专利名称：作为d-丙氨酰-d-丙氨酸连接酶抑制剂的稠合嘧啶的制作方法
技术领域：
本发明涉及杂环化合物及其应用，例如在预防和/或治疗细菌感染中的应用，以及其作为例如防腐剂、灭菌剂或消毒剂的应用。
背景技术：
微生物在个体上引起不利作用所通过的致病过程一般很复杂，并且需要涉及多个微生物成分的确定的事件顺序。如果保持不受控制，则生物体增殖可损害个体，导致慢性感染或甚至是死亡。经常需要用外源因素例如抗生素来支持宿主的防御机制，以帮助将感染性生物体从个体中清除出去。
随着时间的延长，并且部分是由于不适当地使用现有抗生素治疗方案，生物体对各种可采用的外源因素产生的抗性逐渐变强。例如，细菌对氟喹诺酮类和β-内酰胺类药物的抗药性已有报道，并且极其有可能在下一个十年后加重。在世界范围内，关于公众获得性肺炎对氟喹诺酮类药物的抗药性的报道越来越多。此外，由于存在R-TEM酶，大肠杆菌(E.coli)菌株对β-内酰胺类药物(例如阿莫西林)、复方新诺明和甲氧苄啶的敏感性显著下降。这些报道以示例说明了发现和开发出新抗微生物治疗剂来提供另外和更有效的抵抗其中抗药性不断增强的微生物的治疗方案是必要和持续需要的。
发明概述
本发明涉及杂环化合物，包含所述化合物的组合物，和使用所述化合物和组合物的方法。本发明化合物和包含它们的组合物可用于治疗疾病或疾病症状。本发明还提供了制备所述化合物以及鉴定具有所需生物活性的化合物的方法。
本发明是基于下述发现一些杂环化合物具有强的抗菌活性，更具体来说，具有抗酶D-丙氨酰-D-丙氨酸连接酶(“D-Ala-D-Ala连接酶”；E.C.6.3.2.4)的活性。如下面的图表所示，据信D-Ala-D-Ala连接酶通过催化D-丙氨酰-D-丙氨酸(“D-Ala-D-Ala”)—用于对于细菌细胞壁生物合成来说是必不可少的肽聚糖交联的一个构建单元—的装配而在细菌细胞生长中起关键作用。据信，该酶建立在肽聚糖结构交联时肽键最终提供酰基转移位点的肽键(Ellsworth等人，Chemistry & Biology，337-44，1996)。虽然不想让本发明新化合物的作用机制受敷于任何理论，但是据信，本发明新化合物与D-Ala-D-Ala连接酶的三磷酸腺苷-(ATP-)结合位点结合，而不与D-Ala-结合位点结合，使得化合物与ATP竞争。因此，在这方面，本发明化合物与其它D-Ala-D-Ala连接酶抑制剂例如环丝氨酸和二肽膦酸酯类似物不同，它们对于D-丙氨酸是竞争性抑制剂，并且据信与该酶的D-丙氨酸-结合位点结合。
本发明一般涉及下面通式所示化合物及其应用
特别是，在一个实施方案中，本发明涉及具有下式的化合物
其中A和B可独立地为N或CR7，其中R7是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团(例如氢、或取代或未取代的、直链、支链或环状的烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基或烷芳基，或其中一个或多个碳和/或氢原子被杂原子替代的一个或多个这些基团的衍生物(例如氨基、烷基氨基、羟基和烷氧基、巯基、卤素、硝基、酚基、或其它取代的芳族或脂族基团))。R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6可独立地为氢或含有碳的官能团。
R3是氢或烷基、氨基、羟基、烷氧基或烷基氨基。R4是含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团，条件是
(1)如果A和B都是氮，并且R5和R6都是氢，则R4不是-NH2、-N(H)(甲基)、-N(H)(丁基)、-N(H)(己基)、-N(H)(苯基)、-N(H)(苄基)、-N(H)(NH2)、-N(H)(CH2CH2OH)、-N(CH2CH2OH)2、苯基、N-哌啶基或-S(乙基)；
(2)如果A是CH，B是氮，并且R5和R6都是氢，则R4不是甲基、异丁基、苯基、4-甲基苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-(2，5-二甲氧基苯基)乙基或-CH(OCH3)2；和
(3)如果A和B都是CH基，则R4是不同于-NH2、(3，4-二氯苯基)甲基氨基或(3，4-二氯苯基)亚甲基亚氨基的氨基。
在某些实例中，R5和R6都是氢。
R4可以是例如取代或未取代的、直链、支链或环状烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基或烷芳基。在某些实例中，R4包括至少一个芳基。例如，R4可以是其中一个下列基团
或
其中R8-12可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团(例如直链或支链烷基)。
在其中R4包括芳基的另一个实例中，化合物具有下述结构
其中R8-16可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。例如，R9可以是氢或甲基。在某些实例中，化合物具有下述结构
其中n是1、2、3或4；且R17是-NR18R19，其中R18和R19可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。在某些实例中，例如，R17可以是其中一个下列部分
其中R8可以另外是例如-(CH2)nNR18R19，其中n是1、2、3或4；并且R18和R19可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
或者，R4可以是-CH2O-芳基、-CH2S-芳基、-CH＝CH-芳基或-NH(CH2-芳基)，其中所述芳基可以是任何芳族基团，无论其仅包含碳和氢(例如苯基、萘基、甲苯甲酰基)还是也包含其它原子(例如吡咯基、吡啶基、噁唑基、氯苯基、溴萘基)。
或者，R4可以是-N(CH3)R21、-N(CH2CH3)R22、-N(CH(CH3)2)R21、-N(苄基)R21、-CH2NH2、-NHCH2CH2NR22R23或-CH2NHC(＝O)R22，其中R22-23可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。在具体实例中，R22是氢，且R23是-C(＝O)R24，其中R24是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
在其它实例中，R4可以是这样的，使化合物具有下述结构
其中R20是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
在其它实例中，R4可以是这样的，使化合物具有下述结构
其中R25和R26可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。例如，R25可以是氢、烷基、羟基烷基或芳烷基，且R26可以是卤代烷基、羟基、C(＝O)NR27R28、C(＝O)OR27或NR27R28，其中R27和R28可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。或者，R26可以是-C(H)(芳基)(R29)，其中R29是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。在某些实例中，R29包括至少一个酰基(例如羧酸酯、酮、醛、酯、酰胺或硫酯基团)。在这些或其它实例中，芳基可以是萘基或苯并噻吩基。R29可包括α-羟基羧酸酯基(例如α-C(R)(OH)(COOR’)基团，其中R和R’可以是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团)。
在另一个实施方案中，本发明涉及具有下式的化合物
其中R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6可独立地为氢或含有碳的官能团，且R4是不同于-NH2或
的氨基。
在另一个实施方案中，本发明涉及抑制D-丙氨酰-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)连接酶的方法。该方法包括将D-Ala-D-Ala连接酶暴露于式I或式II化合物的步骤
其中A和B可独立地为N或CR7，其中R7是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6可独立地为氢或含有碳的官能团；R3和R4可独立地为氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；条件是R3和R4不都是氢。
例如，R1和R2可以都是-NH2-。
