专利名称：多功能干细胞的耐受性同种异体移植物的制作方法
技术涉及范围本发明涉及的领域是胚胎细胞的细胞生物学和移植免疫学。具体来说，本发明描述如何用某种技术使病人产生特异性免疫耐受性，从而可以接受由多功能干细胞制备的同种异体移植物。
相关申请的引用本申请要求对美国临时专利申请(60/52,688,2000年11月22日归档，待批准)的优先权。为了在美国实施该专利申请，谨在此提交全文进行优先权申请。
专利背景前体细胞的研究如今已经成为医学界的一大热点。人体的许多组织都有前体细胞库，一旦组织细胞自然衰老或因伤而受损害，前体细胞就可以取而代之。
美国专利5,750,397(Tsukamoto等，Systemix公司)报道了大体造血干细胞Thy-1+和CD34+的分离和培养，同时指出这些细胞可以分化出淋巴细胞系，，红细胞系和骨髓单核细胞系等不同世系。美国专利5,736,396(Bruder等)报道了一些方法，利用合适的生物活性因子，定向诱导了所分离的人体间充质干细胞的分化。所得到的细胞可以输入宿主体内，用于间充质组织的再生和修复。
美国专利5,716,411(Orgill等)提出使用在烧伤或创伤部位上皮组织的自体移植物使皮肤再生。美国专利5,766,948(F.Gage)报道了利用动物脑组织生成成神经的一种方法细胞。美国专利5,672,499(Andeson等)报道从胚胎组织获得了神经嵴干细胞。美国专利5,851,832(Weiss等，Neurospheres公司)报道了从8-12周龄的胎儿体中分离出假定的神经干细胞。美国专利5,968,829(M.Carpenter)报道了由成人的初级中枢神经系统组织分化出了神经干细胞。
美国专利5,082,670(F.Gage)报道了移植遗传改造过的细胞用于治疗中枢神经系统的天然缺陷疾病或损伤的一种方法。Auerbach等(Eur.J Neurosci，第12期1696页，2000年)报道了多功能中枢神经系统细胞植入动物大脑后，形成了具有电生理活性和生物功能相关性的神经元。Brustle等(Science，第285期754页，1999年)报道了由胚胎干细胞分化的前体细胞可以与宿主神经元发生互相作用，并能在大脑和脊髓有效地使神经轴索形成髓鞘。
据认为胚胎干细胞可以分化成几乎所有的细胞类型，因此对其发展引起了人们的众多关注。直到最近，小鼠是唯一被分离出胚胎干细胞的哺乳动物。Thomson等最近也分离并培养出各种低等灵长类动物的多功能干细胞(美国专利5,843,780，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第92期7844，1995年，Biol.Reprod.5期254页，1996年)，之后又分离出人的多功能干细胞(Science 282卷，114页，1998年).Gearhart和其同事(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第95期13726页，1998年，及美国专利6,090,622)从胎儿的性腺组织培养出若干人胚胎生殖细胞(hEG)系。在国际申请WO 99/20741中(Geron公司)论述了制备源自灵长类动物的原始型干细胞的若干方法和材料。
hES和hEG这两种细胞都具有多功能干细胞某些令人心仪的特点。它们都可以在体外生长而不发生分化；都具有正常的染色体组型；也都保留了向一系列不同细胞类型分化的能力。通过克隆技术得到的各种人胚胎干细胞系都能在长期培养过程中保留多功能性和繁殖能力(Amit等人Dev.Biol.第227期，271页，2000年)。
总之，干细胞可以对人体绝大多数组织的再生过程，对各种遗传异常损伤及疾病等情况，发挥储库的作用。因此，极有希望用于治疗人类疾病。
发明概述本公开资料提供了一套方案，可以利用单一的干细胞系作为可广泛应用于不同病人的不同组织类型再生的通用的供体组织来源。对病人使用干细胞分化出的免疫耐受性细胞，可以解决干细胞供体和受体病人间存在的HLA不匹配问题。从而，使病人可以利用同一来源的分化细胞进行组织再生。
本
发明内容
之一，是阐明一种制备具有治疗价值的细胞的方法。该方法包括从人的多功能干细分化出的初级和次级细胞群。当将初级细胞群输入某一个体后，该个体就获得了对次级细胞群的免疫耐受性。
初级细胞群应该和次级细胞群具有MHC组织相容性，也就是说，它们在染色体HLA-A和HLA-B位点起码具有一个相同的单倍型。在理想状态下，两类细胞群应该是同源的，即它们可以从同一hPS细胞系分化而来。
初级细胞群中耐受性细胞的某些特殊类型可以具备下文所提到的特定的表型和功能特性。次级细胞群包括受处置病人组织再生所需要的任何细胞类型。
本
发明内容
之二，是阐明制备初级细胞群的方法。如前所述，该初级细胞群可使受治个体将因此而获得对次级细胞群具有免疫耐受性。
本
发明内容
之三，是阐明把上述初级和次级细胞群施用于个体，在其体内重建细胞功能的一种方法。
最后，本发明还阐明了利用上述的初级和次级细胞群，制备成套或单用的药物制剂。药剂的复方组成是(如前所述)一种从人多功能干细胞分化出的可以使接受个体对次级细胞群产生免疫耐受性的表型的初级细胞群，以及一种具有MHC组织相容性的次级细胞群。
另外，本发明的其他一些实例可从下文所述来发解。
发明的具体描述干细胞技术的发展方向是建立供组织再生用的不同的干细胞及其分化细胞系的储库。本发明认为，移植物细胞和接受病人之间的组织相容性是需要解决的一个关键问题。一般认为，干细胞和其分化细胞都可表达MHC抗原。而如果没有免疫抑制剂的作用，这类细胞的同种异体移植物将引起受体的特急性、急性和慢性的组织排斥反应。
本发明通过对受体病人诱导细胞特异性免疫耐受性，解决了干细胞制备同种异体移植物的组织相容性问题。即对受体病人预先输入免疫耐受性细胞，从而诱发对同种异体移植物所使用的组织类型的特异性免疫学无反应性。
一般认为，免疫耐受性的诱导过程包括宿主免疫系统对外来物质的适应过程。这一过程的实现，包括免疫耐受性细胞群中II型MHC提呈细胞或其他成分的相互作用，进而引起宿主的同种特异性淋巴细胞消灭或无反应性。同时宿主也可能从免疫耐受性诱导细胞群获得新的免疫成分(如，同种特异抑制细胞或反抑细胞)，在宿主体内形成可感的细胞嵌合体。本文列举上述机理是为了帮助读者更好地了解本发明。对于本发明的实际应用，则不一定都要理解或证实上述机理。
干细胞的独特性质是，可从同一细胞系同时分化出免疫耐受性诱导细胞群和其他各种分化定型细胞(如，神经前体细胞和肝前体细胞)。就是将此特性用于组织再生。由于干细胞具有强大的复制能力，因而可以根据治疗需要繁殖和分化出足量的细胞。当免疫耐受性诱导细胞输入病人体内后，不但可产生对I型和II型同种抗原的免疫无反应性，还会对各种次要组织相容性抗原和移植物中可能出现的同种异型差别产生免疫无反应性。
本公开资料所描述的策略，大大拓宽了干细胞在组织再生医疗领域中的应用潜力。临床医生对于干细胞和受冶病人细胞之间的组织相容性不匹配状况，过去一直面临着一些困难的选择，比如，设置配备有可适配于每个移植病人的各种异型细胞的大型的多功能干细胞库，或者，采用大剂量的免疫抑制疗法，直到移植物被病人接受。
