专利名称：作为可口服给予的药物的载体的蛋白质复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质复合物，其包括来自A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌(Clostridium botulinum)的一种或多种复合蛋白或衍生物以及选择的多肽或低分子量药物。
大多数低分子量药物可口服给药。这些物质穿过肠粘膜并进入血循环且因而全身有效并通过血循环系统到达它们发挥它们的作用的部位。此种途径不能用于蛋白质性药物、酸不稳定的药物以及表现不利的电荷的药物。多种机制阻止蛋白质的吸收。从在胃中开始，多种蛋白质因为低pH而变性并丧失它们的生物活性。此外，蛋白质被多种胰蛋白酶(尤其是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶)降解成它们的氨基酸残基，这些氨基酸残基转而可被吸收。即使蛋白质在蛋白水解攻击下残留下来且安全地到达小肠，其也会因为小肠壁对较高分子量物质不透性以避免机体被抗原充溢(overflooding)而不能顺利地被吸收。再者，多种现有药物因为分别具有不利的电荷和疏水性而不被吸收。
正是因为这些原因，口服给药的蛋白质性药物或疫苗，特别是低分子量药物，不能发挥任何作用。它们必须经注射，或者例如，经鼻施用而到达它们发挥作用的部位。
许多开发涉及克服上面所提及的障碍的目的。为了保护蛋白质和特定的低分子量药物免于在胃肠道失活和降解，可以将它们包封入耐胃性(stomach-resistant)胶囊之内，该胶囊将在小肠中溶解并释放药物活性蛋白质或低分子量药物。这种方法的缺点在于蛋白质和低分子量药物将不被降解。不过，这些成分仍然不能穿透小肠壁。其它的开发企图受益于用来将物质主动转运通过肠粘膜的载体系统，例如维生素B的载体系统。单独采用时，这些方法都不成功，而是需要另外将蛋白质和不稳定的低分子量药物于初始就保护起来。
此目的由所附的权利要求中定义的主题物质解决。
图1示意地绘出本发明的含有破伤风毒素的蛋白质复合物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％)的结果。
蛋白质复合物由至少一种血凝素和任选的至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的肉毒杆菌毒素复合物的无毒非血凝性蛋白质(non-toxic non-hemagglutinizing protein，NTHT)组成。
本文中所用的术语“肉毒杆菌毒素复合物”意指A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的天然存在的蛋白质复合物，其包括肉毒杆菌毒素、血凝素和无毒非血凝性蛋白质(NTHT)。
本文中所用的术语“多肽”或“选择的多肽”意指由至少两个氨基酸残基组成的肽。多肽可以是线性的、环状的或支链的。再者，多肽可以由一条以上氨基酸链组成，其中链可以彼此连接，例如通过二硫键连接。多肽可以进一步含有修饰的氨基酸残基以及标准的翻译后修饰如糖基化。多肽可以是药理学活性的或免疫活性的多肽或用于诊断目的的多肽，如抗体或配体。
肉毒梭状芽孢杆菌细菌菌株已经在进化过程中发现了一条透过胃肠道将完整蛋白质—肉毒梭状芽孢杆菌毒素引入哺乳动物血循环中的途径。
肉毒梭状芽孢杆菌因它们的毒素而被分类为8种血清型A、B、C1、C2、D、E、F和G型。本文以下经常称为肉毒杆菌毒素的蛋白质是具有约150kDa的分子量的蛋白质。肉毒杆菌毒素常随着污染的食物被摄入，经肠吸收并到达其发挥作用的部位，亦即运动终板，在此处神经冲动被传递到肌肉。毒素被神经细胞摄取并麻痹神经末梢的乙酰胆碱分泌机制而使得所涉及的肌肉不再活化而只是松弛。
不过，肉毒杆菌毒素不是以无保护的形式从肉毒梭状芽孢杆菌分泌出而是以复合的形式产生，亦即，梭状芽孢杆菌细胞不仅产生肉毒杆菌毒素，而且还产生各种其它的蛋白质，这些蛋白质与毒素一起形成分子量约为700到约900 kDa的复合物，肉毒杆菌毒素复合物。于各种研究中可以证实肉毒杆菌毒素复合物的形成为肉毒杆菌毒素口服毒性所需。可以证实在肉毒杆菌毒素复合物中的肉毒杆菌毒素表现出比纯肉毒杆菌毒素高约100000倍的毒性。可想象血凝素用来将复合物附着到小肠壁，从而能够转运通过肠粘膜进入血循环。再者，已报导该复合物起保护毒素对抗胃肠道中的蛋白酶的作用。