在某些实例中，R3和R4可独立地为支链或直链烷基、-O-烷基、-O-烷基-COOH、-O-烷基-NR7R8、-O-烷基-OH、-NR7R8、-NR7-烷基-NR8R9、-NR7-烷基-COOH、-NR7-烷基-OH；-CONR7R8、-CONR7-烷基-NR8R9、-CONR7-烷基-COOH、-CONR7-烷基-OH、-S-烷基、-S-烷基-COOH、-S-烷基-NR7R8、-S-烷基-OH、-O-芳基、-O-芳基-COOH、-O-芳基-NR7R8、-O-芳基-OH、-S-芳基、-S-芳基-COOH、-S-芳基-NR7R8、-S-芳基-OH、-NR7-芳基-NR8R9、-NR7-芳基-COOH、-NR7-芳基-OH；-CONR7-芳基-NR8R9、-CONR7-芳基-COOH、-CONR7-芳基-OH或-CH2NR5C6H4COOH；条件是R3和R4不能同时为相同的支链或直链烷基；R1和R2可独立地为氢、-NH2或NR11R12，其中R1和R2当中至少有一个是-NH2；R5可以是低级烷基(即C1-6烷基)、氢或-CH2NR10C6H4CONHR6；其中R6是-烷基、-烷基-COOH、-烷基-NH2或-烷基-OH；R7、R8、R9、R10、R11和R12可独立地为直链烷基、支链烷基、芳基或酰基，所述基团可任选被一个或多个基于氧、氮、硫或卤素的官能团取代，且A可以是N和CH。
被抑制的D-Ala-D-Ala连接酶可例如包括这样的序列，其与选自例如下列物种来源的D-Ala-D-Ala连接酶的序列有至少90％的同源性大肠杆菌、肺炎衣原体(Chlamydophila pneumoniae)、砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)、流感嗜血菌(Haemophilus influerazae)、杜氏嗜血菌(Haemophilus ducreyi)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、柯养木杆菌(Xylella fastidiosa)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、氧化亚铁硫杆菌(Thiobacillus ferrooxidans)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)、蚜虫巴克纳氏菌(Buchnera aphidicola)、Bacillus halodurans、Geobacter sulfurreducens、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)、Aquifex aeolicus thermophile、海栖热袍菌(Thermotogamaritima)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、丰加链霉菌(Streptomyces toyocaensis)、东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)、鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、小肠肠球菌(Enterococcus hirae)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)、集胞蓝细菌属(Synechocystis sp.)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、侵肺军团菌(Legionella pneumophila)、肠膜明串菌株(Leuconostocmesenteroides)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)。
在另一个实施方案中，本发明涉及治疗患者的方法。本发明方法包括将有效量的式I或II化合物施用给患者的步骤
其中A、B和R1-4如上所定义。
本发明涉及包含任何上述化合物和适于对个体给药的赋形剂的制剂。
本发明还涉及治疗患有细菌微生物感染的个体的方法。该方法包括给个体施用有效量的如上所述的制剂。个体可以是例如动物如哺乳动物(例如人、马、羔羊、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠、母牛、公牛、猪)、鸟(例如小鸡、鹅、火鸡、鸭子、家禽)、鱼(例如大麻哈鱼、鲑鱼、鲶鱼、金鱼)或其它农用、宠物或观赏动物。
在另一个实施方案中，本发明还涉及治疗患者的方法。该方法包括给患者施用有效量的上述任一化合物和任选合适的载体的步骤。
在另一个实施方案中，本发明涉及在非生活系统中抑制细菌生长的方法(例如在体外灭菌、消毒、杀死细菌)。该方法包括将该系统(例如培养基、医药装置、厨房或浴室表面、剧院)与有效量的任何上述化合物接触以抑制细菌生长。
可使用几个参数来选择用于该新方法的化合物。参数包括但不限于体外抗菌效力和活性谱；物化性质例如亲脂性和溶解度。本发明化合物的药动学性质及其体外抗菌活性表明本发明化合物可用于预防和治疗患有细菌感染的个体和用作防腐剂、灭菌剂或消毒剂。
使用“卤素”是指任何氟、氯、溴或碘。
术语“烷基”、“链烯基”和“炔基”是指烃链，其可以是直链或支链，并含有指定数目(如果指定的话)的碳原子。例如，“C1-10”或“C1-C10”是指可具有1-10个(包括1和10个)碳原子，或者可以是环状(例如包含一个或多个环)的基团。术语“环”和“环系”是指包含所述数目原子的环，所述原子是碳原子，或当指明时，杂原子例如氮、氧或硫原子(例如包括杂环基)。环自身及其上面的任何取代基可在容许形成稳定化合物的任何原子上连接。
术语“芳基”是指具有6个碳的单环或具有10个碳的二环芳环系，其中每个环中有0、1、2或3个原子可以被取代基取代。芳基的实例包括苯基、萘基等，以及杂芳基。
术语“杂芳基”是指芳族5-8元单环、8-12元二环或11-14元三环环系，其中如果是单环，则包含1-3个杂原子，如果是二环，则包含1-6个杂原子，如果是三环，则包含1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S，其中每个环中有0、1、2或3个原子可以被取代基取代。杂芳基的实例包括吡啶基、呋喃基、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、噻吩基、喹啉基、吲哚基、噻唑基等。
术语“杂环基”是指非芳族5-8元单环、8-12元二环或11-14元三环环系，其中如果是单环，则包含1-3个杂原子，如果是二环，则包含1-6个杂原子，如果是三环，则包含1-9个杂原子，所述杂原子选自O、N或S，其中每个环中有0、1、2或3个原子可以被取代基取代。杂环基的实例包括哌嗪基、吡咯烷基、二氧杂环己烷、吗啉基、四氢呋喃基等。
本发明所能包括的取代基和变量的组合仅是导致形成稳定化合物的那些。本文所用术语“稳定的”是指这样的化合物，其具有足以容许生产的稳定性，并且在可用于本文所述目的(例如治疗或预防性地施用给患者或防腐、料浸渗、灭菌或消毒应用)的充分时间内保持化合物的完整性。
除非另有说明，否则本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域技术人员通常所理解的含义。虽然类似于或等同于本文所述方法和物质的方法和物质可用于实施或测试本发明，但是下文描述合适的方法和物质。在矛盾时，包括定义的本说明书起控制作用。此外，这些物质、方法和实施例仅是举例说明，而不是限制性的。
本发明可提供优于现有治疗方法的几个优点。例如，本发明化合物可以以高特异性与D-Ala-D-Ala连接酶的ATP-结合位点结合，并且在生化测定中表现出与ATP的竞争。某些本发明中描述的化合物在一定位置具有其蛋白-相互作用官能团，以能够还与一个或两个D-Ala-D-Ala连接酶的D-丙氨酸结合位点结合。这些类型的新化合物(双底物类似物)可具有进一步增强的选择性以及与将ATP位点和D-Ala位点桥连的能力直接相关的效力。
某些本发明化合物还可以具有小于多种现有抗生素的毒性。这些新化合物与D-Ala-D-Ala连接酶—在细菌中发现但是在人或其它真核细胞中没有发现的一种酶—特异性结合，因此这些化合物化合物一般不与患者中的生物系统相互作用。因为肽聚糖仅在细菌中存在，在哺乳动物细胞中不存在，所以特异性地抑制D-Ala-D-Ala连接酶可导致高度选择性的抗菌活性。
此外，某些本发明化合物可具有优于在治疗细菌感染中使用的现有化合物的化学和药理学优点。这些优点可包括化学稳定性和药理学稳定性，以及效力、不同的抗性特征以及降低的副作用。本发明新化合物与细菌细胞膜交联的活性和能力也使得它们适于用作抗生素药物。本发明还涉及用于在鱼类、家禽、牲畜、其它食用动物、运动会动物和陪伴动物中治疗感染的兽医应用。