根据本发明的方法，只要利用单系的干细胞，就可以使不同病人产生免疫耐受性，这样病人免疫系统就可以接受的方式进行组织再生。
定义原型“灵长类多功能干细胞”(pPS细胞)是从受孕后各个时期的胚前期、胚胎期或胎儿期等组织中分离的多功能干细胞。根据标准的在技术上可接受的试验，例如，可以在8-12周SCID小鼠体内形成畸胎瘤表明，它具有可以在适当条件下形成能够衍生出三个胚层(内胚层，中胚层和外胚层)不同细胞类型的后代的特性。
pPS细胞的定义中包括了不同类型的胚胎细胞，比如，Thomson等(Science，第282期，1145页，1998年)描述的人胚胎干细胞(hES细胞)，从其他灵长类动物分离的胚胎干细胞，如猕猴干细胞(Thomson等Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第92期7844页，1995年)，狨干细胞(Thomson等，Biol.Reprod.第55期，254页，1996年)以及人胚胎生殖细胞(hEG细胞)，(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第95期，13726页，1998年)。pPS细胞还包括了其他一些类型的多功能细胞。其中包括可以分化出可构成三个胚层的细胞后代的任何灵长类动物的细胞，不管其是来自胚胎组织，胎儿组织还是其他来源。还包括早期的原始类外胚层细胞(EPL细胞)的人源细胞相应，(Bresagen公司，WO 99/53021和WO 01/51611)。也包括胚胎癌细胞(EC细胞)，(Pera等，Int J Cancer，第40期，334页，1987)。但一般最好是使用具有正常染色体组型的细胞，而不用来自恶变组织的细胞。
当pPS细胞培养物中具有相当比例的表现出未分化细胞形态学特征的干细胞及其衍生细胞时，就称为“未分化的”。这些细胞很容易和胚胎或成体的分化细胞区分开来。用二维显微镜观察，这些未分化的pPS细胞表现出很高的核/质比及明显的核仁，很容易被本领域人经验的人员识别出来。其细胞群中的未分化细胞集落经常被四周的分化细胞所包围。这种细胞群在适宜条件下培养或者传代后，其中未分化细胞集落仍然保持不变，独特的未分化细胞可以在全部细胞群中占据相当大的比例(＞20％甚至＞60％)。
“饲养细胞”或“饲养层”是指与另一种细胞共同培养。时可为其提供适当的生长条件的一种细胞。根据所要支持的细胞，可以选择不同物种来源的饲养细胞。比如，本公开资料下文将提到，对于某些类型的pPS细胞，可以选择小鼠的原始胚胎成纤维细胞永生化的小鼠胚胎成纤维细胞，或者从hES细胞分化的人体类成纤维细胞作为支持细胞各种。pPS细胞群当接种在没有添加可支持pPS长年的新鲜饲养细胞的培养基中至少经分裂后一代后，就可以称之为“实质上不含有”饲养细胞。实质上不含有饲养细胞的培养物中含有的饲养细胞不超过5％。除非特别声明，本公开资料所指的“无饲养细胞力的培养物或细胞群指的就是上述定义上的实质上不含有饲养细胞的状态。
“胚胎体”等同于“聚合体”，指的是pPS细胞以单层或悬浮形式培养时过度生长而出现的分化的及未分化的细胞形成的集合体。胚胎体就是可从形态学标准判断的来自不同胚芽层的具有特色的不同类型细胞的混合体。
“定向性前体细胞”，“世系限制性前体细胞”和“限制性发育世系细胞”都是指具有繁殖和分化为不同细胞类型能力的细胞。但和来源于胚胎并能分化出所有三个胚层的多功能干细胞相比，它的繁殖和分化能力都有限得多。定向前体细胞的非限制性实例包括下文将提到的造血世系细胞；具有能分化成胆管上皮细胞和肝细胞多功能的祖代肝细胞以及间充质干细胞。另外一个实例是神经限制性细胞，它可以分化成神经胶质细胞前体，进而形成少突神经胶质细胞和星型胶质细胞，也可以分化成神经元前体细胞进而形成神经元。
本文中，“干细胞”既包括了多功能干细胞，也包括定向前体细胞，其定义如上述。干细胞最起码可以繁殖并分化成一种以上的细胞表型。不论在同一培养物的一部分或不同培养条件下，它都可以自我修复。而且干细胞在端粒酶鉴定中呈阳性反应。
本公开资料所指的“造血细胞”和“造血世系细胞”可以互换使用。它包括红细胞、淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、嗜酸性细胞、嗜碱性细胞和多形核白细胞。这类细胞还包括不进入血液循环的与之类细胞功能相当的细胞，包括骨髓里的有核红细胞，淋巴结和脾脏中的淋巴细胞，皮肤或肝脏中的巨噬细胞。它还包括可定向分化为具有该世系特征后代的前体细胞。该术语用在本文中具有解释意义。
特定的免疫“耐受性”是指个体对某种外来物质具有很弱的免疫应答，但对类似的其他物质则呈现正常的免疫应答。本发明的主要目的是针对用于组织再生的同种异体移植物具有免疫耐受性。根据本发明，如果病人产生了特异的免疫耐受性，对于同种异体移植物就只有弱得多的免疫应答；否则，就会是另一种结果。下文将提到，免疫耐受性效果可以通过测量特定抗体、CTL，或T辅助细胞、T诱导细胞对特定组织的免疫活性来确定，并可将其和治疗前的反应相对照，也可以和种内不同个体间的同类组织(所产生的免疫结果)相比较。
除非特别声明，本发明的权利要求所提到的耐受性诱导细胞不限于某种特定的表型。只要如上所述某种细胞(在输入某一个体后)，能诱导(该个体)产生特异性免疫耐受性，它就可以成为“免疫耐受性诱导细胞”。从多功能干细胞可以分化出具有适用于本发明的使受体产生免疫耐受性的的许多细胞群，其中一些表现出间充质细胞或造血世系细胞的形态特征或标记分子。
除非特别声明，本发明的权利要求提到的免疫耐受性也不限于特定的诱导机理。可以列举的机理包括(但不限于)某些特异性B细胞或T细胞的损耗，B细胞或T细胞的无应答，或者抑制性T细胞或反抑细胞的主动抑制作用。(除此之外，可能还有其他机理)本文所关注就是其免疫耐受性的产生这一事实。这种耐受性实验结果由本公开资料描述。
常用技术关于本发明所采纳的常用技术的具体内容，可以参考细胞生物学、组织培养学和胚胎学等有关教材和综述。包括《畸胎瘤和胚胎干细胞操作方法》(E.J.Robertson编著，IRL出版公司，1987年)；《小鼠培育技术指南》(P.M.Wasserman等编著，学术出版社，1993年)；《胚胎干细胞在活体外的分化》(M.V.Wiles，Meth.Enzymol，225期，900页，1993年，《胚胎干细胞的特性和应用其在人类生物学和基因治疗方面的的前景》(Rathjen理学博士等，Reprod.Fertil.Dev.10期，31页，1998年)。另外，还有Robertson(Meth.Cell Biol，75期，173页1997年)和Pedersen(Rprod.Fertil.Dev.10期31页1998年)的有关干细胞分化的综述文章。
有关各类造血细胞系和免疫耐受性的一些论题，可以参阅下列文献《造血细胞世系的生理和病理》(N.G.Testa等编著，Marcel Dekker出版，1999年)，《免疫耐受性》(J.Banchereau等，Editions Scientifiques et Medicales Elsevier出版，1996年)和《免疫学耐受性》(G.Bock等编著，John Wiley&Son有限公司出版，1998年)。