其它蛋白质(复合蛋白)为多种血凝素和表现出约120kDa的分子量的无毒非血凝性蛋白质(NTHT)。对于A型肉毒杆菌毒素复合物，有述及下列血凝素约16.9kDa的Ha2，约21kDa的Ha3a，约52kDa的Ha3b和约35kDa的Ha1。
其它B到G型毒素的复合物都采用一种类似的程序构建。举例而言，B型复合物，除NTHT之外，还包括分子量约70kDa的Ha-70，分子量约17kDa的Ha-17与分子量约33kDa的Ha-33(参阅，Bhandari，M.等，Current Microbiology 35，207-214(1997))。
此外，East，A.K.等，System Appl.Microbiol.17，306-313(1994)述及B型Ha-33的序列，作为与A型和C型的序列的比较。同样类似于A型，除了分子量约33kDa的Ha-33(＝Ha1)之外，也述及C型和D型中，分子量约53kDa的Ha-3b与分子量约22到24kDa的Ha3a和分子量约17kDa的Ha2(参阅，Inoue，K.等，Microbiology 145，2533-2542(1999))。
不过，所形成的复合物表现出取决于它们的血清型的不同的组成。亦即，在这些复合物中分别整合着不同数目的血凝素和NTHT。对于A型复合物，已由例如，Inoue等，Infection and Immunity 64(5)，1589-1594(1996))计算出下列组成
因此，本发明的一个方面为提供一种蛋白质复合物，其包括至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的一种或多种复合蛋白或它们的衍生物。该蛋白质复合物进一步包括选择的多肽或低分子量药物，这些多肽或低分子量药物分别受到本发明的蛋白质复合物的保护以在口服给予时免于被胃肠道中的蛋白酶或酸降解且因而该复合蛋白使它们全身有效。选择的多肽可以是一种药理学活性的，免疫活性的多肽或用于诊断目的的多肽。选择的低分子量药物同样可以是一种药理学活性的，免疫活性的药物或用于诊断目的的药物，或任何其它药物。因此，本发明的蛋白质复合物用作转运载体，将选择的多肽和低分子量药物引入动物，优选是哺乳动物或鸟类，或优选是人的血系统内，且因此将它们转运到它们的作用部位。因此，本发明的另一方面是提供一种蛋白质复合物，其作为人和/或兽医中的治疗剂、疫苗或诊断剂。本发明的再一方面是包括至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的一种或多种复合蛋白的蛋白质复合物作为药理学活性的多肽或低分子量物质(药物)、免疫活性的多肽或低分子量物质(药物)或用于诊断目的的多肽或低分子量物质(药物或诊断药物)的转运载体的用途。
蛋白质复合物由血凝素和NTHT组成且可等同于A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的天然存在的复合物。不过，该蛋白质复合物可以表现出与其天然组成不同的组成。例如，其可以只由血凝素组成而没有NTHT蛋白。再者，该蛋白质复合物可以由比天然存在的复合物少的类型的血凝素组成，优选由三种不同类型的血凝素组成，优选由两种且更优选由一种类型的血凝素组成，其中该蛋白质复合物可以包括NTHT蛋白，或可以不包括此种蛋白。该蛋白质复合物可以进一步由一种或多种类型的血凝素和/或不同血清型的NTHT蛋白的混合物组成。
