专利名称：抗肿瘤和抗病毒药物及其生产方法
技术领域：
本发明涉及具有治疗或预防肿瘤或癌症效果的抗肿瘤及抗病毒药物，及涉及生产这种药物的方法。本发明尤其涉及通过在激活的淋巴细胞中诱导热激蛋白而产生的抗肿瘤和抗病毒药物。
日本专利出版物No.03-080076揭示了如此增殖的淋巴细胞具有抗肿瘤作用。另外进一步意识到自身淋巴细胞具有一定的抗肿瘤活性，及使用通过白细胞介素2增殖的淋巴细胞的组合化疗可以有效地抗肺癌。
然而，目前还未提供是不是所有诱导前述HSP的细胞均具有抗肿瘤活性。另外，上述任何淋巴细胞不具备足够的抗肿瘤作用。因此，需要对肿瘤或癌症具有治疗作用的抗肿瘤和抗病毒药物。
本发明寻求提供对肿瘤或癌症具有明显治疗作用的抗肿瘤和抗病毒药物。
本发明还寻求提供有效抗肿瘤和抗病毒药物，其通过激活的淋巴细胞的抗肿瘤诱发适应力而对各种肿瘤起作用。
本发明还寻求提供一种生产对肿瘤或癌症具有明显治疗作用的抗肿瘤和抗病毒药物的方法。
发明内容
为实现本发明的上述目的，提供了通过激活淋巴细胞并在激活的淋巴细胞中诱导热激蛋白而生产的抗肿瘤和抗病毒药物的方法。在激活的淋巴细胞中诱导热激蛋白，是通过将生药的盖仑提取物(galenical extract)或其化合物加入激活的淋巴细胞中，或通过加热激活的淋巴细胞以提高一定分子量的热激蛋白表达，由此带来抗肿瘤和抗病毒作用。例如，具有规定分子量(优选70kDa)的热激蛋白，在激活的淋巴细胞中被诱导。
在激活的淋巴细胞中诱导具有上述规定分子量的热激蛋白的方法，包括在一定条件下加热或加温激活的淋巴细胞的步骤。诱导热激蛋白以生产本发明的抗肿瘤和抗病毒药物，是通过将生药如蛇根木(Rauwolfia serpentina)，linderae根提取物，红花(safflower)提取物和黄芩根(Scutellariae radix)的盖仑提取物或其化合物加入激活的淋巴细胞的培养溶液中。作为本发明抗肿瘤药物的主要配料，可单独使用利血平，或由提取的盖仑化合物如蛇根木提取物组成的利血平化合物。
本发明还提供了一种生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，包括激活淋巴细胞和在激活的淋巴细胞中诱导热激蛋白。生产本发明药物的方法是通过在激活的淋巴细胞中诱导具有上述规定分子量的热激蛋白进行的，包括在一定条件下加温激活的淋巴细胞的步骤。结合诱导具有规定分子量的热激蛋白的方法，本发明的生产方法可使用将生药如蛇根木，linderae根提取物，红花提取物和黄芩根的盖仑提取物或其化合物加入激活的淋巴细胞的培养溶液中的方法。对活生物体结合施用加温的激活的淋巴细胞和直接施用生药或其化合物，可在激活的淋巴细胞中诱导具有规定分子量70kDa级别的热激蛋白。
根据对上述实施方案的理解，本发明的其它和另外目的对本领域技术人员是显而易见的，或在所附权利要求中表明，根据本发明的实际应用，本领域技术人员还将知道在此未提及的本发明的各种优点。
热激蛋白(HSP)是一种免疫物质，大量包含于哺乳动物如人和动物细胞中。前述的HSP是一种蛋白质，其易于与热反应。通过在预定温度加热细胞以对细胞加以刺激(应激)，HSP可在细胞表面诱导。在近来的研究中，发现HSP是通过用化学处理刺激细胞诱导的。在任何情况中，诱导HSP的细胞具有更强的免疫功能，并可更有效地抗肿瘤或癌症。根据本发明，通过激活淋巴细胞和在规定条件下加热激活的淋巴细胞，可明显提高抗肿瘤和抗病毒作用。或者，淋巴细胞可通过向其中加入生药盖仑提取物或其混合物而激活。由此可诱导具有规定分子量(优选70kDa级别)的热激蛋白(HSP)。生产本发明抗肿瘤和抗病毒药物的步骤在以下详细阐述。〔收集淋巴细胞〕典型地，淋巴细胞可收集自小鼠或人。衍生自小鼠的淋巴细胞通常可从取自小鼠的脾或胸腺的淋巴液中分离。为获得衍生自人的淋巴细胞，可方便而容易地从取自人的周围血中的淋巴液中分离淋巴细胞。可从人的静脉取周围血。所取人的周围血量一般为0.01-100ml，但无特别限制。
考虑到对供体的负担，和收集周围血所花费的精力，及分离淋巴细胞的麻烦，可取的是一次取5-50ml血，优选取10-20ml血。另外，需要在收集的血中加入肝素或柠檬酸以防止血液凝固。或者，从收集的血中分离淋巴细胞，可通过已知的淋巴细胞分离法进行，如使用商购的蔗糖或淋巴分离介质的不连续密度梯度离心方法。〔培养和激活淋巴细胞〕如果从前述的脾，胸腺或周围血中收集的淋巴细胞是足够的，可仅激活淋巴细胞，因此理论上不需要增殖淋巴细胞。然而，实际上以前述方式难以收集足够量的淋巴细胞，因此可培养淋巴细胞以在体外增殖和激活。培养淋巴细胞可通过常规的细胞培养方法进行，其中将淋巴细胞在CO2浓度为1-10％，优选5％的温育器中，在大气温度为将近37℃的条件下培养。