本发明化合物具有表现出的抗包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、流感嗜血菌等在内的代表性微生物的强大广泛的谱活性。从51种代表性，但进化不同的所有细菌的微生物代表的D-Ala-D-Ala连接酶的接近的序列同源性中也可以推知谱活性。尽管如此，具体化合物仍具有抗特定细菌的较大活性，这给开发选择性且特异性的窄谱活性剂提供了机会。
通过阅读下面的详细描述和权利要求书，本发明的其它特征和优点将变得显而易见。
发明详述
本发明涉及本文中举例说明的特定化合物。因此，本发明的一个实施方案是本文中具体描述的任何化合物，包括下面列出的化合物
其中结构I或II的A和B独立地为-N-、-CH-或-CR-。R1、R2、R3、R4和R7独立选择。
本发明化合物可用常规技术合成。有利的是，这些化合物可由易于获得的原料容易地合成。一般情况下，本文所描述的结构式所示化合物可通过在合成方案和实施例中举例说明的方法方便地获得。
因此，一个实施方案涉及制备本文所描述的结构式所示化合物的方法，包括合成在本文的合成方案中举例说明的一种或多种中间体，然后将中间体转化成本文所描述的结构式所示化合物。另一个实施方案涉及制备本文所描述的结构式所示化合物的方法，包括合成在本文的实施例中举例说明的一种或多种中间体，然后将中间体转化成本文所描述的结构式所示化合物。另一个实施方案涉及制备本文所描述的结构式所示化合物的方法，包括合成在本文的合成方案中举例说明的一种或多种中间体，然后使用一种或多种在本文的合成方案或实施例中描述的化学反应将中间体转化成本文所描述的结构式所示化合物。亲核试剂是本领域已知的，并且描述在本文所参考的化学教科书以及论文中。用于上述方法的化学物质可包括例如溶剂、试剂、催化剂、保护基和脱保护基试剂等。上述方法还可以在本文具体描述的步骤之前或之后包括另外的步骤，以加入或除去合适的保护基，从而最终合成本文所描述的结构式所示化合物
本领域技术人员可以理解，本文中的合成方案没有全面地列出可合成本申请中描述且要求保护的化合物的所有方法。此外，上述各种合成步骤可以以另外的次序或顺序进行，以给出所需化合物。用于合成本文所述化合物的合成化学转化和保护基方法(保护和脱保护)是本领域已知的，并包括例如在下列文献中描述的那些R.Larock，ComprehensiveOrganic Transformations，VCH Publishers(1989)；T.W.Greene和P.G.M.Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，2d.Ed.，John Wiley和Sons(1991)；L.Fieser和M.Fieser，Fieser and Fieser’s Reagents forOrganic Synthesis，John Wiley和Sons(1994)；M.B.Smith和J.March，March’s Advanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，andStructure，5th Ed.，Wiley Interscience(2001)；和L.Paquette，ed.，Encyclopedia of reagents for Organic Synthesis，John Wiley and Sons(1995)及其以后的版本。
在一个典型方法中，可针对多种不同细菌菌株筛选具有抗菌活性的化合物。化验化合物抗几种菌株的效力和活性谱宽度以鉴定出有潜力的先导化合物。可筛选具有细菌抑制活性(即阻止细菌生长)和/或杀菌活性(即杀死细菌)的化合物。可通过例如改变取代基来产生衍生化合物来优化先导化合物。衍生物可每次制备一种，或者可用平行或组合合成方法来制备衍生物。在任一种情况下，可测定衍生物以产生结构-活性关系(SAR)数据，其可用于进一步优化先导化合物。
设计合成和生化评价连接酶抑制剂
可用多种方法来设计类似物，包括传统的药物化学、系统模拟(例如系统测试具有不同烷基链长度、电子等排官能团、各种芳族取代基的类似物)、使用X-射线晶体结构分析的残基靶向法、分子模型和计算机活性位点停靠(docking)实验、计算多样性分析和使用得自生化实验的结果的反复反馈。类似物由本领域技术人员使用以前在文献中描述的多种合成方法合成。然后使用本文所述的生化方法分析所提供的类似物以生成效力数据。在下文描述某些类似物的不同样本。
我们已经鉴定了具有强的连接酶抑制活性的在喹唑啉、喋啶、吡啶并嘧啶和嘧啶并嘧啶的6和7位上的多种不同取代基。下表1显示了能够抑制连接酶的在6和7位上的多种取代基(化合物中完成氮、氧和碳原子的化合价所必需的氢原子没有显示，但是本领域技术人员应当理解)。
表1
使用低级烷基的N7-取代
可制备多种不同的N7-氮类似物(下表2中的R1)来提高效力。甲基、乙基、烯丙基和环丙基甲基是所鉴定的最有效的低级烷基和环烷基取代基。α-位的取代基(在表2中的R2)是容许的，在某些情况下，CH3和C2H5显著提高了活性。如果在R2位的其它取代基也将提高连接酶抑制效力，这不应当感到惊奇。使用-H、-CH3或-卤素在4-位取代萘基环提高了效力。发现用多种不同的杂环(例如苯并噻吩)代替萘基环产生了具有强的体外酶活性的类似物。在该系列类似物中，R-α-甲基立体异构体的效力显著高于外消旋体。S-α-甲基立体构型提供了具有较宽连接酶效力谱的类似物，代价是抗大肠杆菌连接酶的高内在活性。
表2
N-R1 R2 R2手性R3大肠杆菌连接酶 葡萄球菌连接酶
(μM) (μM)
-CH3 CH3R/S H 0.7189.28
-CH3 C2H5 R/S H 0.4524.60
-CH3 CH3R H 0.32626.80
-CH3 CH3R/S CH30.27712.25
-CH3 CH3R/S 4，5-丁烯 0.24012.00
-CH3 CH3R/S Cl 0.2014.90
CH3CH3R F 0.10427.00
-CH2CH3CH3R/S F 0.25719.00
-CH2CH3CH3R/S CH30.21038.50
-CH2CH3CH3R CH30.10271.00
-CH2CH＝CH2CH3R/S H 0.25830.50
-CH2CH(CH2)2 CH3R/S H 0.34517.00
-CH2CH(CH2)2 CH3R/S Br 0.27925.00
-CH2CH(CH2)2 CH3R/S CH30.21137.00
-CH2CH(CH2)2 CH3R/S Cl 0.17929.00
-CH2CH(CH2)2 CH3R CH30.17462.00
β-丙氨酸酰胺类似物
使用β-丙氨酸连接物合成的酰胺具有广谱活性。从该系列化合物中鉴定出的最有效的广谱抑制剂是乙二胺酰胺衍生物(即下表3中的第一个化合物)，其对大肠杆菌和流感嗜血菌连接酶的Ki小于1微摩尔；对金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌连接酶的活性是一位数微摩尔(见表3)。间-氨基甲基苄基胺类似物(即表3中的第三个化合物)抗该组试验的4种连接酶中的3种的Ki小于1μM。以类似方式，表3中的最后一个化合物能有效地抗3种连接酶。其中伯胺被脒取代的表3中的第四种化合物表现出类似于第一种化合物的活性。
表3
羧酸和α-羟基羧酸
表4中的第一种化合物是作为至少两种立体异构体的HPLC纯化的混合物提供的。该化合物的蛋白-配体晶体结构分析表明有两种立体异构体，经确定其立体化学是(2-R，1’-S)和(2-S，1’-R)。数字2是指α-羟基的位置，数字1’是指α-甲基的位置。这两种所观测的异构体是对映体，即它们是镜像。经测定，表4中最后一种化合物的大肠杆菌连接酶效力是143nM。该化合物具有抗流感嗜血菌(566nM)、葡萄球菌(4.1μM)和链球菌(2.6μM)的较宽活性谱。
表4
N7-伯丁基胺SAR
在该系列化合物中，经鉴定在N7-氮上具有丁基胺链的化合物(即表5中的第三种化合物)具有最大体外效力。α-甲基萘基手性中心可用非手性的2-乙氧基萘基取代基代替(见表5中的第四种化合物)，并且仍然保持强的连接酶活性。该非手性分子具有较宽的连接酶活性谱，并且经测定其抗大肠杆菌连接酶的Ki为102nM。
表5
另外的类似物
丁基链修饰
用于制备类似物的一般合成方法
合成嘧啶并嘧啶
本发明的嘧啶并嘧啶化合物可使用多种不同的合成方法制得。嘧啶并嘧啶环系可在多步反应方案中，由适当取代的脒(R7-C＝NHNH2)和R5-取代的烷氧基亚甲基丙二腈作为原料制得。可将所得氰基氨基嘧啶与胍缩合，以形成嘧啶并嘧啶环系。当氰基氨基嘧啶中的R7是-Cl、-Br、-S-低级烷基时，可用取代的氮或氧亲核试剂取代这些离去基团，以提供R7-N(或O)-取代的烷基或芳基中间体。可将这些中间体环合成在7-位被适当取代的其相应的嘧啶并嘧啶。
合成7-氨基取代的嘧啶并嘧啶的另一种方法是对6-氨基-2-溴嘧啶-5-腈上的胺进行亲核攻击(氯或硫甲基或硫乙基也可用作2-位的离去基团)，然后用胍将所得适当取代的氰基氨基嘧啶环合。