优选为对应于来自A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的天然存在的蛋白质复合物的蛋白质复合物，例如具有Ha1、Ha2、Ha3a、Ha3b和B型肉毒梭状芽孢杆菌NTNH的蛋白质复合物。此外，该蛋白质复合物可以由Ha1、Ha2、Ha3a和NTNH组成；由Ha1、Ha2、Ha3b和NTNH组成；由Ha1、Ha3a、Ha3b和NTNH组成；由Ha2、Ha3a、Ha3b和NTNH组成；由Ha1、Ha2和NTNH组成；由Ha1、Ha3a和NTNH组成；由Ha1、Ha3b和NTNH组成；由Ha2、Ha3a和NTNH组成；由Ha2、Ha3b和NTNH组成；由Ha3a、Ha3b和NTNH组成；或由所列出的复合蛋白的其它任意组合组成。该蛋白质复合物可以进一步由血凝素和NTNH中的一种组成。此外，该蛋白质复合物可以由上面所列出的血凝素的组合组成而没有NTNH。根据范例B型蛋白质复合物，进一步优选的蛋白质复合物为由血凝素和/或A、C1、C2、D、E、F或G型NTNH组成的那些。
进一步优选的为根据本发明的蛋白质复合物，其中一种或多种复合蛋白通过化学键而结合到选择的多肽或低分子量药物上。此键可以在吸收入血后被切断使得该多肽或低分子量药物可以到达其部位以发挥其作用。选择的多肽或低分子量药物可以通过交联剂而结合到复合蛋白上。优选的交联剂为，例如，N-(4-叠氮基苯硫基)苯邻二甲酰亚胺、4，4′-二硫代双-苯基叠氮基、二硫代双丙酰亚胺酸酯(dithiobispropionimidate)、3，3′-二硫代双(磺基丁二酰亚胺-丙酸酯)、乙基-4-叠氮基苯基-1，4-二硫代丙酸酯、N-磺基丁二酰基-(4-叠氮基苯基)-1，3′-二硫代丙酸酯、磺基丁二酰基-2-(对叠氮基水杨胺)-乙基-1，3′-二硫代丙酸酯、N-丁二酰亚胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯或双-(2-(丁二酰亚胺氧基羰氧基)-乙基)砜。优选为通过化学键连接到选择的多肽或低分子量药物的单一复合蛋白。
本发明的另一方面是提供一种制备本发明的蛋白质复合物的方法。该方法包括下列步骤
a)在pH 2.0至6.5下从肉毒梭状芽孢杆菌分离至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素复合物，b)将pH升高到7.0至10.0，c)利用层析程序分离肉毒杆菌毒素和复合蛋白，d)将步骤c)中所得复合蛋白与选择的多肽或低分子量药物混合，或d’)将步骤c)中所得复合蛋白分离并将至少一种复合蛋白与选择的多肽或低分子量药物混合，及e)将来自步骤d)或d’)的混合物用pH 2.0至6.5的缓冲剂进行透析，以及任选地f)将复合蛋白通过化学键与选择的多肽或低分子量药物偶联。
优选的方法为其中在步骤d)或d’)中混合的至少两种复合蛋白衍生自单一或不同的肉毒杆菌毒素复合物类型。
复合蛋白可以分离自天然肉毒杆菌毒素复合物。一种用于它们的分离的范例方法如下面所述首先在酸性pH，优选pH 2.0至6.5，更优选pH 4.0至6.5，更优选pH 6.0下分离梭状芽孢杆菌细胞的肉毒杆菌毒素复合物。在将pH升高到7.0至10.0，优选7.0至8.0之后，利用层析程序分离肉毒杆菌毒素。此程序可以进行是因为该复合物在pH＜6.5下稳定且在中性与碱性pH下分解并释放出毒素。另一要口服给药的多肽可于随后加到无毒素的复合蛋白中。通过用蛋白质化学中的常规缓冲剂，特别是磷酸盐、乙酸盐或柠檬酸盐缓冲剂，在pH 2.0至6.5，优选4.0至6.0，更优选pH 5.5下进行透析而使pH降低。在这些步骤的过程中，形成一种新的复合物，其确保所结合的多肽的口服生物利用度。
也可以将蛋白质化学中的标准的其它层析程序、浓缩和沉淀程序用于复合蛋白的分离。
这些复合蛋白因其DNA序列已知，所以可以在特定宿主生物体内利用DNA重组技术生产。这样产生的复合蛋白可能表现出进一步的修饰，亦即，它们可以是这些复合蛋白的衍生物。修饰不仅意指缺失、添加、插入或取代，而且也包括氨基酸的化学修饰，例如甲基化或乙酰化以及翻译后修饰，例如，糖基化或磷酸化。在不同宿主内的期望蛋白质的表达属于本领域技术人员的常识而不需要进一步说明。形成蛋白质复合物所需的复合蛋白可以单独或同时在宿主生物体内表达。优选在细菌，例如，大肠杆菌(E.coli)、小枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)和/或艰难梭状芽孢杆菌(Clostridium difficile)，或在真核细胞，例如，CHO细胞内，在昆虫细胞内，例如，利用杆状病毒系统，或在酵母细胞内产生重组复合蛋白。复合蛋白可以根据上述程序分离并加到选择的多肽或低分子量药物中。再者，选择的多肽可以与复合蛋白同时在宿主生物体内表达。特别优选为个自的复合蛋白与选择的多肽通过在酵母体内YAC同时或分别生产。
