盐电解质的存在下通过渗滤除去。如实施例3中所述，使用葡聚糖硫酸酯铵盐在水合介质中形成的脂质体使用中空纤维超滤筒针对350mM NaCl进行渗滤。盐的存在降低了脂质体悬浮液的粘度并使聚合物凝缩以促进葡聚糖硫酸酯的去除。优选渗滤在导致任何未被包载的聚合物被充分去除的条件下进行，从而在药物装载步骤中见不到聚合物/药物配合物或沉淀。
在为支持本发明进行的研究中，平均分子量为8,000道尔顿的葡聚糖硫酸酯钠盐的去除通过将葡聚糖硫酸酯针对水和针对离子强度不同的各种盐溶液进行渗滤来检验。如实施例3所述，浓度为100mg/ml的葡聚糖硫酸酯溶液针对0.15M NaCl、0.35M NaCl、0.45M NaCl和1.0M NaCl进行渗滤。测定来自各个渗滤操作的渗透物中的葡聚糖硫酸酯，结果显示在图2中。从图中可看出，当针对具有增高的离子强度的溶液0.15M NaCl(实心方块)、0.35M NaCl(实心三角)、0.45MNaCl(实心圆)和1.0M NaCl(X标记)进行渗滤时更有效地除去了葡聚糖硫酸酯。表1中总结了用各种盐溶液交换10体积后保留在剩余物中的葡聚糖硫酸酯的量。
表1交换10体积后保留在渗滤溶液中的葡聚糖硫酸酯的浓度
总的来说，结果发现通过增高用于渗滤的溶液的离子强度(即从0mM至350mM NaCl)并将溶液的pH调节为中性范围(pH＝7.4)可除去99％以上的葡聚糖硫酸酯。
应当领会可以使用各种各样的电解质来提高渗滤过程中介质的离子强度。优选盐，诸如NaCl、KCl、Na2SO4和K2SO4。当然，用于聚合物最佳去除的电解质的量将根据聚合物和盐以及各自的相对量发生变化。一般说来，需要约150mM的电解质，更优选450mM，最多1000mM。电解质用量的上限将部分地由脂质体在溶液中的稳定性决定，因为穿过脂质体双层的离子梯度是确定的并随着电解质浓度的升高而增加。
渗滤介质的pH也可以调节以从外部介质中最佳地去除聚合物。在为支持本发明进行的研究中，使用NaCl作为电解质在中性pH(例如pH-7-7.5)下较好地去除了葡聚糖硫酸酯。
除去了未被包载的聚合物后，通过用预先形成的脂质体在能有效地将药物装载到脂质体中的条件下孵育药物溶液而将选定的药物装载到脂质体中。如实施例2所述，环丙氟哌酸通过用60-65℃间的脂质体孵育药物水溶液30分钟而装载到含有葡聚糖硫酸酯的脂质体中。然后通过渗滤除去任何未被包载的药物。
表2总结了使用上述脂质体制备和渗滤方法得到的四种脂质体制剂的性能。这些制剂包括作为举例的喹诺酮环丙氟哌酸，环丙氟哌酸的浓度使用分光光度法测定。总脂质含量通过测量总磷脂含量确定。颗粒大小的测量使用动态光散射确定。
表2包载了葡聚糖硫酸酯/环丙氟哌酸的脂质体
在为支持本发明进行的其他研究中，将多阴离子聚合物聚丙烯酸用作环丙氟哌酸的俘获剂。如实施例4所述，40∶45.2∶4.8摩尔比的脂质HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE与聚丙烯酸铵的水溶液水合。通过在电解质的存在下进行渗滤而从外部介质除去了未被包载的聚合物后，脂质体用环丙氟哌酸装载。将这些脂质体以及使用葡聚糖硫酸酯俘获剂形成的脂质体用于下文中所述的体外泄漏试验和体内药动学研究。
III、脂质体的特性描绘对如上所述制备的具有以和葡聚糖硫酸酯或与聚丙烯酸酯形成配合物的形式包载的环丙氟哌酸的脂质体进行体外和体内的特性描绘。
更具体地说，进行体外试验以确定在血浆的存在下环丙氟哌酸从脂质体泄漏的速率。如实施例5所述，制备脂质体并以50μg环丙氟哌酸/mL血浆的浓度在血浆中孵育。脂质体在37℃下在血浆中孵育4小时，在0、1、2和4小时的时候采样用于分析。