多功能干细胞的来源本发明可采用任何一种脊椎动物的干细胞。包括人干细胞，非人灵长类动物干细胞，宠物、家畜动物干细胞以及其他非人哺乳动物等的干细胞。比较合适的是灵长类动物受孕后妊娠期间从相关组织分离的多功能干细胞(pPS细胞)。包括从胚泡或胎儿组织及胚胎组织分离的pPS细胞。其他非限制性实例还包括原代细胞培养物，或已建立的胚胎干细胞系或胚胎生殖细胞系。
胚胎干细胞胚胎干细胞可以从灵长灵动物的胚泡中分离(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第92期7844页1995年)。人胚胎干细胞(hES)可以按照Thomoson等(美国专利5,843,780，Science，第282期1145页，1998年；Curr.Top.Dev.Biol，第38期133页等，1998年)和Reubinoff等(Nature Biotech，第18期339页2000年)的报道从人胚泡细胞中制备。
简而言之，人胚泡可以从预先植入人体内的胚胎中或体外受精的胚胎(IVF)中获得。另外，人单细胞胚胎也可以发育成胚泡(Bongso等，Hum Reprod第4期，706页，1989年)。胚胎细胞可以在G1.2和G2.2的培养基中发育到胚泡期(Gardner等，Fertil.Steril.第69期，84页，1998年)。发育的胚泡经链霉蛋白酶(Sigma公司)短时间处理，透明带被去除。胚泡经免疫手术分离出细胞内物质。具体过程为胚泡首先经1比50的兔抗人脾细胞抗血清处理30分钟，然后用DMEM培涤三次，每次5分钟，最后在1比5稀释的豚鼠补体(Gibco)处理3分钟(Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，725099，1975)。再经过DMEM两次洗涤，溶解的滋养外胚层细胞小心地用吸管分离出来。留下的完整的细胞内团(ICM)接种到mEF饲养层。
经9-15天的生长后，从内细胞团培养产物可以通过几种方法分离成细胞团。例如，用不含钙和镁的但含有1毫摩尔EDT的A磷酸盐缓冲液(PBS)处理，用胰蛋白酶或dispase酶处理或者利用微量移液管进行机械分散处理。分离后的细胞团被重新转移到具有新鲜mEF饲养层的培养基中，长出的细胞群落如果表现出未分化细胞的形态学特征，须用微量移液管分别挑选出来。再经机械作用分散成细胞团，并转移至新的培养基中生长。ES样形态学之特征通常表现为致密的群落，而且形态学上显示出高的核/质比及明显的核仁。得到的ES细胞每1-2周用胰蛋白酶进行短时间处理使之常规分裂，用Dulbecc磷酸盐缓冲液(含2毫摩尔的EDTA)处理，用IV型胶原酶处理(约200单位每毫升，Gibco)处理或用移液管的选取个别细胞集落。细胞团的大小最好控制在50-100个细胞。
胚胎生殖细胞人胚胎生殖细胞可以由原始生殖细胞制备。这些原始生殖细胞存在于最后一次月经后约8-11周取得的人胎儿组织中。适用的制备方法可以参考Shamblott等人(Proc.Natl.Acad，Sci.USA，第95期13726页，1998年及美国专利6,090,622)的报道。
简而言之，先用等渗溶液洗涤生殖嵴，再浸泡在0.1毫升0.05％的胰蛋白酶和0.53毫摩尔的EDTA钠溶液(BRL)中，并把生殖嵴切成1立方毫米以下的小块。组织块用100微升的移液管头抽吸，使细胞进一步分离。细胞在37℃保温约5分钟后，加入约3.5毫升的EG生长培养基。EG生长培养基的配方是DMEM，4500毫克/升的葡萄糖，2200毫克/升的碳酸氢钠溶液，15％的ES级胎牛血清(BRL)，2毫摩尔的谷氨酰胺(BRL)，1毫摩尔的丙酮酸钠(BRL)，1000-2000单位/毫升的人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme公司)，1-2纳克/毫升的人重组碱性成纤维生长因子(Genzyme公司)和10微摩尔Forskolin(溶解在10％的DMSO中)。另外一种分离EG细胞的方法是用透明质酸酶、胶原酶、脱氧核糖核酸酶处理。首先把胎儿组织上的生殖腺原基或生殖嵴连同隔膜一同切割下来，生殖嵴先用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，然后转移到0.1毫升HCD消化液中(含0.01％V型透明质酸酶，0.002％I型脱氧核糖核酸酶，0.1％IV型胶原酶，源自Sigma公司，制备成EG细胞生长培养基)。将组织切碎后在37℃保温1小时或过夜，之后重新悬浮在1-3毫升EG细胞生长培养基中，并转移到备有饲养层细胞的平板中培养。
平板的制备如下将饲养层细胞(如，STO细胞，ATCC编号CRL1503)接种到96孔培养板中，在改变过配方的EG细胞生长培养基(不含LIF，bFGF或forkolin)中培养3天，细胞贴壁但未汇合时，用5000rad剂量的伽马射线灭活。各孔加入约0.2毫升原代生殖细胞(PGC)悬浮液。EG细胞培养基中培养7-10天后进行第一次传代，依次把每孔中的培养物转移到另外一24孔的培养板孔中。新的培养板预先有经射线灭活的STO小鼠成纤维细胞饲养层细胞处理。EG细胞培养时，需要每天更换培养基，直到所培养出的细胞呈现出EG细胞的特性。整个培养过程一般需要7-30天，或传代1-4个饲养周期。
pPS细胞在未分化状态下的增殖pPS细胞可以在培养过程中不断增殖。通过控制培养条件，我们可以促进细胞增殖，同时保持细胞的未分化状态。标准的含血清的ES细胞培养基，含有80％DMEM(比如，Knock-out DMEM，Gibco公司)，20％确定成份的胎牛血清(FBS，Hyclone公司)或血清替代物(WO 98/30679)，1％的非必需氨基酸，1毫摩尔的L-谷氨酰胺和0.1毫摩尔的2-巯基乙醇。将使用前，加入4纳克/毫升的bFGF(WO 99/20741，Geron公司)。
通常，ES细胞需要培养在饲养层细胞之上。常用的饲养层细胞是从胚胎或胎儿组织制备的成纤维细胞。具体做法是，从怀孕13天的CF1小鼠体内取得胚胎，转移到2毫升胰蛋白酶/EDTA溶液中。胚胎切碎后，在37摄氏度保温5分钟。加入10％FBS，待细胞碎片沉降后，完整细胞培养在含有90％DMEM，10％FBS和2毫摩尔谷氨酰胺的培养基中增殖。制备饲养层细胞，经剂量约为4000rad的伽马射线照射后，饲养细胞不再具有繁殖能力，但仍可以合成支持ES细胞所需要的生物因子。培养板先用0.5％的明胶覆盖过夜，然后每一板孔中加入375,000个射线处理过mEFs细胞。接种之后在5小时至4天内使用这些培养板。对培养基更换新鲜的h＼ES培养基后，即刻接种pPS细胞。