本发明的蛋白质复合物可以进一步由重组产生的复合蛋白与从天然肉毒杆菌毒素复合物分离的复合蛋白的混合物组成。
可以利用本发明的蛋白质复合物口服给药的药理学活性的或免疫活性的多肽可以是以前要非肠道给药的任何治疗或预防有效的多肽。该多肽可以为，例如，激素、细胞因子、酶、生长因子、抗原、抗体、抑制剂、受体激动剂或拮抗剂，或为凝血因子。该多肽是重组制备或是从它们的天然来源分离都没有关系。优选的多肽为胰岛素、红细胞生成素、干扰素、白细胞介素、HIV蛋白酶抑制剂、GM-CSF(粒细胞/巨噬细胞刺激因子)、NGF(神经生长因子)、PDGF(血小板衍生生长因子)、FGF(成纤维细胞生长因子)、血纤维蛋白溶酶原-激活剂，例如，t-PA(组织血纤维蛋白溶酶原激活剂)，肾素抑制剂、人生长因子、IGF(胰岛素样生长因子)、疫苗如破伤风疫苗、乙型肝炎疫苗、白喉疫苗，抗体如herceptin(抗Her2的抗体)、抗TNF(肿瘤坏死因子)的抗体、降钙素、尿激酶、链激酶、血管发生抑制剂、凝血因子VIII、凝血因子Xa拮抗剂、金属蛋白酶抑制剂。
用于诊断目的的多肽可以为，例如，抗体或配体，其中该多肽可以表现为标记。该标记可以为在人或动物体内可检测的任何标记。优选的标记为同位素，例如，13C或放射性标记。经标记的抗体可以用来检测肿瘤，经标记的配体可以用来检测，例如，病理性受体(pathologic receptors)。
可供生物利用的低分子量药物可以为，例如，新霉素、沙丁氨醇、乙氨嘧啶、甲氧西林、哌替定、氯胺酮或美芬新。
下面的实施例用以更详细地解释本发明，而不应被视为用以限制本发明。
毒素特异性抗体通过用0.1 M甘氨酸pH2.7洗脱而得到(产量1.57毫克)。将1.25毫克纯化的神经毒素抗体固定化在1克CNBr-Sepharose上。随后，将11.6毫克复合物(在Q Hyper-D层析之后)在50mM Tris/HCl pH7.9，2mM EDTA pH7.9中的溶液通过此抗体亲和柱予以层析。将溶液重复地循环通过该柱过夜(16小时)，采用的流速为40毫升/小时。含有结合的神经毒素的复合物可以用0.1M甘氨酸pH2.7予以释放。在经亲和纯化的复合物(9.8豪克)中，在生物检测检定(膈检验/检定(phrenic test/assay)Goeschel等，ExperimentalNeurology 147，96-102(1987))中不再可以检测到神经毒素。实施例4具有破伤风毒素的本发明的蛋白质复合物的形成(A)将200微克纯破伤风毒素添加到1毫克纯化的复合蛋白在1毫升50mM Tris/HCl-缓冲剂，pH8.0中的溶液之中。随后，将其用50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲剂pH6.0透析过夜。取一液份(25微升)在凝胶过滤柱(Bioselect SEC 250-5)上于50mM Na-柠檬酸盐缓冲剂中分析。出现一单峰，该峰对应于约500kDa的分子量。对该峰的部份施以SDS-PAGE。可以检测到复合蛋白和破伤风毒素的两个条带。因此，具有异种毒素的新的蛋白质复合物已经形成。
(B)将6毫克破伤风毒素和6毫克脱辅基复合物(参见实施例3)在3毫升Tris/HCl，pH7.9，2mM EDTA中的溶液用50mM磷酸钠，250mM NaCl，2mM EDTA，pH7.0在2-8℃下透析两天，随后用相同的缓冲剂但为pH6.0透析五天。其后，于1.5毫升此溶液内加入346微升4M硫酸铵(→0.75M)，从而沉淀出复合物。将团粒溶解在50mM磷酸钠，150mM NaCl，2mM EDTA，pH5.9中，并取其一液份通过凝胶过滤予以分析。为此目的，使用Biosep SEC 3000 7.8×300mM(Phenomenex)(流速0.5毫升/分)。＞90％的蛋白质于高分子量峰(Mr＞500000)处洗脱。