结果总结在实施例5中的表3A-3C中，作为时间的函数的保留在脂质体中的环丙氟哌酸的百分数显示于图3中。用葡聚糖硫酸酯俘获剂制备的脂质体(实心圆)具有实质上较低的环丙氟哌酸泄漏，孵育2小时后50％的药物保留在脂质体中。与此对照，具有包载的环丙氟哌酸但没有多阴离子俘获剂的脂质体制剂(空心方块，空心菱形)在大鼠血浆中孵育2小时后只有不到约10％的药物仍保留在脂质体中。
含有葡聚糖硫酸酯包载的环丙氟哌酸和聚丙烯酸酯包载的环丙氟哌酸的脂质体制剂进行体内测试，以确定用按照本发明制备的脂质体制剂给药的环丙氟哌酸的血液循环动力学。作为对照，还对动物给药含有硫酸铵/环丙氟哌酸、也就是不含聚合物俘获剂的脂质体。如实施例6所述，对大鼠静脉给药单次浓注剂量(40mg环丙氟哌酸/kg)。在最多24小时内的不同时间点从动物采集血样并分析环丙氟哌酸含量。结果总结在下文中的表5中并用图显示于图4A-4B中。
图4A显示了含有与葡聚糖硫酸酯结合的环丙氟哌酸的脂质体(实心圆)、含有与聚丙烯酸酯配合的环丙氟哌酸的脂质体(实心三角)和对照脂质体例如含有硫酸铵/环丙氟哌酸但不含聚合物俘获剂的脂质体(空心方块)的试验结果。从图中可看出，包载在没有多阴离子聚合物的脂质体中的环丙氟哌酸(空心方块)迅速从脂质体释放并从血流中清楚，约50％的注射剂量在给药后约1.5小时就去除了。与此对照，具有聚合物俘获剂的脂质体显示出明显更好的环丙氟哌酸的保留，具有葡聚糖硫酸酯聚合物俘获剂的脂质体(实心圆)和具有聚丙烯酸俘获剂的脂质体(实心三角)在2小时后血流中仍存在50％的环丙氟哌酸剂量。
图4B类似地显示了测试制剂的以μg/ml表示的环丙氟哌酸的血浆浓度，所述测试制剂是具有与葡聚糖硫酸酯配合的环丙氟哌酸的脂质体(实心圆；参见表5中的原始数据)；具有与聚丙烯酸酯配合的环丙氟哌酸的脂质体(实心三角，参见表5的原始数据)和在内部区域中含有硫酸铵包载的环丙氟哌酸但不含聚合物俘获剂的对照脂质体(空心方块，参见表5的原始数据)。因俘获剂导致的环丙氟哌酸在脂质体中的增强的保留明显产生了改善的血液循环寿命。当以不含聚合物俘获剂的脂质体形式给药时，给药后24小时血流中只保留了少许环丙氟哌酸。与此对照，当药物以包括聚合物俘获剂的脂质体给药时，在第24小时的时候血流中仍存在药物。
有关与葡聚糖硫酸酯结合的环丙氟哌酸、与聚丙烯酸酯结合的环丙氟哌酸和不含聚合物俘获剂的对照制剂的药动学参数AUC(曲线下面积)和Cmax总结在表6中。
表6脂质体环丙氟哌酸制剂的药动学参数
IV、实施例以下对比实施例和实施例说明了包括包载的环丙氟哌酸的脂质体的制备。这些实施例决不打算限制本发明的范围。
对比实施例1含有环丙氟哌酸的脂质体的制备具有聚乙二醇表面包衣的脂质体通过将氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、胆固醇和聚乙二醇衍生的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)以50∶45∶5的摩尔比分别在60-65℃下溶于50ml乙醇加以制备。制备350mM硫酸铵溶液(pH5.5)并加热至60-65℃。将溶解的脂质加入到硫酸铵溶液中并在60-65℃下混合1小时。所得多层脂质体通过0.4μm、0.2μm、0.1μm和0.08μm孔径的聚碳酸酯膜挤出，各进行8次。挤出过程在60-65℃下进行。挤出的脂质体具有大约100nm的平均直径。
这些脂质体然后针对350mM硫酸铵渗滤(交换10体积)，之后针对含有10％蔗糖的5mM NaCl渗滤(交换10体积)。
用10％蔗糖溶液以58mg/ml制备环丙氟哌酸储备溶液。通过将如上所述制备的脂质体与环丙氟哌酸溶液以0.71mg/mg的药物/脂质比混合并在60-65℃下孵育30分钟来进行活性药物的装载，此时采取等分试样并使用交联葡聚糖G-50柱测定药物装载百分数。药物装载百分数为56％(使用更低的药物/脂质比最多可达到94％的装载效率)。
