专利名称：白细胞介素－18突变体、其制品及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物活性比野生型蛋白质高的IL-18突变体。
背景技术：
1989年有人(Nakamura等人，1993)叙述了一种内毒素诱导的血清活性，该活性诱导小鼠脾细胞的干扰素-γ(IFN-γ)。这种血清活性所起的作用不是IFN-γ的直接诱导剂，而是与IL-2、IFN-/、TNF或有丝分裂原一起起着共同刺激剂的作用。有人尝试由内毒素后小鼠血清提纯这种活性，结果揭示了一种分子量为50-55kDa表观均一的蛋白质(Nakamura等人，1993)。由于其他细胞因子可以作為IFN-γ的产生的共同刺激剂，所以无法通过中和抗IL-1、IL-4、IL-5、IL-6或TNF的抗体来中和血清活性表明它是一种截然不同的因子。同一批科学家在1995年证实了以疮疱棒状杆菌(P.acnes)预处理的小鼠肝脏提取物中含有由内毒素诱导产生IFN-γ的共同刺激剂(Okamura等人，1995)。此模型的肝脏巨噬细胞群(Kupffer细胞)扩展，低剂量细菌脂多糖(LPS)在未经预处理的小鼠中是不致命的，但在这些小鼠是可致命的。该因子被命名为IFN-γ诱导因子(IGIF)，后来又被称为白细胞介素-18(IL-18)，由1,200克经疮疱棒状杆菌处理过的小鼠肝脏提纯至均质。采用由纯化IL-18的氨基酸序列所产生的简并寡核苷酸来克隆小鼠IL-18 cDNA(Okamura等人，1995)。在活化的巨噬细胞中不难检测到IL-18和白细胞介素-12(IL-12)的信使RNAs。IL-18本身不会诱导IFN-γ，但其主要功能是与有丝分裂原或IL-12一起作为共同刺激剂。IL-18的人cDNA序列在1996年已有报导(图1A所示的SEQ ID NO1)。
白细胞介素IL-18具有IL-1蛋白质家族的结构特征(Nakamura等人，1993；Okamura等人，1995；Ushio等人，1996；Bazan等人，1996)。与其他大多数具有四螺旋束结构的细胞因子不同，IL-18和IL-1β全部为β-折叠结构(Tsutsui等人，1996)。IL-18与IL-1β相似，被合成为一种没有生物活性的前体(proIL-18)，缺少信号肽(Ushio等人，1996)。IL-1β和IL-18前体由caspase 1(IL-1β转化酶或ICE)在P1位置上天冬氨酸残基之后割开。所得到的成熟细胞因子较易从细胞释放出来(Ghayur等人，1997和Gu等人，1997)。
IL-18是一种通过T辅助I型(Th1)细胞产生细胞因子(IFN-γ、IL-2和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)的共同刺激剂(Kohnoet等人，1997)，也是小鼠天然杀伤细胞克隆由FAS配体介导的细胞毒性的共同刺激剂(Tsutsui等人，1996)。
Th1淋巴细胞参与抗肿瘤的免疫反应(Seki等人，2000)。Th1反应包括分泌细胞因子IL-2、IL-12、IL-18和IFN-γ，以及产生识别特异性肿瘤抗原的具有细胞毒性的特异性T淋巴细胞。Th1反应也是宿主防御许多微生物的一条生命臂(vitalarm)。然而，Th1反应也与不希望的副作用相关，如产生一些自身免疫疾病、炎症和器官移植排斥。
试图用编码成熟蛋白的载体来表达大肠杆菌的成熟型IL-18也无法提供具有完全活性的细胞因子。有人研制了一个产生具有完全生物活性的人IL-18的有效表达系统供治疗使用，例如，需要诱导IFN-γ的恶性肿瘤或任何一种病情(WO00/61768)。在此系统中，将IL-18前体caspase 1切割位点改为Xa因子位点(ICE/Xa)，并采用编码IL-18 ICE/Xa前体的载体转化大肠杆菌。在大肠杆菌表达该IL-18前体后，在体外通过Xa因子切割产生成熟IL-18。这种由Xa因子切割产生的成熟IL-18具有完全活性。
细胞因子结合蛋白(可溶性细胞因子受体)通常是其各自细胞表面细胞因子受体的胞外配体结合结构域。它们或通过可变换的剪接或通过细胞表面受体蛋白裂解而产生。过去已对这些可溶性受体进行了叙述，例如，IL-6和IFN-γ的可溶性受体(Novick等人，1989)、TNF(Engelmann等人，1989；Engelmann等人，1990)、IL-1和IL-4(Maliszewski等人，1990)、IFN-α/β(Novick等人，1994；Novick等人，1992)。一种称为骨保护素(OPG，也称破骨抑制因子-OCIF)的细胞因子结合蛋白是TNFR/Fas家族的成员，它似乎是仅作为分泌蛋白而存在的第一种可溶性受体(Anderson等人，1997；Simonet等人，1997；Yasuda等人，1998)。
通过在IL-18柱上进行亲和纯化从尿中得到了结合IL-18的蛋白质(IL-18BP)(Novick等人，1999)。IL-18BP在体外消除了IL-18对IFN-γ和IL-8的诱导以及对NF-κB的活化，在体内消除了IL-18对IFN-的诱导。IL-18BP是一种可溶性循环蛋白，在脾中固有地表达，属于免疫球蛋白超家族。最富含的IL-18BP同种型(剪接变体同种型a)对IL-18具有高亲和力，结合速率快，解离速率慢，解离常数(Kd)约为400pM(Kim等人，1999)。
有人利用计算机模型(Kim等人，1999)和基于IL-1与IL-1R I型的相互作用(Vigers等人，1997)对参与IL-18和IL-18BP相互作用的残基进行了叙述。在IL-18与IL-18BP结合的模型中，提出将IL-18的42位上Glu残基和89位上Lys残基分别与IL-18BP的Lys-130和Glu-114结合(Kim等人，1999)。