Geron公司的科研人员已经发现，pPS细胞即使在没有饲养细胞的状态下，也能保持未分化状态。无饲养细胞的培养条件需要有合适的培养成分，特别是例如，Matrigel或Laminin等细胞外基质。pPS细胞以＞15,000个/平方厘米的密度接种(最好在90,000至170,000个/平方厘米)。通常，在中止蛋白酶的消化处理(如，用IV型胶原酶处理约5分钟)后细胞就可完全分散。细胞数约为10-2000个的细胞团则不必再分散而可直接接种到培养基中。
无饲养细胞的培养物，需要依靠一种营养培养基支持。通常营养培养基需要事先培养经射线处理过的饲养细胞进行调节。饲养细胞包括小鼠的原始胚胎成纤维细胞、端粒化的小鼠成纤维细胞或由pPS细胞衍生的类成纤维细胞。将这些饲养细胞以50000-60000/平方厘米的密度接种到不含血清的培养基中(比如，KO DMEM培养基，其中增补20％的血清替代物和4纳克毫升的bFGF对培养基进行调节)。上述培养基经调节1-2天后，需要补充bFGF，通常可以用于支持pPS细胞培养物1-2天。
在显微镜下，ES细胞显示出高核/质比，有明显的核仁，而且细胞集落紧密并有不易发现的细胞连接。灵长类动物ES细胞表达出阶段特异性抗原(SSEA)3和4，以及利用标明Tra-1-60和Tra-1-81的特异抗体可检知的标记分子(Thomson等，Science，第282期1145页，1998年)。小鼠ES细胞可以用作SSEA-1抗原的阳性对照，以及SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81的阴性对照。SSEA-4抗原还始终存在于人胚胎癌细胞中(hEC细胞)。pPS细胞在活体外分化后，其SSEA，Tra-1-60和Tra-1-81都不再表达。而SSEA-1的抗原表达则加强。另外，在hEG细胞中也可发现SSEA-1抗原。
分化bPS细胞用于组织再生通过启动胚胎样体形成，我们可以促使pPS细胞开始分化。胚样体的培养方法一般原理在O’Shea Anat Rec的文章(New.Anat.第257期，323页，1999年)中已经有所报道。PPS细胞的培养方式是，比如培养使pPS细胞培养物过度生长，使细胞在培养基中形成聚合体。另外一种办法是，用胶原酶短时间消化处理pPS细胞后，使其分散为一些小的细胞群落，然后把它接种到无可粘附表面的细胞培养板上，每隔几天补充养分，经适当时间后(通常4-8天)收获细胞。之后，与若干要素一起培养细胞，或是在可促进特定世系的细胞增殖特殊基质中培养。胚样体由不同类型的细胞群构成，具有形成内胚层的外侧面，以及中胚层和外胚层的内侧面的潜力。
Geron公司的科研人员还发现pPS细胞也可以不经过形成胚样体或聚合体的中间过程，直接分化成定向前体细胞和完全分化细胞。简单说，首先制备未分化pPS细胞的悬浮液，然后接种到可以促进分化的固体表面。比如，通过用聚赖氨酸之类的阳离子聚合物处理的有粘附性的玻璃和塑料的表面，可以得到合适细胞附着的固体介质。然后，细胞可以培养在合适的营养培养基中，促进其向所需要的细胞世系定向分化。
在有些情况下，我们可以通过去除培养基中的血清或血清替代物，或去除培养基中抑制分化的成分(比如，bFGF)来进一步促进分化。还可以通过加入某些成分来促进细胞向所需世系进行定向分化，或者抑制细胞向非所需的特性方向分化。比如，为促进细胞向神经细胞或胶质神经细胞定向分化，培养基中可以加入下列有效组合的成分脑衍生神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3(NT-3)、NT-4、表皮生长因子(EGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、神经生长因子(NGF)、视黄酸(RA)、刺猬蛋白(sonic hedgehog)、FGF-8、维生素C、forskolin、胎牛血清(FBS)和骨形成蛋白类(BMPs)。
Pedersen的文章(Reprod.Fertil.Dev.第6期，543页，1994)和美国专利6,090,622分别综述了从多功能干细胞制备各种组织细胞的基本原理。其他相关的文献包括关于原始神经细胞，限制性神经细胞和神经胶质前体细胞(Bain等，Biochem，Biophys.Res.Commun.第200期，1252页1994年；Trojanowski等，Exp.Neurol，第144期，92页，1997年；Wojcik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第90期1305-130以及美国专利5,851,832；5,928,947；5,766,948和5,849,553)；关于心脏细胞和心肌细胞(Chen等，Dev.Dyanmics，第197期，217页，1993年和Wobus等Differetiation，第48期，173页，1991年)；关于分泌控制葡萄糖反应性胰岛素的胰腺Beta细胞系列(美国专利5,773,255)；关于肝细胞前体细胞(美国专利5,789,246)。其他相关的祖代细胞还包括(但不限于)软骨细胞、成骨细胞、视色素上皮细胞、成纤维细胞、角化细胞之类的皮肤细胞、树突细胞、毛囊细胞、肾导管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌细胞以及血管内皮细胞。
Geron公司的科研人员发现培养的pPS细胞或胚样体细胞在有结合生长因子受体的配基存在时，将促进大量形成神经前体细胞。细胞生长的环境中，可以含有某种支持神经细胞生长的细胞外基质，比如，粘连蛋白。适宜的生长因子包括EGF、bFGF、PDGF、IGF-1以及这些配基的受体的(特异性)抗体。培养基中的细胞可能会根据它们是否表达A2B5之类的标记蛋白而有选择性地分离开来。其中，在合适的环境下，丰富达A2B5标记蛋白的细胞群可具备产生神经元细胞(包括成熟的神经元)和神经胶质细胞(包括星型胶质细胞和少突神经胶质细胞)。比如，在含有cAMP激活剂的培养基中培养时，各细胞群落还可能随意地进一步分化。可以参考Geron公司的国际专利刊物(WO 01/81549)。
Geron公司的科研人员还发现培养中的pPS细胞和胚样体细胞还有肝细胞分化促进剂存在时，将促进向肝细胞样细胞大量形成。细胞成长的环境中，可以含有某种支持肝细胞生长的细胞外质，比如，胶原或Matrigel。适合分化因子包括，丁酸酯的异构体和类似物，其代表为正丁酸酯。培养的细胞可随意地同时或依次与一种肝细胞成熟因子如二甲亚砜(DMSO)之类的有机溶剂一起培养。长表现出一定的选择性。这些因子包括成熟辅助因子比如视黄酸、细胞激活剂或激素比如糖皮质激素、表皮生长因子(EGF)、胰岛素、TGF-α、TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝素、肝细胞生长因子(HGF)、IL-1、IL-6、IGF-1、IGF-II和HBGF-1等。可参考Geron公司的国际专利申请(PCT/US01/15861)。