未被包入的药物通过针对含有10％蔗糖的10mM组氨酸缓冲液pH6.5渗滤而除去。装载了环丙氟哌酸的脂质体通过0.2μm的膜无菌过滤并储存在2-8℃下。最终的脂质体具有101nm的平均直径和0.41mg/mg的药物/脂质比。
平均直径为142nm的另一种含有环丙氟哌酸的脂质体制剂使用上述相同的操作生产，只是对挤压技术稍作修改。
实施例2含有葡聚糖硫酸酯-环丙氟哌酸的脂质体的制备A、葡聚糖硫酸酯铵盐的制备葡聚糖硫酸酯，钠盐，分子量8,000道尔顿(Dextran ProductLimited(Ontario，Canada))如下所述转化为葡聚糖硫酸酯铵盐。柱床体积为400mL的离子交换柱用DOWEX 50X8-100离子交换树脂(Aldrich Chemical Co，Milwaukee，WI)填满。装好的柱子用2L 1NHCl以3-4mL/分钟的流速冲洗，直到洗脱的pH约为1-2。过量的HCl用2-3L去离子水从柱子上洗掉，直到洗脱水的pH大约为5.5。
将300mL葡聚糖硫酸酯钠盐(50mg/mL溶于水)加到树脂上并收集12份50mL的级分。将含有葡聚糖硫酸酯的级分(第3-12级分)合并，用5M氢氧化铵(大约25mL)将pH从1.29调节至5.5。
葡聚糖硫酸酯铵盐在1L圆底烧瓶中在4份150mL级分中冷冻干燥。将冻干的粉末以100mg/mL的浓度溶于5mM NaCl。溶液pH为5.4。
B、脂质体的制备如上所述制备8.75mM葡聚糖硫酸酯的溶液并加热到60-65℃之间。
将氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC，Lipoid K.G.Ludwigshafen，Germany)、胆固醇(Croda，Inc.New York，NY)和mPEG-DSPE(Sygena，Ltd，Liestal Switzerland)在60-65℃下以50∶45.2∶4.8的摩尔比溶于无水乙醇(Quantum Chemical，Cincinnati，Ohio)。将溶解的脂质加入到加热的葡聚糖硫酸酯溶液中，该混合物在60-65℃下混合1小时。总脂质浓度为106.38mg/mL，或150μmol/mL。
水合脂质体在压力下在60-65℃下通过0.2μm孔径的聚碳酸酯膜滤器挤出8-10次。
未被包载的聚合物通过针对NaCl溶液进行渗滤而从调整过大小的脂质体悬浮液中除去。使用中空纤维超滤筒(NMCO 300,000；A/G TechCorp.Needham，MA)，这些脂质体针对350mM NaCl，pH7.4进行渗滤，交换10个体积，然后针对150mM NaCl，pH7.4进行渗滤，交换10体积。
将足够的环丙氟哌酸(Bayer AG，Leverkusen，Germany)溶于150mM NaCl形成30mg/mL溶液。将该溶液加热至60℃使完全溶解。将药物溶液与脂质体悬浮液混合并在60-65℃下孵育30分钟，接着使用冰浴迅速冷却至室温。药物的包入百分数通过在尺寸排阻柱上将游离药物与脂质体囊泡分离并通过UV分光光度法定量每一级分中的药物的量来测量。
未包载的药物通过渗滤除去，针对150mM NaCl溶液交换5体积，然后针对10％蔗糖，10mM组氨酸，pH6.5交换10体积。
实施例3葡聚糖硫酸酯针对盐溶液的渗滤将葡聚糖硫酸酯钠盐(分子量8,000道尔顿，Dextran ProductsLimited，Scarborough，Ontario，Canada)以100mg/ml的浓度溶于蒸馏水。具有300,000分子量截止阀和0.79 ft2表面积的渗滤筒(A/G/Technology Corporation，Needham，MA)用2升蒸馏水洗涤。90mL的葡聚糖硫酸酯针对1000mL(约交换10体积)蒸馏水进行渗滤。体积交换液(各100mL)分开收集，各1mL用于葡聚糖硫酸酯定量。最终的剩余物用水调节到同一初始体积(90mL)，然后测定葡聚糖硫酸酯的含量。