IL-18固有地存在于许多细胞中(Puren等人，1999)，并在健康人体内循环(Urushihara等人，2000)。IL-18BP对IL-18具有高亲和力以及在循环中IL-18BP的浓度高(相对IL-18过量20倍摩尔)，表示细胞因子生物学的独有状况。所以，在循环中即使不是全部但大部分IL-18分子与IL-18BP结合。与IL-18的细胞表面受体竞争的循环IL-18BP可用作天然消炎和免疫抑制分子。
一些病毒因子编码的IL-18BP相似蛋白质，例如传染性软疣病毒性蛋白MC53和MC54，与哺乳动物IL-18BP高度同源(Novick等人，1999)。传染性软疣病毒性蛋白MC53和MC54具有结合与中和人IL-18的能力，方式与IL-18BP相似(Xiang和Moss，1999)。缺肢痘病毒p13蛋白质与IL-18BP同源，在体外与IL-18结合，并抑制其活性。感染p13缺失突变病毒的小鼠显示感染水平下降(Born等人，2000)。故感染程度似乎与是否有IL-18BP相关。
循环IL-18BP的水平高可能表示一种自然防御，这种防御针对自身免疫疾病的感染和发病的失控Th1反应。然而，IL-18有利于在抗肿瘤宿主防御中起重要作用的Th1反应。因此，IL-18BP可能会使宿主无法产生抗肿瘤细胞且具有细胞毒性的T细胞。事实上，有证据显示，IL-18在小鼠体内启动抗肿瘤的宿主防御。例如，同系小鼠中表达小鼠IL-12或小鼠IL-18的小鼠乳腺癌细胞与不表达细胞的对照组相比，致癌性更低，肿瘤形成的速度更慢(Coughlin等人，1998)。抗体中和作用研究显示抗癌作用需要IFN-γ。在另一项研究中，全身给予实验动物IL-18和表达B7-1(CD80)的B16黑素瘤，结果发现黑素瘤的形成、肿瘤的生长受到显著抑制，而生存能力有很大的改善(Cho等人，2000)。
采用细胞因子作为辅助剂，提高癌症的免疫治疗效果。例如，给予IL-12治疗肾脏细胞癌或黑素瘤(Gollob等人，2000)。通常，用细胞因子进行治疗的一个主要后果是严重的全身中毒。采用由患者自身肿瘤或树突状细胞表达的细胞因子在逻辑上是解决问题的一个方案。但如果IL-18在肿瘤免疫治疗中作为辅助剂局部使用，则固有水平的IL-18BP在局部环境内中和IL-18的能力仍得到发挥，其结果是效果被大大削弱。
采用非清髓同种异体移植即所谓微型移植物治疗白血病和固态瘤，在诱导移植物抗白血病和移植物抗肿瘤的反应方面不断取得成功(Slavin S.，2000；Slavin等人，2000)。有两项研究采用了同种异体外周血干细胞(Childs等人，2000)或树突状细胞(Kugler等人，2000)来治疗转移性肾细胞癌病人，结果取得了令人瞩目的成功。虽然这些研究还有待深入研究和证实，但移植物抗肿瘤的反应可用于癌症的免疫治疗这一概念正得到越来越多人接受(Slavin等人，2000)。因为IL-18似乎与这些获得成功的治疗方法有关，所以如果可消除IL-18BP的中和作用，就可以获得更好的结果。
EP 0845530叙述了IL-18突变体(IFN-γ、诱导因子)。所述的IL-18突变体是这些一些分子，其IL-18的1、2、3或全部4个半胱氨酸残基(图1B)被丝氨酸或丙氨酸残基取代。这些突变体含有一个完整的共有序列(图1B)。所有分离的突变体具有比野生型IL-18更好的稳定性。突变体的稳定程度与分子中被取代的半胱氨酸残基数直接成正比。EP 0845530没有对IL-18BP中和这些突变体的能力予以叙述。
所以，高度优选的是产生以及在治疗上使用不能与IL-18BP结合或以低亲和力结合且具有完全活性的IL-18。
发明内容
本发明涉及一种IL-18突变体多肽，其包括一个或多个与IL-18结合蛋白相互作用的氨基酸残基上的突变。更加具体地说，这些突变是取代，优选为非保守性取代，插入或缺失。所述肽中发生突变的这些残基可选自Glu-42、Ile-85、Met-87、Lys-89、Met-96、Asp-130、Lys-132、Pro-143、Met-149和Leu-189，优选为Glu-42和Lys-89。
在一实施例中，Glu-42或Lys-89或者Glu-42和Lys-89两者都被非极性氨基酸，优选被丙氨酸所取代。
另外，本发明提供了编码所述多肽的DNA，优选为编码SEQ ID NO3、SEQ IDNO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8的多肽的DNA。
在一实施例中，编码SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8的DNA与信号肽，优选与人生长激素信号肽融合。此外，本发明还提供了一种含有所述DNA的载体，该载体能够在合适的宿主细胞，例如原核生物或真核生物宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。
另外，本发明还提供了含有所述多肽的药物组合物，其用来治疗通过Th1反应可被预防或减缓的疾病，优选用于治疗病毒性疾病或癌症。
图1A所示为编码野生型IL-18前体的核苷酸序列和用来构建突变IL-18蛋白的引物位置。
图1B所示为成熟IL-18的氨基酸序列。白框中所包含的为不同种IL-18之间的共有序列。下划线者为半胱氨酸。深色框所示为本发明IL-18中发生突变的残基。