Geron公司的科研人员还发现hPS细胞可以大量分化成包含心肌细胞或心肌前体细胞的丰富细胞群。心肌细胞世系可以由例如hES细胞在可以影响DNA甲基化的心肌营养因子的生长环境下分化而形成。其实例就是5-氮胞嘧啶。从而，具有自发性收缩能力的细胞，就可通过比如，密度离心法处理而和其他细胞分离开。进一步的处理可包括把细胞培养在含有肌酸、肉碱或牛磺酸的环境中。或者，hPS细胞还可以大量分化成包含骨祖代细胞或成骨细胞的丰富细胞群。两种类型的细胞都可以表达出骨钙素和I型胶原。这些细胞也可以由pPS细胞在含有某种人维生素D受体的配基或者人TGF-β受体的配基的一种骨形成蛋白(尤其是BMP-4)的培养基中分化而来。
分化的细胞可以通过许多特征加以识别。包括通过外形特征，通过对细胞表达的标记蛋白和酶活性的定性或定量，以及通过细胞在体内表现的功能特性。区分神经细胞的标记蛋白包括，神经元特有的III型β-微管蛋白或神经细丝蛋白；星型胶质细胞的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)；少突胶质神经细胞特有的半乳糖脑苷脂(Galc)或髓鞘碱性蛋白(MBP)；未分化的hES细胞持有的OCT-4蛋白；神经前体细胞和其他细胞特有的巢蛋白。另外可以用谷氨酸脱羧酶和GABA鉴定分泌GABA的神经元，用多巴脱羧酶，多巴胺或酪氨酸羟化酶鉴定多巴胺能神经元。
肝细胞的识别标记包括针对肝祖代细胞的α-甲胎蛋白；针对肝细胞的白蛋白、α1-抗胰蛋白酶、葡萄糖-6-磷酸酶、细胞色素p450的活性、转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白受体和糖元存储状况；针对胆上皮细胞的CK7、CK19和γ-谷氨酰转移酶。在混合群落的细胞可以用下列标记识别针对骨骼肌的myoD、肌浆蛋白和myf-5、针对内皮细胞的血小板内皮细胞粘附分子(PECAM)、Flk-1、tie-1、tie-2、血管内皮(VE)粘附分子、MECA-32和MEC-14.7；针对平滑肌细胞的平滑肌肌动蛋白和特异的肌凝蛋白重链；针对心肌细胞的GATA-4、Nkx2.5，心肌肌钙蛋白I、α肌凝蛋白重链、心脏肌钙蛋白T(cTnT)以及心房利钠因子(ANF)；针对胰细胞的pdx和胰岛素分泌。
bPS细胞向免疫耐受性诱导细胞的分化人ES细胞可以通过形成上文所提的胚样体形成而分化成具有免疫耐受性诱导细胞。也可以合适的培养基的在合适的培养环境中，(不经过胚样体)直接分化成免疫耐受性诱导细胞。
按照通常的做法，细胞以集合体或单层细胞的形式培养，生长在悬浮培养液或诸如甲基纤维素和琼脂糖的半固体培养基中。分化开始后1-2周，一般加入各种生长因子。促进造血细胞各群体生长的因子包括IL-3、血管内皮生长因子(VEGF)、血小板生成素(Kit配基)、IL-1、IL-6、IL-11、M-CSF或者GM-CSF。辅助因子可能包括干细胞因子、IL-2、IL-7、类胰岛素生长因子1、红细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长辅助因子、G-CSF、Flt-3配基、抗-M-CSF和抗-TGF-β因子。后备的辅助激发因子包括氢化可的松、地赛米松、Con-A、PHA和LPS。
在一些情况下，培养环境可能包括饲养细胞，尤其是小鼠或人的骨髓基质细胞(比如S17、RP.0.10、ST2、PA6、Ac6或新鲜的原代细胞培养物)。其他可用作饲养细胞的包括胚胎肝基质细胞(如，FLS4.1)、卵黄囊细胞(如，C166)、胸腺基质细胞、活化的脾细胞或内皮细胞。或者，也可以把细胞培养在某种细胞外基质中生长，比如Matrigel、laminin、粘连蛋白或胶原蛋白、或由饲养细胞产生的各种基质中。如果不用饲养细胞，可由饲养细胞所提供的某些功能可以由经调节的培养基来补充(比如基质细胞的上清液)。为促进造血功能，细胞可以培养在正常氧浓度(19％O2)或低氧浓度下(5％O2)，比如，在氧气浓度压可以调节的培养箱内。培养条件的选择需在一定程度上要考虑细胞亚群的生长机制和培养目的。
经过足够长时间的培养，细胞将产生鹅卵石样的群落。这时细胞可以传代并用流式细胞技术，免疫组织化学技术或酶联免疫技术来检测细胞表型标记。相关蛋白的表达也可以利用针对标记蛋白特异性引物，使用反转录-PCR技术检测mRNA的含量。(Moore，Clin.Cancer Res.13，1995)。
相关的标记物如下针对人造血前体细胞和干细胞的CD34+、CD38-、Thy+、HLA-DR-、CD45RO+、CD71 lo、Rhodamine 123 lo、GATA-1、AC133、β-主球蛋白、β-主球蛋白类似基因βH1；针对于间充质干细胞的CTLA-4、SH2+、SH3+、CD29+、CD44+、CD71+、CD90+、CD106+、CD14-、CD34-、CD45-；针对淋巴细胞的CD45+；针对T细胞的CD2+、CD3+、CD4+、CD8+、T细胞受体、IL-2受体；针对B细胞的II型HLA、CD19+、免疫球蛋白的基因重排；针对树突细胞的DEC-205+、CMRF-44+、CMRF-56+、S100+；针对自然杀伤细胞的CD16+、CD2+、CD3-；针对巨噬细胞/单核细胞的II型HLA、CD14+、CD15+；针对巨核细胞的CD41b+；针对红细胞的血型糖蛋白A+、血红蛋白。
测量造血祖代细胞时，先把细胞涂布在含有各种生物因子(如IL-1、IL-3、KL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF和EPO)的甲基纤维素基质上。细胞长成集落后，测量集落的数量和种类(如HPP-CFC、CFU-GM、BFU-E)。也可以把细胞涂布在异源骨髓基质细胞，由形成的细胞集落的数量、大小和其中细胞的表型来评定细胞的长期增殖潜能。
造血细胞的分化潜能可以通过它们在模型动物脾脏所形成的集落(CFU-S)的能力进行评定。首先将分化细胞通过静脉注射到动物体内，约两周后，对动物脾脏上形成的细胞集落计数。分化潜能还可根据经过亚致死剂量射线照射过的小鼠造血系统的重复，或者经致死剂量照射的小鼠的援救情况进行评定。首先分化细胞通过静脉注射移植到小鼠体内，随后用人的特异抗体，以应用流式细胞术(FACS)来测量小鼠血液中体人骨髓细胞或淋巴细胞的百分率。适用的标记物包括CD3(T细胞)，CD19(B细胞)和CD14/15(骨髓细胞)。有时为保证实验动物的成活，需要把全骨髓和分化细胞一起移植，然后根据该两种供体细胞群的MHC型来加以区分。
或者，可利用上述标记物的特异性抗体，将培养基中的免疫耐受性诱导细胞与其他世系的分化细胞分开或与特别的细胞小集团分开。比如，针对CD34+、CD38-、CD34+和Thy+的表型，细胞可以被荧光激活细胞分选法或免疫磁珠分选法富集。该筛选方法经过改变还可以利用启动子/示踪子结构来标记供选的目标细胞型。比如，CD34的启动子或增强子(Burn等，Blood，第80期，3051页，1992年，Radomska等，Gene，第222期，305页，1998年，基因库目录编号AF047373)可以引发编码区的某一抗药基因或荧光标记(如，绿色荧光蛋白)的表达(美国专利6,166,178，Geron公司)。让混合的细胞群的启动子/示踪子瞬间表达(如，利用通过腺病毒载体)，就可在含有相应(抗药基因的)抗生素的条件下培养，或者通过荧光激活细胞分选法，分别选出CD34+细胞。