如果攻击性的适当取代的亲核性胺不能商购获得，则其可以用标准有机化学方法制备。用于制备本发明化合物的一种这样的标准方法是还原胺化。
在该众所周知的方法中，在弱还原剂例如氰基硼氢化钠或氰基硼氢化锌存在下，用适当取代的胺将醛或酮缩合。
β-丙氨酸酰胺和α-羟基-β-丙氨酸酰胺
酰胺可通过将其相应的羧酸与各种伯胺和仲胺反应来合成。加入在文献中描述的多种试剂可用于促进酰胺偶联过程。这些试剂包括羰基二咪唑(CDI)、二环己基碳二亚胺(DCC)、HBTU、二乙基磷酸氰化物(diethylphosphorocyanidate)和BroP。
丁基胺类似物
丁基胺类似物用多步骤合成途径合成。一般情况下，将单-boc保护的丁二胺在还原胺化条件下反应以生成适当取代的单-boc-保护的萘基甲基胺。将仲胺与6-氨基-5-氰基-2-卤代嘧啶反应，用胍将所得中间体环合，然后在酸性条件下裂解掉boc，以提供脱保护的丁二胺类似物。
直接的杂环取代方法
本发明化合物可由芳族亲核置换在2，4-二氨基嘧啶并嘧啶的7-位上的离去基团来制得。离去基团[LG]包括但不限于-Cl、-Br、-SCH3、-SC2H5和-N(CH3)3。用于该置换反应的亲核试剂可以是-N-烷基、-N-芳基或取代的烷基或芳基胺，或-O-烷基、-O-芳基或取代的醇或酚。
合成喋呤类似物
6-或7-取代的喋呤类似物一般可通过将活化的试剂例如6-或7-氯甲基喋呤与亲核试剂例如胺反应来制得，并且通过文献中描述的多种其它方法，在喋呤6-和7-位的其它官能团例如溴甲基、碘甲基、羟基甲基、活化的羟基甲基、羰基、活化的羰基、羟基、氯、溴或甲基可用作制备6-或7-取代的类似物的合成试剂。
上述一般反应方法可用于合成很多种7-取代的喋啶类似物。在一般方法中，将7-氯甲基与合适的胺在适当溶剂例如DMF或2-甲氧基乙醇中反应所需时间，并通过HPLC、TLC或NMR分析该反应混合物。然后除去溶剂，并通过合适的方法纯化产物，通常用碱将盐形式的产物沉淀、重结晶或再沉淀出来，或通过色谱法纯化。
制剂、盐形式和前药
包括本文所描述的结构式所示化合物在内的如本文所用的本发明化合物被定义为包括其可药用衍生物或前药。“可药用衍生物或前药”是指在施用给接受者后能够提供(直接或间接)本发明化合物的本发明化合物的任何可药用盐、酯、酯的盐或其它衍生物。特别合适的衍生物和前药是这样的，当把这样的化合物施用给哺乳动物时，其能提高本发明化合物的生物利用度(例如使得口服给药的化合物能更容易吸收到血液中)，或者与母化合物相比，能提高母化合物递送到生物隔室(例如脑或淋巴系统)中的能力。优选的前药包括其中本文所描述的结构式所示结构上挂接有提高水溶解度或经由肠膜活性运输力的基团的衍生物。特别是，可制备能促进含有游离羧酸的类似物的吸收和细胞膜穿透力的酯类前药的经典实例。
可通过连接上用于增强选择性生物性质的适当官能团来修饰本发明化合物。这样的修饰是本领域已知的，并且包括能提高向生物隔室(例如血液、淋巴系统、中枢神经系统)内的生物穿透、提高口服利用度、提高溶解度以容许注射给药、改变代谢和改变排泄速度的修饰。
本发明化合物的可药用盐包括衍生自可药用无机和有机酸和碱的那些。合适的酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一烷酸盐。其它酸，例如草酸，虽然自身不是可药用的，但是可用于制备在获得本发明化合物及其可药用酸加成盐过程中用作中间体的盐。
衍生自合适的碱的盐包括碱金属(例如钠)、碱土金属(例如镁)、铵和N(烷基)4+盐。本发明还包括本文所公开的任何化合物的碱性含氮基团的季铵化形式。通过这样的季铵化可获得水或油可溶性或可分散的产物。
抑制D-Ala-D-Ala连接酶的测定
D-Ala-D-Ala连接酶抑制的测定可使用在实施例2中描述的丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH)测定以及如文献所述(例如Sarthy等人，Anal.Biochem.，254288-290，1997)来进行。在细菌细胞壁合成过程中，连接酶催化三磷酸腺苷(ATP)转化成二磷酸腺苷(ADP)，同时发生两个D-丙氨酸残基的结合，以形成D-丙氨酰-D-丙氨酸。之后PK将由此生成的ADP再生成ATP，同时磷酸丙酮酸转化成丙酮酸。LDH通过将NADH转化成NAD+而催化丙酮酸还原成乳酸。通过监测NAD+的生成速度(例如使用UV/Vis光谱法)，可确定D-Ala-D-Ala连接酶活性。
可如实施例3所述筛选以％抑制表示的化合物。
可如实施例4所述获得抑制常数Ki和作用方式。
已经使用标准生化技术在多种不同种类细菌中测定了酶D-ala-D-ala连接酶的蛋白序列(见表5)。可使用标准分子生物学技术在合适的宿主微生物例如大肠杆菌中过量表达得自任何种类细菌的蛋白序列。可收获连接酶，纯化，并用于上述测定中来确定抑制活性。
抗菌活性的体外测定
可使用标准方法来筛选化合物的抗菌活性。
在如下面的实施例5所示的一个实例中，使用肉汤微稀释技术来测定化合物抗给定细菌培养物的体外活性，以获得最小抑制浓度(MIC)数据。
微稀释抗微生物敏感性测试
被测试化合物的贮备液在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中以5mg/ml的浓度制备。被测试化合物的工作溶液由贮备液在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中以64μg/ml的起始浓度制备。
细菌接种物是由过夜培养物制备的(即在5ml MHB中加入得自琼脂板的一个新鲜菌落；流感嗜血菌在加入酵母提取物、正铁血红素和NAD的MHB中生长)，离心2×5分钟/3000rpm(对于肺炎链球菌和流感嗜血菌，2×10分钟/3000rpm)，每次分配在5ml新鲜的MHB中，这样将细菌悬浮液稀释以在一个微量滴定板孔(总体积100μl)中获得100个菌落形成单位(cfu)。
给微量滴定板孔填充由64μg/ml开始的2倍稀释的被测试化合物(50μl)。然后给孔中填充50μl细菌接种物(最终体积100μl/孔)。将微量滴定板在37℃培养18-24小时(将肺炎链球菌在富含CO2的气氛下生长)。
然后用TECAN SpectroFluor Plus测定在590nm的每个孔的光密度(OD590)。最小抑制浓度(MIC)定义为表现出90％生长抑制的浓度。在如实施例5所示的一个实例中，使用肉汤微稀释技术来测定化合物抗给定细菌培养物的体外活性，以产生最小抑制浓度(MIC)数据。
抗微生物琼脂稀释测试
基本上按照文献中描述的方法来进行该测定[参见例如NCCLS.Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria；Approved Standard-Fourth Edition.NCCLS文件M 11-A4.NCCLSWayne，Pennsylvania；1997.]。
琼脂培养基补充有氯高铁血红素(5μg/ml)、5％绵羊血和维生素K1(1μg/ml)布鲁氏杆菌血琼脂。
抗微生物剂将标准抗微生物粉末(例如阿奇霉素、氯霉素、呋喃妥英、哌拉西林、克林霉素、青霉素、亚胺培南)和测试化合物制成贮备液[5120μg/ml在DMF(二甲基甲酰胺)中]，并如NCCLS Methods forAntimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic bacteria；ApprovedStandard-Fourth Edition 1997；M11-A4，Vol.17 No 22的表3所示进行稀释。
接种物制备从富集布鲁氏杆菌血琼脂中选择测试厌氧菌株。将5个菌落的部分直接悬浮到布鲁氏杆菌肉汤培养基中以达到等于0.5McFarland标准的浊度。
操作依据制造商的说明制备培养基，并分配到螺口试管中。在测试当天，将血液补充物和2ml各种浓度的抗微生物剂加到冷却的(50℃)琼脂的适当试管中。将培养基与抗微生物剂的混合物倒入标准(15×100mm)圆形陪替氏培养皿中，并让其固化。通过复制装置将浊度调节的每种厌氧菌株培养基接种到每个平板中(约2μl/点)。将接种的平板在厌氧瓶中于35℃培养。培养48小时后记录结果，并作为最小抑制浓度(MIC)值表示。
抗菌活性的体内测定
还在实验室动物中测试化合物的抗菌效力。这些体内实验包括但不限于全身和局部感染模型、泌尿道感染模型、脓毒症、抗生素介导的结肠炎和伤口护理。还可以在动物中评价本发明化合物以评定其药动学特征例如生物利用度、口服吸收、化学半衰期、代谢物鉴定、在不同时间的血清水平和排泄速度。
全身细菌感染动物模型