图2所示为本发明IL-18突变体的示意图。His-6表示融合在IL-18前体前段(propiece)N末端上的6个组氨酸位置。箭头表示被Xa因子切割位点(x)所取代的ICE切割位点。WT表示野生型成熟IL-18。E42A表示G1u-42向Ala的突变，K89A表示Lys-89向Ala的突变，E42A/K89A表示双重突变。在前体/x/WT的基础上，通过两步PCR产生了三种IL-18突变体(E42A、K89A和E42A+K89A)。
图3A所示为在图3B X轴下面所示浓度以及在IL-12(0.5纳克/毫升)存在下由IL-18野生型和突变蛋白在NKO细胞中诱导IFN-γ。
图3B所示为在X轴下面所示浓度以及在IL-12(1.0纳克/毫升)存在下由IL-18野生型和突变蛋白在PBMCs细胞中诱导IFN-γ。
图4A所示为IL-18BP对人IL-18野生型和突变蛋白在NKO细胞中诱导IFN-γ的影响。室温下将突变体和野生型IL-18(30纳克/毫升)与X轴(图3B)下面所示浓度的IL-18BP预培育1小时，再加入到NKO细胞，用IL-12(0.5毫克/毫升)刺激。
图4B所示为IL-18BP对人IL-18野生型和突变蛋白在PBMCs细胞中诱导IFN-γ的影响。室温下将突变体和野生型IL-18(30纳克/毫升)与X轴下面所示浓度的IL-18BP预培育1小时，再加入到PBMCs细胞，用IL-12(1.0毫克/毫升)刺激。
图5所示为由IL-18野生型和突变蛋白诱导IL-8。将PBMCs与IL-18野生型和突变蛋白(30纳克/毫升)一起培育。多黏菌素B(1克/毫升)在加入PBMCs之前将它与IL-18混合30分钟。24小时后，移去上清液，以ECL(实施例9)分析IL-18的浓度。图中示出三个实验其中之一。
具体实施例方式
本发明涉及IL-18突变体或其活性片段、或突变蛋白质或其任何一种其他蛋白质或肽衍生物(IL-18M)，它们与野生型(IL-18WT)相比更不易被IL-18BP中和。具体地说，IL-18野生型的一个或多个氨基酸，宜不超过30个，优选最高为10个氨基酸，可被其他氨基酸取代，或被除去，或者可加入一个或多个氨基酸，宜不超过30个，优选最高为10个氨基酸，以产生一种更不易被IL-18BP中和的活性IL-18突变体。氨基酸可被不同的氨基酸所取代，这种取代最好是非保守性取代。更具体地说，所述的突变可针对预料参与结合IL-18BP的残基，例如，Glu-42、Ile-85、Met-87、Lys-89、Met-96、Asp-130、Lys-132、Pro-143、Met-149和Leu-189，更优选为Glu-42和/或Lys-89(Kim等人，1999)。
IL-18M可在真核生物系统或真核生物表达系统的细胞内或周质产生，或者可分泌到介质中。所产生的IL-18M可恢复为可溶性或非可溶性形式(内含体)。
一种含有前体IL-18M cDNA的载体可用来表达在原核生物系统中正确装配的前体IL-18M。然后，在体外通过ICE切割后可产生具有完全活性的成熟蛋白质。编码一种蛋白酶，优选Xa因子的特异性切割位点的序列可置换IL-18M前体的ICE序列。
一种编码与成熟IL-18M cDNA融合的有效信号肽，优选人生长激素信号肽的表达载体可用于真核生物的表达和分泌。
用于构建突变体的亲代IL-18cDNA可选自小鼠或人。
IL-18M可用表位标记，最好用组氨酸标记，方便提纯。重组IL-18M可用常规方法或亲和力方法纯化。利用特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)可监测所产生的IL-18M的量。
IL-18M可用于药物制剂，以治疗通过Th1反应特别是通过IL-18治疗可被预防或减缓的疾病，例如微生物感染或癌症。采用突变体而不用野生型蛋白质的优点在于它可抗IL-18BP中和。
更具体地说，IL-18M可全身或局部给予，在肿瘤治疗中作为肿瘤抗原辅助剂。
可以分离病人的肿瘤细胞，并作基因改造以分泌IL-18M，再重新移植到同一个病人体内，作局部接种疫苗(Coughlin等人，1998)。将表达IL-18M的改造细胞与同种异体树突状细胞(抗原递呈细胞)融合可进一步提高肿瘤的抗原性，因此增强抗肿瘤反应。
IL-18M在DNA接种疫苗中可作为辅助剂而给予(Tuting等人，1998)。与先前报导的使用细胞因子IL-12和IFN-γ的方式相似。在此情况下，利用基因枪可接种透皮肿瘤抗原疫苗。这导致皮肤中具有编码肿瘤抗原和IL-18M的DNA的驻留树突状细胞转染。另外，树突状细胞也可在过继转移后进行体外改造。
IL-18M可用作移植物抗肿瘤治疗的辅助剂。采用同种异体干细胞来移植癌症病人。为了增加由同种异体细胞的移植所诱导的移植物抗肿瘤排斥，可全身或局部给予IL-18M，优选通过在经过基因改造的同系树突状细胞或病人抽取肿瘤细胞中的IL-18M表达给予。
应明白，本文结合优选具体实施例对本发明进行了叙述，上述说明以及下列实施例是用来作举例说明，并不构成对本发明范围的限制。本发明范围内的其他方面、优点和改进对本发明所属技术领域的技术人员来说是显而易见的。
实施例实施例1用于通过Xa因子切割来表达野生型proIL-18组氨酸标记融合蛋白的载体的构建为了在大肠杆菌中产生正确装配的IL-18，用Xa切割位点代替IL-18前体的ICE切割位点。然后，在体外通过Xa切割IL-18前体而产生活性蛋白(WO 00/61768)。
如所述那样(Ghayur等人，1997)，分离编码用来产生表达质粒的人IL-18前体(proiL-18，基因库查询号为D49950，图1)的cDNA序列(Ghayur等人，1997)。