该峰部份在12％SDS-PAGE中的分析证实蛋白质复合物包括破伤风毒素。破伤风毒素的存在在膈检定中得到确定。实施例5用破伤风毒素-蛋白质复合物在小鼠中的体内检定将1毫克破伤风毒素加到5毫克纯化的复合蛋白在2.5毫升50mM Tris/HCl，pH8.0中的溶液中。随后，将其用50mM柠檬酸盐磷酸盐缓冲剂pH6.0透析过夜。取25微升溶液分析蛋白质复合物中破伤风毒素的存在(参见实施例4(A))。分别通过咽管/探具给予5只CD1小鼠0.5毫升。用等量的破伤风毒素处理另外3只小鼠(对照组)。用破伤风毒素-蛋白质复合物处理的小鼠在24小时之后死于破伤风，而对照小鼠则没有表现出任何破伤风迹象。实施例6用破伤风毒素-蛋白质复合物在大鼠中的体内检定5只Wistar大鼠(180-200克)分别用2微克本发明的蛋白质复合物在0.5毫升磷酸钠，150mM NaCl，2mM EDTA，100微克BSA/毫升，pH6.0中的溶液通过咽管/探具予以处理(参见实施例4(B))。另外3只大鼠(对照组)用等量的破伤风毒素在相同缓冲剂中的溶液予以处理。用破伤风毒素-蛋白质复合物处理的大鼠在24小时之内死于破伤风，而对照大鼠则没有表现出任何破伤风迹象。实施例7具有胰岛素的本发明的蛋白质复合物的形成(A)将10毫克纯化的复合蛋白与0.5毫克胰岛素在50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲剂中透析过夜。取其一份样品在凝胶过滤中分析复合物的形成。出现对应于分子量＞500kDa的峰。取一液份该峰部分在SDS-PAGE中分析。该峰部份同时含有复合蛋白的条带以及胰岛素的条带。
(B)将3毫克纯化的复合蛋白与0.5毫克胰岛素用50mM磷酸盐缓冲剂pH7.0透析两天，接着用50mM磷酸盐pH6.0透析五天。随后，再次进行硫酸铵沉淀。取一样品利用凝胶过滤分析复合物的形成。其出现对应于分子量＞500kDa的峰。取一液份该峰的部份在SDS-PAGE中分析。该峰部份同时含有复合蛋白的条带以及胰岛素的条带。实施例8用小鼠进行葡萄糖压力试验(Glucose Stress test)在测定过血糖水平之后，将1毫升10％蔗糖溶液通过咽管/探具给予10只CD1小鼠。将1毫克胰岛素-蛋白质复合物通过咽管/探具分别给予5只小鼠。于30分钟间隔中测定小鼠的血糖水平。结果为经处理的小鼠的血糖水平低于未处理的小鼠的平均血糖水平25～40％。实施例9用大鼠进行葡萄糖压力试验在测定过血糖水平之后，将1毫升10％蔗糖溶液通过咽管/探具给予6只Wistar大鼠。将0.5毫克胰岛素-蛋白质复合物通过咽管/探具给予3只大鼠。于30分钟间隔中测定大鼠的血糖水平。结果为经处理的大鼠的血糖水平低于未处理的大鼠的平均血糖水平25～40％。实施例10对抗破伤风的口服免疫(A)在30毫克复合蛋白制剂中加入3毫克破伤风类毒素(突变的破伤风毒素)。将该混合物用50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲剂pH5.5透析过夜。将1毫克破伤风类毒素-蛋白质复合物通过咽管/探具给予5只CD1-小鼠。于两周和六周之后给予相同的剂量。在最后处理的两周之后取血并利用ELISA测定抗体效价。小鼠已发展出对抗毒素的抗体效价(＞1∶1000)，此不同于接受相同剂量的没有结合到复合物的类毒素的五只对照小鼠。另外，在中和检定中显示血清使该毒素的活性失活。
(B)在10毫克复合蛋白制剂中加入3毫克破伤风类毒素(突变的重组破伤风毒素)。将该混合物用50mM磷酸盐缓冲剂pH7.0透析两天，随后在pH6.0下透析3天。通过咽管/探具分别给予5只CD1-小鼠0.5毫克破伤风类毒素-复合物。两周和六周之后给予相同的剂量。在最后处理两周之后取血并利用ELISA测定抗体效价。小鼠已发展出对抗毒素的抗体效价(＞1∶1000)，此不同于接受相同剂量的没有结合到复合物的类毒素的五只对照小鼠。另外，在中和检定中显示血清使该毒素的活性失活。实施例11具有A型肉毒梭状芽孢杆菌重组复合蛋白的复合物的制备为了制备重组复合物，在大肠杆菌中制备不同的蛋白质成分(参阅Fujinaga，Y.等，FEBS Letters 467，179-183(2000))。该方法类似于在大肠杆菌中以pGEX-SX-3表达载体制备GST融合蛋白质形式的血凝素((HA 1Mr约33kDa，HA 2Mr约17kDa，HA 3aMr约21kDa，HA 3bMr约48kDa)。在通过谷胱甘肽-Sepharose 4B柱纯化之后，利用因子Xa将谷胱甘肽-S转移酶切掉。分离因子Xa和GST之后，分离纯的重组蛋白。采用相同的方法，已制备无毒，非血凝性复合蛋白。将重组复合蛋白用50mM Tris/HCl缓冲剂pH8.0透析过夜(蛋白质浓度为1-1.5毫克/毫升)。