使用0.15M NaCl、0.35M NaCl、0.45M NaCl和1.0M NaCl重复相同的渗滤操作。收集渗透物并使用1，9-二亚甲基蓝和590nm下的吸光度分析葡聚糖硫酸酯。结果显示于图2和表1中。
实施例4带有聚丙烯酸的脂质体制剂制备分子量为2,000道尔顿的250mM聚丙烯酸(AldrichChemicals，Milwaukee，WI)和50mM硫酸铵的水溶液并用5M NaOH将溶液的pH调节至5.5。
如实施例2中所述通过将溶解的HSPC、胆固醇和mPEG-DSPE以50∶45.2∶4.8的摩尔比与聚丙烯酸铵/硫酸铵水溶液水合来制备脂质体。按照实施例2除去未包载的聚合物并将环丙氟哌酸装载到脂质体中。
实施例5体外特性描绘环丙氟哌酸从按照实施例2和3制备的脂质体的泄漏率通过以50μg环丙氟哌酸/mL血浆的浓度孵育脂质体加以测定。脂质体在37℃下在血浆中孵育4小时，在第0、1、2和4小时的时候采样用于分析。各个样品中的脂质体利用固相萃取法(下面的实施例5B中陈述的)分离出游离药物并利用反向HPLC(下面的实施例5C陈述的)分析环丙氟哌酸的含量。结果总结于下面的表3A-3C中并显示在图3中。
表3A具有葡聚糖硫酸酯铵/环丙氟哌酸的脂质体
表3B具有硫酸胺/环丙氟哌酸的脂质体
*BQL＝低于定量限度表3C具有硫酸胺/环丙氟哌酸的脂质体
*BQL＝低于定量限度A、固相萃取法1、样品制备脂质体-环丙氟哌酸制剂用10％蔗糖/10mM组氨酸pH6.5稀释到环丙氟哌酸浓度约为2mg/mL。对于每种脂质体-环丙氟哌酸制剂，使1.95mL空白大鼠血浆在冰上急冷。在0时，将50μL冷冻脂质体制剂与冷冻血浆混合(环丙氟哌酸终浓度为50μg/mL)并取出两个100μL等分试样用于0时间点时的即时固相萃取。然后将该血浆/脂质体混合物置于37℃水浴中。在1、2和4小时的时候，混合混合物并取出一式两份100μL等分试样用于萃取。空白血浆以类似的方式制备，用10％蔗糖/10mM组氨酸，pH6.5缓冲液代替脂质体环丙氟哌酸制剂。在4小时的时候，从各个血浆/脂质体混合物取出另外一组一式两份的100μL等分试样用于总环丙氟哌酸测定。
2、固相萃取法SPE-24G固相萃取玻璃柱处理器(JT Baker，part # JT 7208-8)和用于固相萃取的Bond Elute LRC，C18筒，100mg，10mL(Varianpart # 1211-3001)用于萃取操作。在筒的下面连接20计量一次性针头以帮助收集样品。筒预先用2mL甲醇洗涤，接着用2mL盐水洗涤。通过使用约4-6Hg真空使以中度速度通过筒滴落，C18填料床永远也不允许干燥，直到萃取操作结束。筒的针头使用一次后抛弃。
将2mL容量瓶置于预期洗涤过的C18筒下用于收集样品。筒然后用200μL空白大鼠血浆预处理，以除去C18吸附剂上的活性部位。然后将血浆/脂质体混合物的100μL等分试样装载到C18床上。筒用1mL盐水洗涤，将洗脱液收集在下面的相同烧瓶中。这种盐水级分含有脂质体-环丙氟哌酸，其标记为“S级分”。
然后用1.6mL甲醇/0.1M NaH2PO4，pH2.2(9∶1，v/v)(酸化甲醇)从C18筒洗脱游离的环丙氟哌酸。洗液收集在第二个2mL容量瓶中，将C18填料吸干，取下所有样品。这种级分标记为“F级分”。
使用盐水将F级分和S级分调整到2.0mL体积。将在4小时的时候收集的用于测定总环丙氟哌酸的血浆/脂质体-环丙氟哌酸混合物的100μL等分试样也使用盐水稀释到2.0mL并标记为“总”。
B、对环丙氟哌酸的HPLC分析1、HPLC条件柱温30℃流速1mL/分钟运行时间12分钟检测UV在278nm下流动相25mM NaH2PO4，pH2.3/乙腈(87∶13)注入体积20μL