采用2次PCR反应(参见图1所用的引物)就可以实现用Xa切割位点代替ICE切割位点。第1次PCR反应用含有位于ORF上游EcoR1位点的有义引物(Pr1)5’-ATATGAATTCATGGCTGCTGAACCAGTAG(SEQ ID NO11)和为ICE位点(33-LESD-36)而设计且其中6个核苷酸已被改成编码Xa因子位点(33-IEGR-36)的反向引物(Pr2)5’-AAAGTAACGTCCTTCGATGTTTTC(SEQ ID NO12)，产生了IL-18cDNA的前段。采用与Pr2互补的有义引物(Pr3)5’-GAAAACATCGAAGGACGTTACTTT(SEQ IDNO13)和含有IL-18编码序列下游BamHI位点的反向引物(Pr4)5’-ATATGGATCCTAGTCTTCGTTTTGAACAGTG(SEQ ID NO14)，产生了编码成熟IL-18的扩增DNA片段。通过在1％琼脂糖电泳溶解前段108bp和成熟的474bp IL-18 DNAs，并用凝胶提取系统(GIBCO/BRL)洗脱。
第2次PCR反应取2段在第1次PCR反应中获得的DNA片段，以1∶1混合，与引物Pr1和Pr4一起产生了完全人IL-18 cDNA，其ICE位点被Xa因子位点所取代(ICE/Xa)。
以EcoRI和BamHI(GIBCO/BRL)限制位点将proIL-18(ICE/Xa)与BlueScipt质粒(Stratagene)连接。这种质粒用来作序列确认。预测被编码的氨基酸序列参见SEQ ID NO2。对于大肠杆菌表达，借助EcoRI和XbaI位点(源自BlueScipt)将IL-18 DNA插入片段与pROEX HTa载体(GIBCO/BRL)重新连接。在这种载体中，所得的蛋白质在N末端上与组氨酸标记融合。
实施例2E42A、K89A和E42A/K89A突变体的构建在预料对结合抑制剂IL-18BP至关重要的残基上建立IL-18突变(Kim等人，2000)。产生了三种突变体E42A、K89A和E42A/K89A。如实施例1所述，采用下面的引物和模板(引物见图2)通过2次PCR反应就可实现突变。
E42A突变体第1次PCR反应制备突变体E42A所用的引物对是A对——Pr1(实施例1)和编码丙氨酸而非谷氨酸(E42)的反向引物(Pr5)5’-TAA TTT AGA TGC AAG CTT GCC(SEQ ID NO15)与B对——编码丙氨酸而非谷氨酸(GAA到GCA)的有义引物(Pr6)5’-GGC AAG CTT GCA TCT AAA TTA(SEQ ID NO16)和反向引物Pr4(实施例1)，以proIL-18(ICE/Xa)作为PCR反应的模板。
第2次PCR反应取2段在第1次PCR反应中获得的DNA片段，作为第2次PCR反应的模板，引物为Pr1和Pr4。
K89A突变体第1次PCR反应制备突变体K89A所用的引物对是A对——Pr1(实施例1)和编码丙氨酸而非赖氨酸(K89)的反向引物(Pr7)5’-CTG GCT ATC TGC ATA CAT ACT(SEQ ID NO17)与B对——编码丙氨酸而非赖氨酸(AAA到GCA)的有义引物(Pr8)5’-AGT ATG TAT GCA GAT AGC CAG(SEQ ID NO18)和反向引物Pr4(实施例1)，以proIL-18(ICE/Xa)作为第1次PCR反应的模板。
第2次PCR反应取2段在第1次PCR反应中获得的DNA片段，作为第2次PCR反应的模板，引物为Pr1和Pr4。
E42A/K89A突变体双重突变E42A/K89A所用的引物与制备E42A突变所用的引物相同，用突变体K89A cDNA作为反应模板。
三种IL-18突变基因之每一种均与BlueScipt载体连接，以便作序列确认。前体IL-18 E42A、K89A和E42A/K89A突变体的预测氨基酸序列分别参见SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5。对于大肠杆菌表达，借助EcoRI和XbaI位点可将三种IL-18DNA插入片段之每一种与pROEX HTa载体(GIBCO/BRL)重新连接。所得的蛋白质在N末端上与组氨酸融合(图1)。
实施例3蛋白质的表达和纯化IL-18突变体前体在大肠杆菌中表达，通过组氨酸标记亲和纯化，利用Xa因子进行蛋白酶切割产生了各个成熟分子。
按照文献(11)所述那样，将四种pROEX HTu/IL-18质粒(野生型和三种突变体)中每一种导入DHO菌株(GIBCO/BRL)的感受态大肠杆菌细胞中，并得到表达。取25毫升过夜培养，用作450毫升含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB培养基的接种物，让其生长至细胞密度为0.6-0.1 OD600。用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG，0.3mM)处理诱导蛋白质表达，在37℃连续摇动培养3小时。离心(4℃下5,000xg离心15分钟)收获培养的细菌细胞，将沉淀悬于30毫升Talon缓冲液(50mM磷酸二氢钠/20mMTris-HCl/100mM氯化钠，pH8)中。在冰上超声波(2x30秒脉冲)溶解细胞。离心(4℃下4,000xg离心30分钟)得到可溶性蛋白质，将这些蛋白质装在3毫升微型Talon柱(CLONTECH)内。用30床容积的Talon缓冲液洗涤Talon柱，用含6毫升100mM咪唑的Talon缓冲液洗脱。在4℃下将洗脱液对Xa因子缓冲液(20mM Tris-HCl/150mM氯化钠/2mM氯化铯)透析20小时。取0.2毫升经Talon亲和纯化的N末端His x 6融合proIL-18，室温下在2mM苯甲基磺酰氟(GIBCO/BRL)存在下与4微克Xa因子酶(New England Biolabs)培养4小时。用特异性ELISA(R&D Systems)监测所产生的IL-18的量。成熟IL-18野生型、E42A、K89A和E42A/K89A突变体的预测氨基酸序列分别参见SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8。