文献中描述了全身感染模型。使用下列条件来分析本申请中的化合物。让细菌在Mueller-Hinton琼脂中于37℃培养24小时。对于每个实验，细菌悬浮液是这样制备的将4-5个细菌菌落接种到Mueller-Hinton肉汤(MHB)中，在37℃培养24小时以产生约109CFU/ml。BalbC雌性小鼠是由Charles River提供的。通过尾静脉单次注射LD100剂量的细菌培养悬浮液(1×108CFU/100μl/动物)来将动物感染。每天进行几次小心的临床检查，记录明显的临床症状和死亡率。在6天的时间内观察动物存活。将阿奇霉素溶解在0.5％甲基纤维素的盐水溶液中，并口服给药。用研钵和研杵将测试化合物微粒化，然后溶解在含有3％DMF的甲基纤维素盐水溶液中。首次剂量是在感染30分钟后给予，以后的剂量在3天时间内每12小时施用1次。
测定生化和物化性质
可依据两类方法，即结构方法和物化方法来优化本发明杂环化合物的体外“抗菌”活性。可使用取代基的组合来修饰化学结构，以提供满足一些或所有下列标准的化合物1)其中计算或实验测定的亲脂性(logP)为0-2个logP单位的化合物；2)是任何D-Ala-D-Ala连接酶的底物的化合物；3)其中水溶解度大于1μg/ml的化合物。这些物化和生化性质是在个体(例如动物)中观察到的抗微生物作用的因素。
杂环化合物的临床应用
本发明化合物可治疗或预防性地用于治疗或预防细菌感染和/或疾病。
本发明还涉及方法，例如在个体中破坏微生物生长的内部调节的方法，包括给所述个体施用本文所述的任何结构式所示化合物或包含本文所述的任何结构式所示化合物的组合物的步骤。在一个实施方案中，本发明涉及在个体中抑制微生物或细菌活性的方法，包括给所述个体施用本文所述的任何结构式所示化合物或包含本文所述的任何结构式所示化合物的组合物的步骤。所述个体优选为人或动物。
在另一个实施方案中，本发明涉及在个体中治疗疾病或疾病症状的方法，包括给所述个体施用本文所述的任何结构式所示化合物或包含本文所述的任何结构式所示化合物的组合物的步骤。所述个体优选为人或动物。
感染和感染疾病是由多种不同的微生物引起的。本发明化合物可用于细菌感染的疾病治疗中。
杀死或限制微生物生长的化合物可用于治疗感染和感染疾病。已知具体的细菌微生物与这类感染或感染疾病有关。下面列出细菌感染的某些实例及其最常见的病原体。
上和下呼吸道感染包括但不限于支气管炎、窦炎、肺炎、咽喉痛、慢性链球菌感染、白喉、急性会厌炎、流感、慢性支气管炎、中耳感染(中耳炎)、肺炎、支气管肺炎、军团病、非典型肺炎、百日咳和结核病。
引起呼吸道感染的细菌微生物包括但不限于酿脓链球菌、肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血菌、M.catarrhalis、脑膜炎奈瑟氏球菌、百日咳博德特氏菌、肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、厌氧菌、诺卡氏菌属(Nocardia)，假单胞菌属、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和白喉棒状杆菌(C.diphtheriae)。
泌尿道感染包括但不限于尿道炎、膀胱炎、肾孟肾炎(肾感染)、无症状细菌尿、间质性膀胱炎、急性尿道症状和复发性泌尿道感染。
引起泌尿道感染的细菌微生物包括但不限于大肠杆菌、变形杆菌属(Proteus)、天命菌属(Providentia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙雷氏菌属(Serratia)、Coag阴性葡萄球菌(Coag.neg.Staphylococci)、肠球菌(Enterococci)和砂眼衣原体。
皮肤和伤口感染包括但不限于红癣(erythrasma)、甲沟炎、脓疱病、滤泡炎、丹毒、蜂窝织炎和坏死性筋膜炎。
引起皮肤和伤口感染的细菌微生物包括但不限于链球菌、葡萄球菌、铜绿假单胞菌、P.acnes、梭状芽孢杆菌(Clostridia)、厌氧菌和脆弱拟杆菌(B.fragilis)。
引起全身感染(菌血症)的细菌微生物包括但不限于链球菌、葡萄球菌、肠杆菌(Enterobacteriaceae)、假单胞菌、拟杆菌属、奈瑟氏菌属(Neisseria)、流感嗜血菌、布鲁氏杆菌属(Brucella)、利斯特氏菌属(Listeria)和伤寒沙门氏菌(S.typhi)。
细菌起源的性传播疾病包括但不限于子宫附件炎、子宫颈炎、软下疳、尿道炎、龟头炎、淋病、性病性淋巴肉芽肿、梅毒和腹股沟肉芽肿。
引起性传播感染的细菌微生物包括但不限于衣原体属(Chlamydia)、淋病奈瑟氏球菌、U.urealyticum、苍白密螺旋体(T.palladium)、阴道加德纳氏菌(G.vaginalis)、杜氏嗜血菌、C.granulomatis、链球菌、葡萄球菌和肠杆菌。
细菌起源的胃肠道感染包括但不限于食物引起的感染、肠炎、大肠炎、胃溃疡、十二指肠溃疡、胰腺炎、膀胱感染、霍乱和thyphus。
引起胃肠道感染的幽门螺杆菌、C.pylori、C.duodeni、伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌(S.paratyphi)、霍乱弧菌、厌氧菌、肠杆菌、葡萄球菌和链球菌。
治疗患者的方法
本文所描述的结构式所示杂环化合物可施用给患者以例如治疗感染如细菌感染。本发明杂环化合物可以例如在可药用载体如生理盐水中给药，与其它联合用药物给药，和/或与合适的载体一起给药。本发明杂环化合物可例如通过注射给药、静脉内给药、动脉内给药、皮下给药、腹膜内给药、肌内给药或皮下给药；或口服给药、颊给药、经鼻给药、经粘膜给药、局部给药、在眼用或耳用制剂中给药或通过吸入给药，剂量为约0.001-约100mg/kg体重，剂量优选为10mg-5000mg/次给药，每4-120小时给药一次，或依据特定药物的需要进行给药。
本领域技术人员应当理解，可能需要低于或高于上述范围的剂量。对于任何特定患者，具体的剂量和治疗方案将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性、年龄、体重、一般健康状况、性别、饮食、给药时间、排泄速度、联合用药物，疾病、病症或症状的严重程度和病程，患者对疾病、病症或症状的素因以及临床医师的判断。
在患者的病症好转时，如果需要的话，可施用维持剂量的本发明化合物、组合物或联合用药物。然后可根据病症将给药剂量或频率或二者都降至其中好转的病症得以保持的水平，当症状已减轻至所需水平时，应当停止治疗。然而，根据疾病症状的任何复发，患者可能需要长期的间歇治疗。
在另一个实施方案中，本发明提供了在哺乳动物中治疗、预防或减轻疾病症状的方法，包括给所述哺乳动物施用任何上述药物组合物和联合用药物的步骤。所述哺乳动物优选是人。如果药物组合物仅包含本发明化合物作为活性组分，则所述方法还可以包含给所述哺乳动物施用另外的治疗剂的步骤，所述另外的治疗剂是例如大环内酯类抗生素(例如克拉霉素)、质子泵抑制剂(例如奥美拉唑)、利福霉素类药物(例如利福平)、氨基糖苷类药物(例如链霉素、庆大霉素、妥布霉素)、青霉素类药物(例如青霉素G、青霉素V、替卡西林)、β-内酰胺抑制剂、头孢菌素类药物(例如头孢唑啉、头孢克洛、头孢他啶)和抗分支杆菌剂(例如异烟肼、乙胺丁醇)。其它合适的治疗剂描述于感染性疾病教科书和出版物中，包括例如Principles and Practice of Infectious Diseases，G.L.Mandell等人eds.，3rd ed.，Churchhill Livingstone，New York，(1990)。这样的另外的治疗剂可在施用包含任何本发明化合物的组合物之前、同时或之后施用给哺乳动物。
本发明药物组合物包含本文所述的结构式所示化合物或其可药用盐；选自抗癌剂、抗病毒剂、抗真菌剂、抗生素的其它治疗剂和任何可药用载体、辅料或赋形剂。另外的本发明组合物包含本文所述的结构式所示化合物或其可药用盐和可药用载体、辅料或介质。这样的组合物还可任选包含另外的治疗剂，包括例如选自抗癌剂、抗微生物剂、抗病毒剂、抗真菌剂、质子泵抑制剂或抗生素的另外的治疗剂。本发明组合物包含其量能有效地实现微生物或细菌水平调节的本文所述的结构式所示化合物，以及如果存在的话另外的治疗剂。
术语“可药用载体或辅料”是指这样的载体或辅料，其可以与本发明化合物一起施用给患者，不破坏本发明化合物的药理活性，并且当以足以递送治疗量的化合物的剂量给药时，没有毒性。
可用于本发明药物组合物中的可药用载体包括但不限于离子交换剂、矾土、硬脂酸铝、卵磷脂、自乳化药物递送系统(SEDDS)例如d-α-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯，用于药物剂型中的表面活性剂例如吐温或其它类似聚合的递送基质，血清蛋白例如人血清白蛋白，缓冲物质例如磷酸盐，甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐，胶态二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。环糊精例如α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，或其化学改性的衍生物例如羟基烷基环糊精，包括2-和3-羟基丙基-β-环糊精，或其它可溶性衍生物也可有利地用于增强本文所述的结构式所示化合物的递送。