在存在白细胞介素2和抗CD3抗体的条件下，可更有效的培养和增殖收集的淋巴细胞。在使用白细胞介素2和抗CD3抗体的情况中，培养淋巴细胞可通过使淋巴细胞漂浮在含有白细胞介素2的培养基中，并将培养基置于含有固相抗CD3抗体的温育器中。在此情况中，根据实际需要可使用各种类型促分裂原生长因子或激活因子，培养和增殖淋巴细胞。
适当的抗CD3抗体可选自能促进淋巴细胞培养和增殖的抗体，但非特别限于此。用于刺激淋巴细胞的抗CD3抗体可通过使用精制的CD3分子在动物或细胞中产生，可使用商购的OKT3抗体(由Ortho制药公司生产)，该抗体优势在于稳定及廉价。
根据增殖效率和处理淋巴细胞的方便性，需要使用固相的抗CD3抗体。为使抗CD3抗体凝结为固体状态，可使用玻璃，聚亚氨酯，聚链烯，聚苯乙烯等培养容器。可使用商购的由塑料制成的细胞培养瓶。培养容器或培养瓶的规格是任意确定的。
前述抗CD3抗体的固体化，是通过将抗CD3抗体的稀释液加入凝固器具中，并使其在大气中在大约4℃-37℃静置2-24小时而进行的。需要用缓冲盐溶液如无菌的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐溶液，将抗CD3抗体稀释为1-30μg/ml。在固化后，将稀释的固相抗CD3抗体保存在冷室或冰箱(4℃)中直至使用，并与溶液的液体部分分离，或者如果需要，用缓冲盐溶液如Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水在室温漂洗。
为提高抗CD3抗体的增殖效率，更需要在前述培养基中加入白细胞介素2。在此情况中，可使用商购的白细胞介素2，在培养基中的浓度为1-2000U/ml。在使用中，可将白细胞介素2溶解于培养基溶液中，一般使用的如是水，生理盐水溶液，Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水，RPMI-1640，DMEM，IMDM，AIM-V等。需要将溶解的白细胞介素2冷冻保存。
另外，所用培养基非限于上述培养基。可使用任何培养基培养淋巴细胞，只要其适于淋巴细胞培养。例如，在此所用的培养基可以是生物体衍生的培养溶液如血清，及通过加入氨基酸，维生素，核酸碱基等产生的合成培养基等。培养基也可以列举RPMI-1640，DMEM，和IMDM。在这些培养基中，RPIM-1640是最适于本文培养淋巴细胞的培养基。尽管可使用商购的培养基，添加正常人血清的培养基更利于增殖，并远远好于商购的培养基。〔诱导HSP/加热淋巴细胞〕加热淋巴细胞对在上述激活的淋巴细胞中诱导特异分子量的热激蛋白是有效的。本文诱导的热激蛋白具有良好的抗肿瘤功能，以治疗各种癌症，预防癌症复发，及改良抗病毒功能。为保证这些抗肿瘤和抗病毒功能，需要使用分子量在60-80kDa，优选70kDa的热激蛋白。为获得具有前述分子量的HSP，加热增殖的淋巴细胞可在规定的温度和时间条件下选择性地进行，所用条件是根据加温培养容器和淋巴细胞情况而确定的。
然而，由于淋巴细胞的常规培养温度是37℃，应将淋巴细胞在最短的时间内在高于常规培养温度的环境温度加热，以不破坏淋巴细胞组织。即当加热温度低于38℃时，热激蛋白难以诱导，反过来，加热温度高于50℃，可能攻击淋巴细胞。因此，推荐将激活的淋巴细胞加温至38-50℃，优选42-45℃，时间为几秒至几小时，例如5秒-6小时，优选10分钟-60分钟。
就加热淋巴细胞的加温容器而言，可使用塑料离心管，培养袋，输液袋或任何其它能在无菌条件下保持淋巴细胞的适当器皿。〔诱导HSP/提取生药〕在激活的淋巴细胞中诱导具有规定分子量热激蛋白的另一种方法是，可将生药的盖仑提取物或其化合物加入以前述方式收集的或增殖的淋巴细胞的培养溶液中。可用于此方法的生药包括蛇根木，linderae根提取物，红花提取物和黄芩根及这些生药中包含的化合物。
更特异性的，生药的盖仑提取物可通过将几克至几吨的生药碾成粉末，将这些碾末的生药浸在有机溶剂或水与有机溶剂的组合物中，静置几小时至几周而生产。将盖仑提取物通过冻干法，重蒸法或其它适当方法固体化或浓缩。可采用一种试验性的方法产生生药的盖仑提取物，通过将生药用剪刀剪切成大约10g的生药片，并将生药片浸于含有大约50％乙醇的蒸馏水中3天。
就生药的化合物而言，使用的粒子为利血平。从这样得自生药的盖仑提取物中，获得浓度例如为几纳克至几百毫克的提取调制品。将这样获得的提取调制品加入收集的淋巴细胞或增殖的淋巴细胞中，由此在激活的淋巴细胞上诱导所需的热激蛋白。