实施例4通过蛋白质印迹法对E42A、K89A和E42A/K89A IL-18突变蛋白作特性分析用对成熟IL-18具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体对纯化的IL-18突变体作蛋白质印迹分析。
使等量经过Talon亲和纯化的前体和成熟蛋白(被Xa因子切割后)的野生型和突变体IL-18在还原条件下通过SDS/PAGE(10％丙烯酰胺)解离。将这些蛋白质转移到硝酸纤维膜，再与一级抗体(兔抗人IL-18多克隆抗体或单克隆抗体克隆8-31-4(IgG2a)，它们抗重组成熟形式的人IL-18(Puren等人，1999)，也可识别前体IL-18)一起培养。培养24小时后，加入相应的第二抗体山羊抗小鼠或驴抗兔IgG过氧化物酶(Jackson Immuno Research)，并通过ECL法(New England Nuclear LifeScience Products)进行分析。
对于野生型和各种突变体，用多克隆兔抗人IL-18得到的proIL-18的染色程度相等。类似地，成熟野生型和IL-18以及各种突变体用多克隆抗血清所得到的信号强度相等。表观分子量表示不同形式的IL-18具有正确的分子大小。与之相反，当采用单克隆抗体时，两种突变体K89A和E42A/K89A的染色似乎比野生型和E42A突变体深，提示单克隆抗体对于这些突变体的亲和力较大。这些结果表明突变体K89A和E42A/K89A可能具有不同的构象，因而亲和力较高。
实施例5对E42A、K89A和E42A/K89A IL-18突变蛋白的生物活性的特性分析本实施例分析了纯化的成熟IL-18/ICE/Xa在人天然杀伤细胞(实施例8所述的NKO)、在PMBCs(实施例7)中对IFN-γ的共同诱导以及在PMBCs中对IL-8的诱导。
IL-18不会在这些细胞中诱导IFN-γ，除非用IL-12(或IL-15)作为共同刺激剂。低浓度的IL-12(1-2纳克/毫升(PreproTech Rocky Hill，NJ))诱导小量IFN-γ，然而，用IL-12与IL-18一起处理则大幅提高IFN-γ的产量。按实施例9所述那样，监测细胞中产生的IFN-γ。结果发现，野生型IL-18/ICE/Xa和IL-12在NKO中诱导的IFN-γ与由ICE加工proIL-18所得的重组成熟人IL-18(Gu等人，1997)及IL-12所诱导的IFN-γ相当。这些结果表示IL-18在大肠杆菌中正确装配并通过Xa因子被正确加工。
为了测试发生突变的IL-18的活性，在NKO细胞中用突变体或野生型IL-18与IL-12一起刺激诱导产生IFN-γ，并加以评估(统计学分析参见实施例10所述)。如图3A所示，野生型IL-18作为IFN-γ的诱导剂具有活性，开始浓度为7.5纳克/毫米，逐渐增大到60纳克/毫米(最高测试浓度)。每一种IL-18突变形式在这些细胞中都显示生物活性比野生型高。例如，每个测试浓度单突变E42A的活性都是野生型的2倍。在浓度为7.5纳克/毫米时单突变K89A的活性比野生型高4倍。双突变E42A/K89的IL-18活性最高。如图3A所示，发生E42A突变的IL-18在30纳克/毫升时诱导600皮克/毫升IFN-γ，这是用60纳克/毫升野生型预处理所观察到的最大活性，而所需K89A突变体的浓度为15纳克/毫升，双突变体的浓度为7.5纳克/毫升。由此可见，突变体E42A、K89A和双突变体的活性比野生型分别高2、4和8倍。
在新鲜分离的人PBMCs中测试了IFN-γ的产生，也发现了类似的结果(实施例7)。在这些细胞中，IL-12和IL-18共同刺激的结果会产生IFN-γ，而这两种细胞因子单独一种均无法诱导IFN-γ。双突变体E42A/K89A的活性最高(图3B)。
结果显示，由Ala残基置换两种带电氨基酸Glu 42和/或Lys 89总会增加IL-18的生物活性。
IL-18在PBMC制剂的CD14+细胞中诱导IL-8已为人所知(见实施例7所述)。虽然IL-18在这些细胞内无需IL-12的共同刺激就可诱导产生IL-8，但IL-8的诱导与IFN-γ的诱导相比需要更高浓度的IL-18。所以，测试了由IL-18野生型和突变体刺激PBMCs而诱导的IL-8。采用实施例9所述的特异性分析方法监测在细胞介质内所产生的IL-8。图4显示，虽然两种单突变在IL-8的诱导方面与野生型相当，但发生双突变的IL-18诱导的IL-8比野生型多得多(3.5倍)。
结果显示，双突变体E42A/K89A的生物活性最高。
实施例6用IL-18BP中和IL-18突变体利用抑制剂IL-18BP在预料对IL-18结合起重要作用的残基上设计了突变。所以，特别评估了IL-18BP中和IL-18生物活性的能力，例如IFN-γ的产生(实施例8)。
将不同浓度的IL-18BP(中国仓鼠卵巢细胞的“a”同种型产生了重组his-6标记的人IL-18BP(由以色列Interpharm Laboratories，Ness Ziona的Kim等人提供，2000年))与野生型IL-18或其突变形式(终浓度为30纳克/毫升)一起培养，再加入到细胞培养基中。