本发明药物组合物可口服给药、非胃肠道给药、通过吸入喷雾给药、局部给药、直肠给药、经鼻给药、颊给药、阴道给药或经由植入的贮药库给药，优选经口服或注射给药。本发明药物组合物可由晶形或非晶形的化合物制成。本发明药物组合物可含有任何常规无毒的可药用载体、辅料或介质。在某些情况下，可用可药用酸、碱或缓冲剂调节制剂的pH以提高所配制的化合物或其给药形式的稳定性。本文所用术语“非胃肠道给药”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内、滑液内、胸骨内、鞘内、损伤内和颅内注射或输注技术。
本发明药物组合物可以呈无菌可注射制剂例如无菌可注射水或油质悬浮液的形式。这些悬浮液可依据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或润湿剂(例如吐温80)和悬浮剂来配制而成。无菌注射制剂还可以是在无毒非胃肠道可接受的稀释剂或溶剂中的溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的介质和溶剂有甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌固定油常用作溶剂或悬浮介质。对此，可使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸例如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂，也可以使用天然可药用油例如橄榄油或蓖麻油，尤其是其聚氧乙基化变型。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂或羧甲基纤维素或常用于可药用剂型例如溶液和/或悬浮液的制剂中的类似分散剂。其它常用的表面活性剂例如吐温或司盘和/或常用于制备可药用固体、液体或其它剂型的其它类似乳化剂或生物利用度提高剂也可用于制剂中。
本发明药物组合物可以以任何口服可接受的剂型，包括但不限于胶囊、片剂、乳剂和水悬浮液、分散液和溶液形式口服给药。对于口服使用的片剂，常用载体包括乳糖和玉米淀粉。通常还加入润滑剂例如硬脂酸镁。对于以胶囊形式口服给药，适用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当需要水悬浮液和/或乳剂来口服给药时，可将活性组分悬浮或溶解在油相中，并与乳化剂和/或悬浮剂合并在一起。如果需要的话，还可以加入一些甜味剂和/或风味剂和/或着色剂。
本发明药物组合物还可以用于直肠给药的栓剂形式施用。这些组合物可通过将本发明化合物与在室温是固体，但是在直肠温度是液体，并因此将在直肠中熔化而释放出药物的合适的非刺激性赋形剂混和来制得。这样的赋形剂包括但不限于椰子油、蜂蜡和聚乙二醇。
当所需治疗涉及易于通过局部施药来进入的区域或器官时，本发明药物组合物的局部给药是尤其有用的。对于给皮肤局部给药，应当将药物组合物配制成合适的软膏剂，其中含有悬浮或溶解在载体里的活性组分。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可用合适的乳化剂将药物组合物配制成洗剂或霜剂，其中含有悬浮或溶解在载体里的活性化合物。合适的载体包括但不限于矿物油、山梨聚糖一硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鲸蜡基酯蜡、鲸蜡硬脂醇(cetearyl alcohol)、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。本发明药物组合物还可以通过直肠栓剂或在合适的灌肠剂中局部施用到下肠道中。本发明还包括局部给药用透皮贴剂。
本发明药物组合物还可以通过鼻用气雾剂或吸入剂来给药。这样的组合物依据药物制剂领域众所周知的技术制得，并且可用苯甲醇或其它合适的防腐剂、用于提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或本领域已知的其它助溶剂或分散剂制成在盐水的溶液。
本发明化合物和组合物可用作消毒剂、防腐剂、伤口敷料(例如绷带)中的助剂和伤口清洁方法(击打法、强饲法等)中的助剂。
约0.01-约100mg/kg体重/天或约0.5-约75mg/kg体重/天(例如约10mg-5000mg/剂)剂量水平的本文所述抗微生物化合物用于预防和治疗微生物介导的疾病的单一治疗和/或联合治疗。一般情况下，本发明药物组合物可每天给药约1-约6次，或者以连续输注的形式给药。这样的给药可用作长期或急性治疗。可以与载体材料合并以产生单一剂型的活性组分的量将根据所治疗的个体和特定的给药方式而变。典型的制剂含有约5％-约95％活性化合物(w/w)。或者，这样的制剂含有约20％-约80％活性化合物。当本发明组合物包含本文所述的结构式所示化合物与一种或多种另外的治疗剂或预防剂的联合用药物时，本发明化合物和另外的活性剂都应当通常以单一治疗方案中正常施用量的约10-100％，更优选约10-80％的剂量水平存在。另外的活性剂可作为多剂量方案的一部分与本发明化合物分开给药。或者，这些活性剂可作为与本发明化合物混和在一起的一部分在单一组合物中给药。
其它应用
在另一个实施方案中，本文所述的抑制性化合物可用作可用于组合化学技术以制备衍生物和/或化合物的化学库的平台或母核结构。这样的衍生物和化合物库具有抗微生物活性，并且可用于鉴定和设计具有抗微生物活性的化合物。适于使用本发明化合物的组合技术是本领域已知的，例如Obrecht，D.和Villalgrodo，J.M.，以固体为载体的小分子量化合物库的组合和平行合成，Pergamon-Elsevier Science Limited(1998)，并且包括那些，例如“分裂和汇集”或“平行”合成技术、固相和溶液相技术以及编码技术(参见例如Czarnik，A.W.，Curr.Opin.Chem.Bio.，(1997)1，60)。因此，一个实施方案涉及使用本文所述的结构式所示化合物以产生衍生物或化学库的方法，包括1)提供包含多个孔的实体；2)给每个孔提供一种或多种本文所述的结构式所示化合物；3)给每个孔提供另外一种或多种化学药品；4)从每个孔中分离出所得一种或多种产物。另外一个实施方案涉及使用本文所述的结构式所示化合物以产生衍生物或化学库的方法，包括1)提供连接在固体载体上的一种或多种本文所述结构式所示化合物；2)用一种或多种另外的化学药品处理连接在固体载体上的一种或多种本文所述结构式所示化合物；3)从每个孔中分离出所得一种或多种产物。在上述方法中，可将“标签”或标识物或标记部分连接在本文所述结构式所示化合物或其衍生物上和/或从其上面脱离下来，以帮助跟踪、鉴定或分离出所需产物或其中间体。这样的部分是本领域已知的。用于上述方法的化学药品可包括例如溶剂、试剂、催化剂、保护基和脱保护基试剂等。这样的化学药品的实例是在本文所参考的各种合成和保护基化学教科书以及论文中描述的那些。
本发明化合物可含有一个或多个不对称中心，并因此可作为外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、单独的非对映体和非对映体混合物存在。所有这些化合物这样的异构体形式都包括在本发明范围内。本发明化合物还可以其多种互变异构体形式提供，在这样的情况下，本发明包括本发明化合物的所有互变异构体形式(例如环系的烷基化可导致在多个位点上的烷基化，本发明包括所有这样的反应产物)。本发明化合物还可以顺式-或反式-或E-或Z-双键异构形式存在。所有这此化合物这样的异构体形式都包括在本发明范围内。所有晶体形式的本发明化合物都包括在本发明范围内。
在下列实施例中更详细地描述本发明。应当理解，这些实施例仅是为了举例说明，而不应当理解为对以任何方式对本发明的限制。
实施例
液相色谱数据是用偶联到二极管排列检测器上的Hewlett-Packard(HP)1090系列液相色谱获得的[Restek Allure C18柱；粒径为5μM；柱长为150mm；柱直径为4.6mm；流速为1ml/分钟；溶剂方案为在8分钟内从95％H2O(w/0.1％TFA)/5％CH3CN(w/0.1％TFA)到100％CH3CN(w/0.1％TFA)，然后保持恒定3分钟，检测波长254nm]。质谱数据用Agilent 1100 LC/MS或Thermofinigan AQA/Gilson LC/MS系统获得。1H-和13C-NMR谱用Bruker AC-300MHz仪器获得。中压快速色谱法在Isco Inc.，Combiflash Sg100c系统上进行。薄层色谱用EM Science硅胶60 F254塑料TLC板进行。熔点在开口的毛细管中用Meltemp II仪器进行。使用UV光来检测在TLC板上的化合物。用于反应的试剂购自Aldrich Chemical Co.(Milwaukee，WI)，Sigma Chemical Co.(Saint Louis，MO)，Fluka Chemical Corp.(Milwaukee，WI)，Fisher Scientific(Pittsburgh，PA)，TCI America(Portland，OR)，Transworld Chemicals，Inc.(Rockville，MD)，Maybridge Chemical Ltd.，(London，England)或Lancaster Synthesis(Windham，NH)。