柱Water Symmetry C184.6×150mm，5微米，有前置柱“总”和“S级分”如下所述处理。将250μL级分与1000μL酸化甲醇涡旋混合，然后在10℃下以3000rpm(Sorvall RT6000)离心30分钟。将上清液转移到HPLC瓶中用于分析。
环丙氟哌酸系统精确样品和校准标准物用存在于盐水中的15％空白大鼠血浆制备，等分试样用与“总”和“S级分”相同的方式用酸化甲醇处理。环丙氟哌酸和脂质体包载的环丙氟哌酸优质对照样品用空白大鼠血浆制备，将样品的100μL等分试样用盐水稀释至2.0mL。稀释样品的等分试样然后用与“总”和“S级分”相同的方式用酸化甲醇处理。HPLC校正曲线范围是0.02-10μmg/mL，结果使用通过1/(浓度)2加权的最小二乘方线性回归进行拟合。
实施例6体内特性描绘A、脂质体制剂按照实施例1、2和4中陈述的操作制备具有下列组分的脂质体，此时脂质体的活性装载在脂质体利用乙醇水合法制备后使用硫酸铵浓度梯度完成。
表4用于体内试验的脂质体制剂
1硫酸铵内部2氢化大豆磷脂酰胆碱3甲氧基聚乙二醇二硬脂酰磷脂酰胆碱B、动物18只雄性Sprague-Dawley大鼠(220至250gms)从卖主(Simonsen Labs，Gilroy，Ca)购得并关在12小时12小时白天黑夜循环下的可随意获得食物(Lab DietTMLaboratory Rodent Diet #5001)和水的常规笼子里。动物在研究开始前至少关3天以确保它们健康状态良好。
C、研究设计经由外侧尾静脉以40mg/kg对大鼠单次静脉注射给药三种脂质体-环丙氟哌酸制剂之一。通过在下列时间经由眼眶后静脉窦将全血采集到7.5％EDTA抗凝剂中而从麻醉(吸入异氟烷)的动物获得血样给药后20分30秒、40分、1.5小时、3小时、5小时、7小时和24小时。将血样储存在冰中，直到在室温下以750xg离心20分钟，以得到血浆部分。血浆在-4℃下冷冻，直到用于通过反向HPLC测定总环丙氟哌酸(游离的加上被包载的)。
D、数据评估使用ADAPT II，4.0版药动学/药效学系统分析软件(D’Argenio和Schmutizky，ADAP II用户指南。Biomedical SimulationsResource，University of Southern California，Los Angles，CA)使用加权非线性回归用最大似然估计获得每只大鼠的药动学情况。用于环丙氟哌酸浓度的经验差异模型假定观察的残余(“误差”)标准偏差(σ)与真实值线性相关。模型的判定采用Akaikes信息标准(AIC)(Akaike，H.，自回归模型拟合的最小AIC规程的贝叶斯扩展，Biometika，66237-242(1979))。最大环丙氟哌酸浓度(Cmax)通过直接观测血浆浓度得到，从0时间点到无限大的平稳状态下的曲线下面积(AUCss)通过数值积分确定。
血浆环丙氟哌酸浓度总结在表5中并用图显示于图4A-4B中。来自该体内研究的药动学参数显示于上文中的表6中。
表5血浆环丙氟哌酸浓度
*BQL＝低于定量限度尽管本发明已根据特定实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员来说，显然可以在不背离本发明的情况下进行各种变化和修饰。
权利要求
1.一种脂质体组合物，它包含由成囊泡脂质组成的脂质体的悬浮液；在脂质体中含有氟喹诺酮化合物和能有效地与氟喹诺酮形成配合物并增强氟喹诺酮在脂质体中的保留的多阴离子聚合物。
2.权利要求1的组合物，其中所述氟喹诺酮是6-氟喹诺酮。
3.权利要求2的组合物，其中所述6-氟喹诺酮选自下列成员诺氟沙星、环丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟罗沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