通过同时加热激活的淋巴细胞和在激活的淋巴细胞中加入生药的盖仑提取物所带来的协同效果，可促进分子量为60-80kDa，优选70kDa的热激蛋白高效诱导。另外，通过将加热或加温的激活的淋巴细胞施用于活体，并将生药或其化合物直接皮下施用于活体，则施用于活体的激活的淋巴细胞更活性地促进分子量为大约70kDa的热激蛋白诱导。
在离心后，除去上清，加入培养溶液以获得2×106/ml的溶液。将这样获得的溶液移至含有来自小鼠的固相抗CD3抗体的培养皿中，并持续培养4天。将所得溶液用磷酸盐缓冲液(简称为PBS)进一步漂洗两次，以制备淋巴细胞，用于加热处理。
在导入EL-4细胞后，静脉内施用实施例1中制备的3×106个热处理的激活的淋巴细胞，并皮下施用利血平。在每个实验的小鼠中，每4天皮下给予利血平200μg/kg体重，及给予未处理的淋巴细胞，在由12只小鼠组成的对照组中，每4天只给予200μg利血平/kg体重。本实施方案所用的是蛇根木提取物的利血平，但其也可以是由从蛇根木或其它化合物提取的化合物制成的。尽管可单独施用上述利血平，但其也可用作与其它初级添加剂联合的二级制剂。
在此阶段后，观测小鼠的存活率，以评价加热处理激活的淋巴细胞和利血平的抗肿瘤作用。结果示于下表1。如表1所示，即使只施用利血平也具有抗肿瘤作用，但组合施用利血平和加热处理激活的淋巴细胞，可产生更良好的抗肿瘤作用，可增强抗肿瘤能力。
表1存活小鼠数
从前面的阐述中显而易见，根据本发明对人具有有益作用的抗肿瘤和抗病毒药物，可通过激活收集的或增殖的淋巴细胞，及加热激活或增殖的淋巴细胞，或在激活或增殖的淋巴细胞中加入生药的盖仑提取物或其化合物而生产。这样产生的抗肿瘤和抗病毒药物具有诱导具有规定分子量的热激蛋白的功能，最大可能地达到抗肿瘤和抗病毒作用。即使在收集自人周围血的淋巴细胞或激活培养的淋巴细胞中，也可诱导规定分子量为70kDa级别的热激蛋白。特别地，具有加热处理诱导的热激蛋白的激活的淋巴细胞，可明显有效预防和治疗人体的各种癌症和肿瘤。即本发明的激活的淋巴细胞对胃癌，肝癌，胰腺癌，肾癌，结肠直肠癌，肺癌，脑肿瘤，肉瘤等具有有益的抗肿瘤和抗病毒作用。
另外，本发明激活的淋巴细胞具有预防癌症和肿瘤复发，预防和治疗各种感染性疾病和自身免疫性疾病的作用。本发明的激活的淋巴细胞特别对微生物，病毒感染等具有有益作用。病毒感染的致病病毒是人免疫缺陷病毒，EB病毒，巨细胞病毒，疱疹病毒，流感病毒等。即本发明的药物可以有效的抗由已知或未知的病毒所致的几乎全部类型病毒感染性疾病。
根据本发明，具有明显抗肿瘤和抗病毒功能的分子量为60-80kDa的热激蛋白，可通过将生药的提取物如蛇根木，linderae根提取物，红花提取物和黄芩根及这些生药中包含的化合物，加入激活的淋巴细胞的培养溶液中而诱导。根据本发明的方法，组合加热激活的淋巴细胞和在激活的淋巴细胞中加入生药的盖仑提取物可带来协同作用，促进分子量为70kDa的热激蛋白的诱导。另外，将已进行加热的激活的淋巴细胞施用于活体，并将生药或其化合物直接皮下施用于活体，则施用于活体的激活的淋巴细胞可更加活性促进分子量为大约70kDa的热激蛋白的诱导。
权利要求
1.通过激活淋巴细胞并在激活的淋巴细胞中诱导热激蛋白而生产的抗肿瘤和抗病毒药物。
2.权利要求1的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述的诱导的热激蛋白分子量为60kDa-80kDa。
3.权利要求1的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述的诱导的热激蛋白分子量为70kDa。
4.权利要求1-3任一项的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述热激蛋白是通过加热所述激活的淋巴细胞而诱导的。
5.权利要求4的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述淋巴细胞在38℃-50℃加热，从而诱导所述的热激蛋白。
6.权利要求4的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述淋巴细胞在38℃-50℃加热5秒-6小时，从而诱导所述热激蛋白。
7.权利要求4的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述淋巴细胞在42℃-45℃加热，从而诱导所述的热激蛋白。
8.权利要求4的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述淋巴细胞在42℃-45℃加热10分钟-60分钟，从而诱导所述的热激蛋白。