为了制备具有破伤风毒素的复合物，将诸成分按照下面的摩尔比混合
将该蛋白质混合物用50mM柠檬酸钠缓冲剂pH5.5透析16小时。取25微升样品利用凝胶过滤分析复合物的形成。该蛋白质出现在对应于分子量约500kDa的峰。该峰部份在SDS-PAGE中的分析得知不仅含有复合蛋白而且也含有破伤风毒素(150kDa)。实施例12用小鼠进行的对重组复合物检定用三只CD1小鼠对实施例10(A)中所述的复合物进行测试。将50微克重组复合物通过咽管/探具给予小鼠。所有三只小鼠都在48小时之内死于破伤风，而给予等量纯破伤风毒素(11微克)的三只小鼠都没有显示出破伤风的迹象。
权利要求
1.一种蛋白质复合物，其包括来自至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的一种或多种复合蛋白以及选择的多肽或低分子量药物，其中选择的多肽不是肉毒杆菌毒素。
2.如权利要求1的蛋白质复合物，其中复合蛋白为至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的几种复合蛋白的混合物。
3.如权利要求1或2的蛋白质复合物，其中选择的多肽为药理学活性的，免疫活性的多肽或用于诊断目的的多肽。
4.如权利要求3的蛋白质复合物，其中药理学活性的或免疫活性的多肽为激素、细胞因子、酶、生长因子、抗原、抗体、抑制剂、受体激动剂或拮抗剂或凝血因子。
5.如权利要求3的蛋白质复合物，其中用于诊断目的的多肽为标记的抗体或标记的配体。
6.如权利要求1或2的蛋白质复合物，其中低分子量药物为新霉素、沙丁氨醇、乙氨嘧啶、甲氧西林、哌替定、氯胺酮或美芬新。
7.如权利要求1到6之任一项的蛋白质复合物，其中复合蛋白通过化学键结合到选择的多肽上或与低分子量药物结合。
8.如权利要求1到7之任一项的蛋白质复合物，其在人和/或兽医中作为治疗剂、疫苗或诊断剂。
9.一种制备如权利要求1到7之任一项的蛋白质复合物的方法，所述方法包括下列步骤a)在pH 2.0至6.5下从肉毒梭状芽孢杆菌分离至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒杆菌毒素复合物，b)将pH升高到7.0至10.0，c)利用层析程序分离肉毒杆菌毒素和复合蛋白，d)将步骤c)中所得复合蛋白与选择的多肽或低分子量药物混合，或d’)分离步骤c)中所得复合蛋白并将至少一种复合蛋白与选择的多肽或低分子量药物混合，及e)将来自步骤d)或d’)的混合物用pH 2.0至6.5的缓冲剂进行透析，以及任选地f)将复合蛋白通过化学键与选择的多肽或低分子量药物偶联。
10.如权利要求9的方法，其中在步骤d)或d’)中混合的至少两种复合蛋白衍生自单一类型或数种不同类型的肉毒杆菌毒素复合物。
11.一种制备如权利要求1到7之任一项的蛋白质复合物的方法，其中复合蛋白是利用重组DNA技术生产的。
12.一种包括至少一种A、B、C1、C2、D、E、F或G型肉毒梭状芽孢杆菌的一种或多种复合蛋白的蛋白质复合物作为药理学活性的多肽或低分子量物质、免疫活性的多肽或低分子量物质，或用于诊断目的的多肽或低分子量物质的转运载体的用途。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白质复合物，其包括从A、B、C
文档编号A61K31/505GK1443196SQ01813090
公开日2003年9月17日 申请日期2001年7月19日 优先权日2000年7月19日
发明者汉斯·拜格克, 杰根·佛耶莫尔特 申请人:拜欧特康生化科技开发与咨询有限公司