如图4A所示，IL-18BP用于由野生型IL-18共同诱导NKO细胞中IFN-γ的50％抑制浓度约15纳克/毫升(假设IL-18BP的浓度为3.7纳克/毫升时没有发生抑制，这一数值表示为100％活性)。用IL-18BP抑制E42A单突体也得到了相似的剂量-抑制浓度。
然而，当突变体K89A与IL-18BP培养时，其作为NKO细胞中IFN-γ共同诱导剂的能力或多或少被中和了(图5A)。仅在浓度为120纳克/毫升时才发现活性有统计学意义的下降。与此相反，IL-18BP不能中和双突变体E42A/K89A。
如图4B所示，当在PBMCs而非NKO细胞内测试时，IL-18更易被IL-18BP中和。IL-18BP中和野生型IL-18所需的量是3.7纳克/毫升，这是最低测试浓度。由IL-18BP在PBMCs中和其生物活性的浓度低这一观察结果可以确定，单突变E42A的行为与野生型相似。与之相比，单突变K89A的中和浓度是120纳克/毫升。与IL-18BP在NKO细胞内中和IL-18突变体的结果相似，双突变体E42A/K89A在PBMCs内仅受IL-18BP轻微影响。
结果显示，突变体E89A和双突变体E42A/K89A受天然抑制剂IL-18BP的影响很少。
实施例7外周血单核细胞(PBMCs)的分离和培养以及IFN-γ的诱导从血管清洗健康人体血小板分离术的剩余白细胞，并用Histopaque离心。从界面抽取PBMCs，在不含热原的盐水(Baxter Health Care，Mundelein，IL)中洗三次，按每毫升5×106细胞重悬于加入10％FBS的RPMI 1640培养基(GIBCO/BRLGrand Island，NY)中。在1纳克/毫升IL-12存在下，改变重组人IL-18和野生型IL-18(ICF/Xa)或三种突变体的浓度，使这些细胞仅与RPMI 1640培养基(对照)在平底96孔板(Becton Dickinson)内培养。在一些实验中，将IL-18制剂加入到这些细胞之前先与多黏菌素B(1微克/毫升，购自Sigma)混合。细胞在37℃、含有5％二氧化碳的潮湿空气条件下培养16-20小时，然后收集培养基上清液以测定IFN-γ。
实施例8NKO细系中IFN-γ的诱导从Hans Klingerman(Gong等人，1994)取得原亲代NK92细胞系。本研究采用的人NKO细胞系是该细胞系的亚克隆。将NKO细胞保持在含10％FBS、50皮克/毫升IL-12(R&D Systems)和200皮克/毫升IL-15(PeproTech)的补加RPMI 1640培养基中。为了进行分析，将NKO细胞按每毫升0.5×106细胞悬于RPMI 1640培养基中，取0.2毫升在96孔板内用0.5纳克/毫升IL-12(PreproTech Rocky Hill，NJ)和不同浓度的重组人IL-18野生型、IL-18(ICE/Xa)或E42A、K89A和E42A/K89A突变体刺激。在37℃、含有5％二氧化碳的潮湿空气条件下培养16-20小时后，收集培养基上清液以测定IFN-γ。
实施例9细胞因子的分析采用液相电化学发光法(ELC)来测定细胞培养基的IFN-γ(13)和IL-8(12)。借助Origen分析仪(Igen，Gaithersburg，MD)测定电化学发光量。IFN-γ和IL-8的检测极限分别是62皮克/毫升和40皮克/毫升。
实施例10统计学分析数据以平均值±SEM表示。通过方差分析(ANOVA)比较组均值(group means)。在95％置信区间内为可接受的统计学意义。用统计软件包STATVIEW 512+(BrainPower，Calabasas，CA)进行ANOVA和相关性分析。
实施例11中国仓鼠卵巢细胞中成熟IL-18突变体的产生为了在中国仓鼠卵巢细胞中表达和分泌成熟IL-18突变体，通过类似实施例1所述反应的两次PCR反应将编码野生型和突变体IL-18BP的成熟蛋白的DNA序列与人生长激素信号肽的DNA序列连接。第一次PCR反应扩增各种IL-18突变体，所用模板是实施例2的相应构造体，有义引物(Pr9)含有IL-18和人生长激素信号肽的重叠序列，反向引物(Pr10)编码IL-18的最后12个核苷酸、一个终止密码子和一个限制酶位点。扩增生长激素信号肽的模板采用质粒pXGH，有义引物(Pr11)含有一个限制酶位点和人生长激素信号肽最先12个核苷酸，反向引物(Pr12)含有人生长激素信号肽和IL-18成熟蛋白的重叠序列。进行第二次PCR是为了扩增编码与IL-18成熟序列融合的人生长激素信号肽的片段，所用模板为第一次PCR反应的纯化扩增片段，引物为含有限制位点的Pr10和Pr11。提纯融合片段，用合适的限制酶消化，并克隆到哺乳动物表达载体。
用质粒转移中国仓鼠卵巢(DHFR-)细胞，用含有小鼠DHFR基因的质粒作为基因标记。在选择性培养基中分离抗性细胞，并用ELISA试验分析IL-18的产生。
逐渐增大MTX的浓度，使稳定转染的细胞进行多循环基因扩增。在基因扩增过程结束时用限制稀释法(limiting dilution)分离克隆。经过亚克隆后，选择具有高特异性产率和生产更为稳定的克隆来进行生产。
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以上及说明书全文所引用的文献均纳入其整体内容作为参考。
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<211>157<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>3<211>193<212>PRT<213>人工序列<220>