依照本发明培养制备适用于诱导免疫耐受性的细胞群时，操作人员还可以任选其他一些辅助方法，(另行论述)。
比如，WO 93/18137(SyStemix公司)在培养造血干细胞时，推荐在至少含有10纳克/毫升的白血病抑制因子(LIF)的培养基中培养12小时。美国专利5,635,387(CellPro公司)列述了使用含有各种生长因子的营养培养基，培养人造血细胞及其前体细胞(尤其是CD34阳性细胞)的若干方法和设备。美国专利5,733,541描述了对CD34+ve，HLA-DR+ve，Thy-1+ve及Lin-ve等造血前体细胞繁殖及保持方法。美国专利6,015,554(SyStemix公司)中也述及了获取富含CD34+ve，CD45RA+ve及CD10+ve祖代细胞的造血前体细胞的各种方法。
Keller等(Curr.Opin.Cell Biol，第7期862页1995；Mol.Cell Biol，第13期，473页，1993；Development，第125期，725页，1998)描述了两步分化法。首先从小鼠ES细胞分化形成为胚样体，细胞打散后，被接种到含有不同生长因子组合物的半固体培养基(1％甲基纤维素)或液体培养基。
Kaufman等(干细胞基本原理研讨会，2000年，摘要第315篇)以小鼠骨髓基质细胞系S17或小鼠卵黄囊细胞系C166作为饲养细胞，在不加外来生长因子的情况下，人ES细胞可以进行分化。培养约7天时，出现鹅卵石状群落，14-21天时，部分细胞呈现CD34阳性反应，但对CD45呈阴性反应。
Nakano等(Science，1994)把小鼠ES细胞和M-CSF缺陷的基质细胞系OP9共同培养。Potocnik等(EMBO.J，第13期，5274页，1994年)在不加外源生物因子的情况下，把小鼠ES细胞压大气低氧含量(5％O2)培养在的液体或半固体甲基纤维素(培养基)中，并使其分化成胚样体。Palacios等(ProcNatl.Acad.Sci.USA，第89期，9171页，1992年；Proc.Natl.Acad.Sci.USA第92期7530页，1995年)把小鼠的ES细胞培养在含有IL-3，IL-6，IL-7等生长因子的胎牛血清中的去活基质细胞，或胎儿肝脏基质细胞的调节性培养基中。
Fairchild等(Curr Biol.第10期，1515页，2000年)报道了用小鼠胚胎干细胞建立可长期保存的未成熟的树突细胞培养物的方法。树突细胞(DC)和巨噬细胞有不少相同的特性。但在生长成熟时，树突细胞可获得响应外来物质刺激的能力，以及包括CDl1c，II型MHC及共刺激因子的表达的典型树突细胞的表面表型。Fairchild等的文章(Curr.Opin.Immunol.第12期，528页，2000年)总结了树突细胞在诱导移植耐受性的应用前景。据认为，树突细胞依次培养在含有GM-CSF和IL-4的培养基和含有低浓度的GM-CSF和IL-10的培养基中在有些情况下，可以分化出诱导免疫耐受性的细胞。
某些情况下，免疫耐受性诱导细胞可以建立细胞库，满足病人耐受从同一细胞系形成的再生组织的需要。为提高细胞的复制能力和便于储备，可以通过适宜的载体转染或转导，同源重组或者其他相应的方法，使这些细胞表达端粒酶催化组件(TERT)，从而成为端粒化细胞。国际专利刊物WO 98/14592所提出的人端粒酶(hTERT)是目前最合适的催化组件。另外，人细胞的转染并表达端粒酶的技术在Bodnar等(Science第279期，349页，1998)和Jiang等(Nat.Genet，第21期，111页，1999)的文章中都有报道。
细胞在端粒化处理之前后，端粒酶活性和hTERT基因产物的表达，都可以利用商品化的试剂和现成的各种方法来测定。比如，pPS细胞的端粒酶活性可以从TRAP的活性试验评定(Kim等，Science，第266期，2011页，1997；Weinrich等，Nature Genetics，第17期，498页1997)。有商品供应可用于研究的诊断试剂盒包括TRAPezeXL端粒酶诊断试剂盒(商品代码s7707，Intergen公司，购自纽约)和TeloTAGGG Telomerase PCR ELISAplus(商品代码2,013,89，罗氏药品公司，印第安纳波利斯)。hTERT的表达也可以通过反转录-PCR技术检测对mRNA进行评定。用于研究的商品化的诊断试剂盒有LightCycler Telo TAGGG hTERT定量诊断试剂盒(商品代码3,012,344，罗氏药品公司)。
根据治疗需要，本发明所提到的免疫耐受性诱导细胞群中应该基本上没有未分化的pPS细胞。从细胞群中去除未分化干细胞的方法之一是用合适的载体转染细胞。载体自身的效应子基因受启动子控制。而该启动子可以使该效应基因优先在未分化细胞中表达。可以采用的启动子包括，TERT启动子和OCT-4启动子。效应基因有可能直接溶入细胞的基因组中进行编码，，比如，编码一种毒素或一种细胞凋亡的介体。其中典型的各种凋亡基因都是caspase家族的基因(Shinoura等，CancerGene Ther.第7期，739页，2000年；Koga等，Hum.Gene Ther.11期1397页，2000年)。另外，还可以使效应基因连接一分子开关(比如，四环素抗性元件，Gossen等，Curr.Opin.Biotechnol.第5期，516页1994；美国专利5,464,758；Clackson，Curr.Opin.Chem.Biol.第1期210页，1997)。这样只有在诱导药物(比如，四环素)存在时，可将不需要的细胞杀死。最后，效应基因还有可能导致细胞对外来物质(比如，抗体和前驱药物)的毒性作用具有敏感性。单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶(tk)基因就是此类效应基因一个范例。表达该基因的细胞对更昔洛韦敏感。Morin等在WO 98/14593中也描述了若干适用的pTERT-tk的基因结构。
两种相匹配细胞群应用于组织再生为了对某一个体重建细胞的功能，首先把从人多功能干细胞(hPS)分化成某一表型的第一细胞群输入病人体内，该表型可使病人对免疫耐受性细胞的HLA组织型产生免疫耐受性。可以同时施用或移植(和免疫耐受性诱导细胞相匹配)的组织再生同种异体移植物，但通常在几周后施用。
本发明为评估这套免疫耐受性诱导方案的适用期限提供了各种动物模型。第一种是利用小鼠ES细胞的小鼠模型。小鼠ES细胞可以按照已建立的条件标准方法(同上)从近交系BALB/c，C3H或C57BL品系小鼠中制备。这些细胞按上个章节所描述的方法分化成免疫耐受性诱导细胞，之后通过肝门静脉或尾静脉注射到具有不同H-2表型的另一种近交系小鼠体内初步测试范围是。每只小鼠注射剂量为一百万至一千万个细胞。平行实验中，部分小鼠在第一次注射约5天后接受第二次免疫耐受性诱导细胞注射。