实施例1-合成连接酶抑制剂
N7-甲基-N7-(1-萘-1-基-丙基)-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺
化合物1在冰水浴内，向4.25g(27.2mmol)萘甲醛在30ml无水乙醚内的溶液中缓慢地加入13ml溴化乙基镁的乙醚溶液(3M)。将该混合物在室温搅拌30分钟，然后通过缓慢地加入40ml 1N HCl溶液来中止反应。将有机层用水(20ml)、饱和碳酸氢钠(20ml×2)、盐水(20ml)洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。将有机溶剂蒸发，获得了粗产物1，其不用进一步纯化直接用于该反应的下一个步骤。
化合物2将粗产物1溶解在30ml丙酮中，向在冰水浴内的所得混合物中缓慢地加入Jone’s试剂直至持续出现棕色。将该溶液在室温进一步搅拌15分钟，然后加入5ml异丙醇。加入50ml乙酸乙酯，将所得混合物用水(30ml)、饱和碳酸氢钠(30ml×2)、饱和NaCl洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。将有机溶剂蒸发，获得了油状残余物，然后通过硅胶柱色谱纯化。获得了4.01g酮2。
化合物3向4.01g酮2和16.3ml甲基胺的甲醇溶液(2M)的混合物中加入1.61g氰基硼氢化钠和160mg氯化锌。将所得混合物在50℃搅拌过夜。加入1N HCl来中止该反应。真空除去大部分甲醇后，用二氯甲烷(15ml×2)萃取该溶液。用2N NaOH将水层的pH调节至约9。然后用二氯甲烷(15ml×3)萃取产物。将合并的有机层用饱和NaCl洗涤，然后用无水硫酸钠干燥。将溶剂蒸发，获得了3.54g化合物3。
化合物4将2.89g(14.5mmol)嘧啶11、3.54g(15mmol)化合物3和2.5ml(18mmol)三乙胺在25ml 2-甲氧基乙醇中的混合物于80℃搅拌2小时。将所得混合物冷却至室温，将溶剂蒸发，获得了油状残余物。加入30ml乙酸乙酯以溶解残余物，将所得溶液用水洗涤3次，然后用无水硫酸钠干燥。蒸发，获得了油状残余物，然后通过硅胶柱色谱纯化。获得了3.95g产物4，为白色粉末。
N7-甲基-N7-(1-萘-1-基-丙基)-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺
向3.60g化合物4在40ml 2-甲氧基乙醇内的溶液中加入24ml 1M胍的甲醇溶液和16ml 1.5M CH3ONa的CH3OH溶液。将该混合物在140℃搅拌12小时，同时用装配的迪安-斯榻克分水器除去甲醇溶液。将该反应混合物冷却，真空蒸发，以生成油状残余物，然后溶解在30ml甲醇中。加入50ml水以沉淀出产物。然后将产物从甲醇中重结晶，将重结晶的产物在甲醇中搅拌3次。获得了1.95g产物，为白色粉末。根据HPLC分析，其纯度大于99％。
N7-(1-苯并[b]噻吩-3-基-乙基)-N7-甲基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺
将2.89g(14.5mmol)嘧啶11、2.87g(15mmol)甲基胺1a和2.5ml(18mmol)三乙胺在25ml 2-甲氧基乙醇中的混合物于80℃搅拌2小时。将该反应混合物冷却至室温，将溶剂蒸发，获得了油状残余物。加入30ml乙酸乙酯以溶解残余物，将残余物溶液用水洗涤3次，然后用硫酸钠干燥。蒸发，获得了油状残余物，通过从乙醚/己烷中重结晶来纯化。获得了3.95g产物1b，为白色粉末。
向3.71g 1a在40ml 2-甲氧基乙醇内的溶液中加入24ml 1M胍的甲醇溶液和16ml 1.5M CH3ONa的CH3OH溶液。将该混合物在140℃搅拌12小时，同时用装配的迪安-斯榻克分水器除去甲醇溶液。将该反应混合物冷却，真空蒸发，以生成油状残余物，然后溶解在30ml甲醇中。加入50ml水以沉淀出产物。然后将产物从甲醇中重结晶，将重结晶的产物在甲醇中搅拌3次。获得了920mg产物，为白色粉末。根据HPLC分析，其纯度大于99％。
N7-甲基-N7-[1-(4-甲基-萘-1-基)-乙基]-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺
使用类似于制备化合物N7-(1-苯并[b]噻吩-3-基-乙基)-N7-甲基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺的方法来制备化合物N7-甲基-N7-[1-(4-甲基-萘-1-基)-乙基]-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺。获得了860mg终产物，为白色粉末，其具有98.80％的HPLC纯度。
合成7-氨基取代的嘧啶并嘧啶(结构IV)
该胺(结构II)通过用相应的胺(合成方案2)结构II将1-萘乙酮还原胺化来制得的。
合成方案2
(IIA)N-(2-{[1-(1-萘基)乙基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯
向1-乙酰萘(152μl，1mmol)在乙腈(2ml)内的溶液中加入N-(2-氨基乙基)-氨基甲酸叔丁酯(189μl，1.2mmol)、NaBH3CN(126mg，2mmol)和无水ZnCl2(136mg，1mmol)。在螺帽小瓶内，在磁搅拌下，将该反应在80℃加热过夜。过滤出沉淀，将溶液蒸发。将残余物溶解在3ml 0.1N HCl中，用二氯甲烷(2×5ml)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。通过硅胶(sp)色谱纯化粗产物，用1.CH2Cl2和2.CH2Cl2/MeOH(10/0.1)洗脱，获得了白色蜡状产物77％。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)315(MH+)确定产物的结构特征。
(IIB)N-(2-{[1-(1-萘基)乙基]氨基}丙基)氨基甲酸叔丁酯
向1-乙酰萘(152μl，1mmol)在乙腈(2ml)内的溶液中加入N-(3-氨基丙基)-氨基甲酸叔丁酯(209μl，1.2mmol)、NaBH3CN(126mg，2mmol)和无水ZnCl2(136mg，1mmol)。在螺帽小瓶内，在磁搅拌下，将该反应在80℃加热70小时。过滤出沉淀，将溶液蒸发。将残余物溶解在3ml 0.1NHCl中，用二氯甲烷(1×5ml)萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，用1.CH2Cl2/MeOH(10/0.1)和2.CH2Cl2/MeOH(10/1)洗脱，获得了油状产物70％。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)329(MH+)确定产物的结构特征。
(IIC)N-(2-{[1-(1-萘基)乙基]氨基}丁基)氨基甲酸叔丁酯
向1-乙酰萘(152μl，1mmol)在乙腈(2ml)内的溶液中加入N-Boc-1，4-二氨基丁烷(229μl，1.2mmol)、NaBH3CN(126mg，2mmol)和无水ZnCl2(136mg，1mmol)。在螺帽小瓶内，在磁搅拌下，将该反应在80℃加热55小时。过滤出沉淀，将溶液蒸发。将残余物溶解在3ml 0.1N HCl中，用二氯甲烷(1×5ml)萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，用1.CH2Cl2/MeOH(10/0.1)和2.CH2Cl2/MeOH(10/1)洗脱，获得了油状产物80％。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)343(MH+)确定产物的结构特征。
合成方案3
IIIA 4-氨基-2-{[4-氨基乙基)[1-萘基)乙基]氨基}-5-嘧啶甲腈