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<223>合成PRT序列<400>7Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>8<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>8Tyr Phe Gly Lys Leu Ala Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15
Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Ala Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>9<211>193<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>9Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met1 5 10 15Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn20 25 30Ile Glu Gly Arg Tyr Phe Gly Lys Leu Lys Ser Lys Leu Ser Val Ile
35 40 45Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro50 55 60Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg65 70 75 80Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met85 90 95Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys100 105 110Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile115 120 125Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly130 135 140His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe145 150 155 160Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys165 170 175Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu180 185 190Asp<210>10<211>157<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成PRT序列<400>10Tyr Phe Gly Lys Leu Lys Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1 5 10 15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
20 25 30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile35 40 45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile50 55 60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65 70 75 80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys85 90 95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys100 105 110Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu115 120 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu130 135 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145 150 155<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>11atatgaattc atggctgctg aaccagtag 29<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列
<400>12aaagtaacgt ccttcgatgt tttc24<210>13<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>13gaaaacatcg aaggacgtta cttt 24<210>14<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>14atatggatcc tagtcttcgt tttgaacagt g 31<210>15<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>15taatttagat gcaagcttgc c 21<210>16<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列
<400>16ggcaagcttg catctaaatt a 21<210>17<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>17ctggctatct gcatacatac t 21<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成DNA序列<400>18agtatgtatg cagatagcca g 2权利要求
1.一种IL-18突变体多肽，其特征在于，所述多肽包括一个或多个与IL-18结合蛋白相互作用的氨基酸残基上的突变。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述突变是取代、插入或缺失。
3.如权利要求2所述的多肽，其特征在于，所述取代是非保守性取代。
4.如权利要求1、2或3中任一项所述的多肽，其特征在于，所述突变在一选自由Glu-42、Ile-85、Met-87、Lys-89、Met-96、Asp-130、Lys-132、Pro-143、Met-149和Leu-189组成的组的残基上。
5.如权利要求4所述的多肽，其特征在于，所述突变在一选自由Glu-42和Lys-89组成的组的残基上。
6.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述突变在Glu-42残基上。
7.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述突变在Lys-89残基上。
8.如权利要求5所述的多肽，其特征在于，所述突变在Glu-42残基和Lys-89残基上。
9.如权利要求6所述的多肽，其特征在于，Glu-42残基由非极性氨基酸所取代。
10.如权利要求9所述的多肽，其特征在于，Glu-42残基由Ala残基所取代。
11.如权利要求7所述的多肽，其特征在于，Lys-89残基由非极性氨基酸所取代。
12.如权利要求11所述的多肽，其特征在于，Lys-89残基由Ala残基所取代。
13.如权利要求8所述的多肽，其特征在于，Glu-42残基和Lys-89残基两者都由非极性氨基酸所取代。
14.如权利要求13所述的多肽，其特征在于，Glu-42残基和Lys-89残基两者都由Ala残基所取代。
15.一种编码如权利要求1-14中任何一项所述多肽的分离DNA。
16.如权利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有SEQ ID NO3的氨基酸序列。
17.如权利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有编码SEQ ID NO4的多肽的氨基酸序列。
18.如权利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有编码SEQ ID NO5的多肽的氨基酸序列。
19.如权利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有编码SEQ ID NO6的多肽的氨基酸序列。
20.如权利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有编码SEQ ID NO7的多肽的氨基酸序列。
21.如权利要求15所述的DNA，其特征在于，所述多肽具有编码SEQ ID NO8的多肽的氨基酸序列。
22.一种如权利要求15、19、20和21中任何一项所述的DNA，其特征在于，所述DNA还包括编码信号肽的核酸序列。
23.如权利要求22所述的DNA，其特征在于，所述信号肽是人生长激素信号肽。
24.一种包括如权利要求15至23中任何一项所述的DNA的载体，其特征在于，所述载体能够在适当宿主细胞中表达由所述DNA编码的多肽。
25.如权利要求24所述的载体，其特征在于，所述宿主细胞是原核生物细胞。
26.如权利要求25所述的载体，其特征在于，所述DNA编码一选自由SEQ ID NO3、SEQ ID NO4和SEQ ID NO5组成的组的多肽。
27.如权利要求24所述的载体，其特征在于，所述宿主细胞是真核生物细胞。
28.如权利要求27所述的载体，其特征在于，所述DNA编码一选自由SEQ ID NO6、SEQ ID NO7和SEQ ID NO8组成的组的多肽。
29.如权利要求27所述的载体，其特征在于，所述载体包括如权利要求22或23所述的DNA。
30.如权利要求28所述的载体，其特征在于，所述DNA与编码人生长激素信号肽的序列连接。
31.一种用于治疗通过Th1反应可被预防或减缓的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1至14中任何一项所述的多肽和一药学上可接受的载体。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗癌症。
33.如权利要求31所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物用于治疗病毒性疾病。
全文摘要
本发明提供了一些IL－18突变体，其对IL－18BP的亲和力比野生型IL－18分子低。
文档编号A61P31/12GK1764723SQ02809803
公开日2006年4月26日 申请日期2002年3月8日 优先权日2001年3月8日
发明者C·迪纳洛, S·H·金 申请人:阿雷斯贸易股份有限公司