第一次耐受性诱导细胞注射1周后，从同一供体品系小鼠背部取一块全层皮肤，去毛待用，作为同种异体移植物。该植皮用6-0尼龙线缝合到受体小鼠的右胸壁。经6周或更长的时间后，观察并判断该移植物基部是否还留有正常的上皮组织。如果没有事先免疫耐受诱导，植皮一般约在2周内就会被宿主排斥。
在植皮前，抽取小鼠的血样。移植后再每二周抽一次血样。血样可以用于许多测试。检测异体活性抗体，可以将受体血清与新鲜补体和铬-51标记的供体小鼠的目标细胞相混合。(比如，培养的成纤维细胞或从ES细胞系分化的后代细胞)。检测异体活性细胞毒T细胞，是将铬-51标记的供体小鼠的目标细胞和用Ficol液分离的受体小鼠的外周血单核细胞相结合。检测T细胞辅助细胞/T诱导细胞，是将受体PBMC和经放射处理过的供体PBMC或脾细胞相结合，并检测氚标记的胸腺嘧啶的结合情况。混合淋巴细胞反应的上清也可以通过夹心ELISA测量IFNγ，IL-2，TNFα或者IL-10(抗体由Genzyme公司生产)，以测定细胞水平的免疫反应性。
移植完成后，每隔几天应该观察受体是否有免疫排斥现象发生，比如脱毛、组织坏死以及移植物基部正常上皮细胞的消失。为检测免疫耐受性的强度和特异性，小鼠首次植皮成功约6周，由同一供体品系或第三方供体提供的第二块皮肤移植物，缝合在受体的另一侧胸壁。为评定受体免疫细胞的嵌合程度，可以收集受体动物的脾细胞和骨髓细胞，用针对某些蛋白(供体的H-2同种抗免疫球蛋白，受体的H-2抗同种免疫球蛋白，和诸如CD-4，CD8，B220，Mac-1等造血细胞标记蛋白)的特异抗体进行染色，进行FACS分析。受体对移植物的接受程度，应该和在各种免疫学试验中对特异免疫反应减弱程度相关，也可能与嵌合程度相关。
第二种动物是灵长类模型，利用猕猴ES细胞(Thomoson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第92期7844页，1995年)或人ES细胞((Thomoson等，Science，第282期114页，1998年)。首先ES细胞按照前文所述的方法分化成为免疫耐受性诱导细胞。根据小鼠模型确定的最佳剂量，按比例增加剂量，通过静脉注射到猕猴体内。，约1周后，宿主动物还需接受第二次注射。同时，相同的ES细胞系按照前文所述可分化成肝细胞样细胞或神经细胞。
约在注射后两周时，使免疫耐受性诱导的动物接受替代组织的同种异体移植物。肝细胞样细胞或神经前体细胞按照前文所述的方法从同一ES细胞系制备而成。分化细胞用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)进行内在标记，或者用可编码示踪蛋白基因，如绿色荧光蛋白(GFP)的表达载体标记。肝细胞样细胞可以接种到肾被膜或脾脏内。定期取血样分析对同种抗原的免疫反应以及受体的嵌合程度。方法同小鼠模型。经2、4或6后，在接种部位采集活体样本。通过检测内在标记物，以及通过免疫组织化学方法，检测活体样本肝脏特异性标记，MHC特异性标记或人源特异性标记(如果ES细胞是人源细胞)。可以活体样本反映出存活的移植细胞情况。
一旦确定了诱导同种特异性免疫耐受性的适宜条件，就可以利用认可的动物模型，开展其他各项辅助实验，以评估这种组织再生方案的效果。比如，可以根据Ma Donald等的报道(Nat Med第5期，1410页1999年)在急性脊髓损伤的大鼠模型上评估神经细胞的移植效果。成功的移植表现为，经2-5周后伤口处可出现移植物产生的细胞，并从伤口一端沿脊髓迁移。同时伴随着接受方动物习惯动作，协调和负重等生理能力的改善。肝细胞的置换效果可以根据模型动物的肝损伤修复能力评估。实例之一是由右旋半乳糖胺经腹膜注射造成肝脏损伤的模型(Dabeva等Am.J Pathol.第143期，1606页1993年)。按本发明所制备的心肌细胞的移植效果，可以在心脏经低温损伤的动物模型上进行评定。这种损伤将使动物左心室55％的室壁组织变为疤痕组织并无法修复。(Li等，Ann.Thorac.Surg.第62期，654页，1996年；Sakai等，Ann.Thorac.Surg.第8期，2074页，1999年；Sakai等，J.Thorac.Cardiovasc.Surg.第118期，715页，1999年)。
利用本发明诱导接受同种异体移植物体产生免疫耐受性时，操作者还可以有选择地使用其他一些辅助技术，另行论述。
比如，WO 99/51275(Osiris Therapeutics)提出用含有膜结合抗原的间充质干细胞来诱导特异T细胞的无应答，从而诱导免疫抑制性。WO 93/13785(Sachs等)，WO 95/21527(Sachs等)，WO 97/41863(Sachs等)及美国专利6,006,752(Sachs等)也提出了诱导免疫耐受性的一些方法。首先是将某一供体动物的造血干细胞输入到另一种受体动物的体内。受体动物将产生混合的免疫嵌合体，从而使其能接受来自第一种供体动物的移植物。
美国专利5,843,425(Sachs等)解释了怎样用特异性抗体去除免疫耐受性诱导的造血细胞制备物中的T细胞。WO 99/39727(Sytes等)推荐在使用造血干细胞时，同时使用能够抑制CD40和其配基相互作用的一种物质。根据美国专利5,786,708(Sachs等)，使接受方体内T细胞失活(比如，用CD4抗体和CD8抗体)，或使用免疫抑制剂(比如，环胞菌素A)，均可以增强造血细胞免疫耐受性的诱导效果。
美国专利5,858,963；5,863,528和WO 97/41863(Sachs等)中报道了如何联合使用骨髓细胞和细胞激动素(比如干细胞因子、IL-3、GM-CSF和IL-10)，使模型动物产生免疫耐受性。WO 93/09815(Sachs等)提出通过用可编码MHC抗原的核酸转染骨髓造血细胞，使受体动物对移植组织产生免疫耐受性。WO95/03062(CellPro公司)建议通过收集器官供体的细胞，富集造血细胞(比如CD+ve细胞)，在移植前输入到受体内，从而使接受方对实体移植器官产生免疫耐受性。
Morita等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第95期，6947页，1998年)叙述了一种对器官同种异体移植物诱导免疫耐受性的策略。首先把同种供体动物的脾细胞通过门静脉输入到接受方小鼠体内，1周后再将来源于同一供体的皮肤移植给接受方。在某些动物身上，移植物存活了1年，同时在体内出现了稳定的微嵌合体。由于细胞毒性T淋巴细胞诱导了针对供体的特异无反应，诱导配方中供体的T细胞明显促进了移植物的存活。5天后把同一来源的骨髓细胞输入接受方体内，可以显著提高耐受性的诱导效果。
Starzl等(Lancet，第339期1579页；1992年，N.Engl.J.Med，第328期，745页1993年)观察到接受肝脏移植的病人体内出现来源于供体的树突细胞和巨噬细胞。这些细胞可以从同种异体移植物迁移到接受方淋巴结构。其他关于诱导嵌合体及免疫耐受性的报道列举如下。