9.权利要求1-3任一项的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述热激蛋白是通过将生药的盖仑提取物或其化合物加入所述激活的淋巴细胞的培养溶液中而诱导的。
10.权利要求9的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述的生药是蛇根木(Rauwolfia serpentina)。
11.权利要求10的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述蛇根木的化合物是利血平。
12.权利要求9的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述生药是linderae根。
13.权利要求9的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述生药是红花提取物。
14.权利要求9的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述生药是黄芩根。
15.单独由利血平组成的或由含有利血平作为主要配料的抗肿瘤药物。
16.权利要求15的抗肿瘤和抗病毒药物，其中所述利血平产生自蛇根木的盖仑提取物。
17.一种生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，包括激活淋巴细胞，加热所述激活的淋巴细胞，从而在所述淋巴细胞内诱导热激蛋白的步骤。
18.权利要求17的生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，其中所述诱导的热激蛋白分子量为60kDa-80kDa。
19.权利要求17的生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，其中所述诱导的热激蛋白分子量为70kDa。
20.权利要求17-19任一项的生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，其中所述淋巴细胞在38℃-50℃被加热，从而诱导所述热激蛋白。
21.权利要求17-19任一项的生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，其中所述淋巴细胞在38℃-50℃被加热5秒钟-6小时，从而诱导所述热激蛋白。
22.权利要求17-19任一项的生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，其中所述淋巴细胞在42℃-45℃被加热10分钟-60分钟，从而诱导所述热激蛋白。
23.一种生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，包括激活淋巴细胞，将生药的盖仑提取物或其化合物加入所述激活的淋巴细胞的培养溶液中，从而在所述淋巴细胞中诱导热激蛋白。
24.权利要求23的生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，其中所述生药是蛇根木，linderae根提取物，红花提取物或黄芩根。
25.一种生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，包括激活淋巴细胞，并加热所述激活的淋巴细胞，同时将生药的盖仑提取物或其化合物加入所述激活的淋巴细胞的培养溶液中，从而在所述淋巴细胞中诱导分子量为60kDa-80kDa的热激蛋白。
26.一种生产抗肿瘤和抗病毒药物的方法，包括激活淋巴细胞，加热所述激活的淋巴细胞，将如此加热的激活的淋巴细胞和生药的盖仑提取物或其化合物同时施用于活体，从而在所述淋巴细胞中诱导分子量为60kDa-80kDa的热激蛋白。
全文摘要
对肿瘤或癌症具有治疗或预防作用的抗肿瘤和抗病毒药物,可通过激活收集或增殖的淋巴细胞,在激活的淋巴细胞中诱导具有规定分子量的热激蛋白而产生。通过加热激活的淋巴细胞或将生药的盖仑提取物或其化合物加入激活的淋巴细胞中,在激活的淋巴细胞中可诱导具有所需70kDa级别分子量的的热激蛋白。因此,可获得对预防和治疗各种类型癌症,肿瘤和病毒感染有明显效果的药物。
文档编号A61K45/00GK1371723SQ02105348
公开日2002年10月2日 申请日期2002年2月26日 优先权日2001年2月26日
发明者丁宗铁 申请人:株式会社淋巴技术