4.权利要求1的组合物，其中多阴离子聚合物是包括选自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的阴离子基团的聚合物。
5.权利要求1的组合物，其中多阴离子聚合物选自葡聚糖硫酸酯、硫酸软骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
6.权利要求1的组合物，其中脂质体进一步包括用亲水性聚合物衍生的脂质。
7.权利要求6的组合物，其中亲水性聚合物是聚乙二醇。
8.权利要求7的组合物，其中多阴离子聚合物是葡聚糖硫酸酯，而6-氟喹诺酮是环丙氟哌酸。
9.增强6-氟喹诺酮在脂质体中的保留的方法，该方法包括制备由成囊泡脂质组成的脂质体，脂质体具有包载的多阴离子聚合物；在6-氟喹诺酮化合物的存在下在能有效地使化合物摄取到脂质体中并使化合物与多阴离子聚合物配合的条件下孵育这些脂质体。
10.权利要求9的方法，其中6-氟喹诺酮选自下列成员诺氟沙星、环丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟罗沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
11.权利要求9的方法，其中多阴离子聚合物是包括选自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的阴离子基团的聚合物。
12.权利要求9的方法，其中多阴离子聚合物选自葡聚糖硫酸酯、硫酸软骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
13.权利要求9的方法，其中脂质体进一步包括用亲水性聚合物衍生的脂质。
14.权利要求13的方法，其中亲水性聚合物是聚乙二醇。
15.权利要求14的方法，其中多阴离子聚合物是葡聚糖硫酸酯，而6-氟喹诺酮是环丙氟哌酸。
16.具有以和多阴离子聚合物共沉淀的形式包载在脂质体中的6-氟喹诺酮的脂质体悬浮液的制备方法，该方法包括形成脂质体的悬浮液，使具有包括多阴离子聚合物的内部水相和包括多阴离子聚合物的外部相；通过加入能有效地增加外部体相的离子强度并能有效地凝缩聚合物的盐而从外部相除去任何未被包载的多阴离子聚合物；通过在6-氟喹诺酮的存在下在能有效地使6-氟喹诺酮摄取到脂质体的内部水相中的条件下孵育这些脂质体而将6-氟喹诺酮装载到脂质体中；和从外部相除去任何未被包载的6-氟喹诺酮。
17.权利要求16的方法，其中所述除去包括通过缩合的多阴离子聚合物的膜渗滤除去。
18.权利要求16的方法，其中盐选自下列成员NaCl、KCl、Na2SO4和K2SO4。
19.权利要求16的方法，其中装载包括装载选自下列成员的6-氟喹诺酮诺氟沙星、环丙氟哌酸、氧氟沙星、西洛沙星、洛美沙星、氟罗沙星、培氟沙星和氨氟沙星。
20.权利要求16的方法，其中形成包括形成具有以包括选自硫酸根、磺酸根、磷酸根和羧酸根的阴离子基团的聚合物作为多阴离子聚合物的脂质体。
21.权利要求16的方法，其中多阴离子聚合物选自葡聚糖硫酸酯、硫酸软骨素A、聚乙烯硫酸和多磷酸。
全文摘要
本发明描述了用于增强喹诺酮化合物、特别是氟喹诺酮化合物的保留的脂质体组合物。脂质体中包载的是能有效地与氟喹诺酮形成配合物的多阴离子聚合物。还描述了这类脂质体的制备方法,该方法包括除去未被包载的多阴离子聚合物的过程。
文档编号A61K47/32GK1351495SQ00807566
公开日2002年5月29日 申请日期2000年4月28日 优先权日1999年4月29日
发明者L·S·S·郭, R·基万 申请人:阿尔萨公司