如前所述，根据本发明，在病人体内输入从人多功能干细胞(hPS)分化出的第一种细胞群后，就可形成一种表型使病人对次级细胞群产生免疫耐受性。目前较好的方法是通过血管注射输入诱导细胞。预期还含有其他一些输入法(比如，脾内注射)。预定采用细胞悬浮液，输入有诱导能力的细胞数在109到1011间。如必要，病人还可以接受充分或不充分的放射治疗或化学治疗。这样可以使造血组织形成空缺，以利移植细胞的嵌合体占位。
病人的免疫耐受性的建立，可以通过收集PBMC细胞，并利用射线处理过的II型提呈hPS供体细胞，做单向混合淋巴细胞反应试验(利用丫啶橙或细胞激动素来快速判读)。如需要，可以重复给药以强化诱导。
经过足够的时间和治疗，病人体内的免疫耐受性开始产生作用。此时可以把同源细胞产生的再生组织(或者和诱导细胞HLA相匹配的再生组织)移植到病人身上。根据同种免疫耐受性的强弱程度，最好对病人继续使用免疫抑制药物(比如，环胞霉素A或CD-4抗体)，可能会有利于移植物生根、转移并发挥作用。某些情况下，对病人虽然不能事先诱导免疫耐受性，但在移植再生细胞的同时或之后向病人输入免疫耐受性诱导细胞也可能有利于移植的成功。最终的治疗方案、剂量和监控的选择都要由主治医生来决定。
根据本发明制备的特异性免疫耐受诱导细胞，有希望和等渗赋形剂一起，在充分的无菌条件下做成药物制剂，用于病人的治疗。对药物制剂的一般原理，读者可以参考《细胞疗法干细胞移植，基因治疗和细胞免疫治疗》(G.Morstyn &W.Sheridan编著，剑桥大学出版社，1996年)和《造血干细胞疗法》(E.D.Ball，J.Lister & P.Law编著，Churchill Livingstone出版，2000年)。
对于诱导免疫耐受性的细胞所用的免疫耐受性诱导制剂可以和使用说明包装在一起。造血细胞通常需要和用于组织再生的HLA相容组织配伍，两种细胞制剂也可以一起做成试剂盒。
我们认为精通相关技术的人员可以有效地改变本文提出的配方和操作流程，而在本质上不至于偏离以下的权利要求。
权利要求
1.制备相关细胞代医疗用途的一种方法，包括a.使人多功能干细胞分化成为初级细胞群，和b.使人多功能干细胞分化成为次级细胞群。初级细胞群和次级细胞群具有MHC相容性。初级细胞群输入到一个个体体内后，将使该个体对次级细胞群产生免疫耐受性。
2.使病人重建细胞功能的一种方法包括a.把第1款权利要求中所提及的初级细胞群，输入个体体内，使该个体产生对次级细胞群的免疫耐受性，和b.把第1款权利要求中所提及的次级细胞群，输入个体体内，使该个体重建细胞功能。
3.以上各权利要求所列述的方法，其中第一、次级细胞群都来源于同一人多功能干细胞世系或其后代细胞。
4.以上各权利要求所列述的所有方法，其中初级细胞群中中胚层细胞占到大多数。
5.以上各权利要求所列述的方法，其中初级细胞群具有造血前体细胞、血液白细胞、白细胞前体细胞、巨噬细胞样细胞、树突细胞或间充质干细胞等特征。
6.以上各权利要求所列述的方法，其中初级细胞群的表型表达下列一种或几种标记物。CD34，T细胞受体，II型HLA，CMRF-44，CMRF-56，DEC-205，S100或CTLA-4。
7.制备初级细胞群的一种方法。即从人多功能干细胞分化出混合细胞群，从中富集能够表达CD34、T细胞受体、II型HLA、CMRF-44、CMRF-56、DEC-205、S100或CTLA-4.等标记物的细胞。当这类细胞输入到人体，将诱导对次级细胞群的免疫耐受性。
8.以上各权利要求所列述的方法，其中次级细胞群为下列细胞类型或相应世系限制的前体细胞。肝细胞、神经元、少突神经胶质细胞、星型胶质细胞、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞或皮肤细胞。
9.各种药用化合物的组合物，以不同容器分装a.从人多功能干细胞分化成具有一定表型的初级细胞群，它输入个体体内后，会使该个体对次级细胞群产生免疫耐受性，和b.次级细胞群具有和初级细胞群的MHC相容性。
10.权利要求第9款中所述的各种药用化合物，其中第一、次级细胞群都是从同一人多功能干细胞系分化而来。
11.权利要求第9，10款中的各种药用化合物，其中初级细胞群的主要成分都是中胚层细胞。
12.权利要求第9-11款中的所述各种药用化合物，其中初级细胞群具有造血前体细胞、血液白细胞、白细胞前体细胞，巨噬细胞样细胞、树突细胞或间充质干细胞等的特征。
13.权利要求第9-12款中的各种药用化合物，其中初级细胞群的表型呈现出下列一种或几种标记物。CD34、T细胞受体、II型HLA、CMRF-44、CMRF-56、DEC-205、S100或CTLA-4。
14.权利要求第9-13款中所述的各种药用化合物，其中次级细胞群适合下列细胞类型或相应世系限制性前体细胞。肝细胞、神经元、少突神经胶质细胞、星型胶质细胞、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞或皮肤细胞。
15.通过手术或治疗方式，用于治疗人或动物的药物制剂中，其中使用从人多功能干细胞分化出的具有某种表型的第一类细胞，它输入到个体体内后，将使该个体对次级细胞群产生免疫耐受性。
16.在可使人或动物针对次级细胞群产生免疫耐受性的药物制剂中，其中使用从人多功能干细胞分化出的具有某种表型的初级细胞群，它输入到个体体内后，将使该个体对第二类细胞产生免疫耐受性。
17.利用同源的两类细胞群制备的和类药用制剂，分别可同时或顺次施用，用于治疗人或动物。其中次级细胞群是从人多功能干细胞分化出的具有某种表型的细胞，具有重建个体细胞功能的作用。初级细胞群在输入到个体体内后，可诱导该个体对第二类细胞产生免疫耐受性。
18.权利要求第15-17款中所述的用途，其中初级细胞群的主要成分都是中胚层细胞。
19.权利要求第15-18款中所述的用途，其中初级细胞群具有造血前体细胞、血液白细胞、白细胞前体细胞、巨噬细胞样细胞，树突细胞或间充质干细胞等的特征。
20.权利要求第15-19款中所述的用途，其中初级细胞群的表型表达出下列一种或几种标记物。CD34、T细胞受体、II型HLA、CMRF-44、CMRF-56、DEC-205、S100或CTLA-4。
21.权利要求第15-20款中所述的用途，其中初级细胞群包含下述一种细胞型或其世系限定性前体肝细胞、神经元、少突神经胶质细胞、星型胶质细胞、心肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、胰岛细胞、内皮细胞、骨骼肌细胞或皮肤细胞。
22.权利要求15-21款所述的用途，其中初级细胞群配方供循环系统施用。
全文摘要
本公开提供了一种系统以克服来自干细胞的同种异体移植物和接受治疗以使组织再生的患者之间的HLA误匹配。通过施用一群来自干细胞的耐受性细胞(tolerizing cell)可以在患者中诱导出特异性免疫耐受状态。这使得患者可以接受来自同一来源分化细胞的同种异体移植物。本发明是重要的，因为它使得单一品系的干细胞能够作为任一患者组织再生的普遍供体，而无论组织类型。
文档编号A61P37/00GK1863906SQ01819312
公开日2006年11月15日 申请日期2001年11月21日 优先权日2000年11月22日
发明者赵赛壁, R·M·凯 申请人:杰龙公司