将4-氨基-2-溴嘧啶-5-甲腈(1mmol，199mg)、N-(2-{[1-(1-萘基)乙基]氨基}乙基)氨基甲酸叔丁酯(IIA)(1.2mmol，377mg)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)(2mmol，342μl)和2-甲氧基乙醇(2ml)置于螺帽小瓶中，并在150℃加热4小时。将2-甲氧基乙醇蒸发。将残余物溶解在3ml 0.1N HCl中，用二氯甲烷(2×5ml)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。通过硅胶(sp)色谱纯化粗产物，使用CH2Cl2/MeOH(10/0.1)洗脱，获得了白色不定形产物。
向该不定形产物中加入50％三氟乙酸在二氯甲烷中的冷溶液(1ml)，将该混合物在室温搅拌1小时。将该溶液蒸发。向该粗产物中加入饱和碳酸钠溶液，用二氯甲烷(2×5ml)萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。产量36％白色固体。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)333(MH+)确定产物的结构特征。
IIIB 4-氨基-2-{[4-氨基丙基)[1-萘基)乙基]氨基}-5-嘧啶甲腈
将4-氨基-2-溴嘧啶-5-甲腈(1mmol，199mg)、N-(2-{[1-(1-萘基)乙基]氨基}丙基)氨基甲酸叔丁酯(IIB)(1.2mmol，394mg)、N，N-二异丙基乙基胺(diea)(2mmol，342μl)和2-甲氧基乙醇(2ml)置于螺帽小瓶中，并在150℃加热5小时。将2-甲氧基乙醇蒸发。将残余物溶解在3ml 0.1N HCl中，用二氯甲烷(2×5ml)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。通过硅胶(sp)色谱纯化粗产物，使用CH2Cl2/MeOH(10/0.1)洗脱，获得了白色非晶产物。
向该非晶产物中加入50％三氟乙酸在二氯甲烷中的冷溶液(2ml)，将该混合物在室温搅拌1小时。将该溶液蒸发。向该粗产物中加入饱和碳酸钠溶液，用二氯甲烷(2×5ml)萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。产量60％白色固体。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)347(MH+)确定产物的结构特征。
IIIC 4-氨基-2-{[4-氨基丁基)[1-萘基)乙基]氨基}-5-嘧啶甲腈
将4-氨基-2-溴嘧啶-5-甲腈(1mmol，199mg)、N-(2-{[1-(1-萘基)乙基]氨基}丁基)氨基甲酸叔丁酯(IIC)(1.2mmol，410mg)、N，N-二异丙基乙基胺(DIEA)(2mmol，342μl)和2-甲氧基乙醇(2ml)置于螺帽小瓶中，并在150℃加热4小时。将2-甲氧基乙醇蒸发。将残余物溶解在3ml 0.1N HCl中，用二氯甲烷(2×5ml)萃取。将合并的有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。通过硅胶(sp)色谱纯化粗产物，使用CH2Cl2/MeOH(10/0.1)洗脱，获得了白色非晶产物。
向该非晶产物中加入50％三氟乙酸在二氯甲烷中的冷溶液(1.5ml)，将该混合物在室温搅拌1小时。将该溶液蒸发。向该粗产物中加入饱和碳酸钠溶液，用二氯甲烷(3×5ml)萃取。将有机层干燥(Na2SO4)，并蒸发。产量54％白色固体。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)361(MH+)确定产物的结构特征。
形成7-取代的嘧啶并嘧啶化合物(结构IV)通过将2-取代的2，4-二氨基-5-嘧啶甲腈(结构III)与胍缩合来进行(合成方案4)。
合成方案4
化合物IVC
将4-氨基-2-{[4-氨基丁基)[1-萘基)乙基]氨基}-5-嘧啶甲腈(IIIC)(0.26mmol，95mg)溶解在1.2ml胍游离碱(其制备见下文)在2-甲氧基乙醇内的溶液中。将该反应混合物在螺帽小瓶中于150℃搅拌1.5小时。将2-甲氧基乙醇蒸发。加入水，将沉淀过滤，通过硅胶(sp)色谱纯化该粗产物，使用CH2Cl2/MeOH/NH3(2/1/0.1)洗脱，获得了白色固体42％。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)403(MH+)确定产物的结构特征。
化合物IVB
将4-氨基-2-{[4-氨基丙基)[1-萘基)乙基]氨基}-5-嘧啶甲腈(IIIB)(0.26mmol，93mg)溶解在1.3ml胍游离碱(其制备见下文)在2-甲氧基乙醇内的溶液中。将该反应混合物在螺帽小瓶中于150℃搅拌1.5小时。将2-甲氧基乙醇蒸发。加入水，将沉淀过滤，通过硅胶(sp)色谱纯化该粗产物，使用CH2Cl2/MeOH/NH3(2/1/0.1)洗脱，获得了白色固体38％。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)389(MH+)确定产物的结构特征。
化合物IVA
将4-氨基-2-{[4-氨基乙基)[1-萘基)乙基]氨基}-5-嘧啶甲腈(IIIA)(0.3mmol，100mg)溶解在1.4ml胍游离碱(其制备见下文)在2-甲氧基乙醇内的溶液中。将该反应混合物在螺帽小瓶中于150℃搅拌1.5小时。将2-甲氧基乙醇蒸发。加入水，将沉淀过滤，通过硅胶(sp)色谱纯化该粗产物，使用CH2Cl2/MeOH/NH3(10/2/0.2)洗脱，获得了白色固体46％。用1HNMR；13CNMR；MS(m/z)375(MH+)确定产物的结构特征。
在2-甲氧基乙醇中制备胍游离碱
在单独的容器中，将钠金属(1g，44mmol)加到30ml 2-甲氧基乙醇中，在惰性气氛下搅拌直至在溶液中观察不到任何钠金属。
在单独的容器中制备盐酸胍(4.2g，44mmol)在2-甲氧基乙醇(30ml)中的溶液。向该溶液中加入甲氧基乙醇钠溶液。加入后形成了白色沉淀(NaCl)。将该反应在25℃搅拌30分钟。将沉淀过滤，将溶液贮藏在冰箱中，并用作胍游离碱的溶液。
3-[(5，7-二氨基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)-(2-乙氧基-萘-1-基甲基)-氨基]-2羟基-丙酸
使用类似于在本申请别处详细描述的实验方法和条件，由异丝氨酸作为原料以多个步骤合成α-羟基羧酸。该醇对映体可使用2-乙氧基萘基甲基胺与甘氨酸酯(环氧化物)反应来立体选择性地合成。
N-(2-氨基-乙基)-3-[(5，7-二氨基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)-(2-乙氧基-萘-1-基甲基)-氨基]-2羟基-丙酰胺
向在无水DMF(2ml)内的3-[(5，7-二氨基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)-(2-乙氧基-萘-1-基甲基)-氨基]-2羟基-丙酸(200mg，0.445mmol)中加入BroP(249mg，0.534mmol)。将该混合物搅拌30分钟，加入DIEA(126mg，0.979mmol)。再搅拌20分钟后，加入乙二胺(53.5mg，0.89mmol)。然后将该混合物在室温搅拌16小时，通过制备HPLC直接纯化，获得了35mg(16％)本标题化合物MS m/z(M+H)492。
在还原条件下将各种胺与芳族酮反应的一般方法
下列方法是基于文献方法(J.Org.Chem.1985，50，1927-1932)。
在室温，向1-乙酰基萘(1当量，1mmol，170mg，151μl)在甲胺的甲醇溶液(4当量，4mmol，2ml 2M甲醇溶液)内的溶液中加入固体氰基硼氢化钠(2当量，2mmol，126mg)和无水氯化锌(1当量，1mmol，136mg)。在磁搅拌下将该反应在开口试管中加热至65℃。
可通过TLC或HPLC监测该反应的进程。在30分钟时，观察到了几个峰。使用N-甲基-1-萘基乙基胺的真实样品进行比较。在1小时，反应＞50％完成。在4小时，酮完全消失，产物是95+％纯度，仅含有＜5％的亚胺中间体。将反应加热更长时间可获得更纯的产物。对于该特异性酮，我们推荐至少6小时的反应时间，虽然反应时间可根据酮的性质来改变。以常用方式对这些反应进行后处理，使用标准实验室技术来纯化粗产物。
3-[(5，7-二氨基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)-(2-乙氧基-萘-1-基甲基)-氨基]丙酸
{4-[(5，7-二氨基-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2-基)-(2-乙氧基-萘-1-基甲基)-氨基]丁基-氨基甲酸叔丁酯
将取代的-氰基氨基嘧啶(12.37g，0.025mol)、盐酸胍(7.16g，0.075mol)、固体甲醇钠(5.40g，0.1mol)在甲氧基乙醇(150ml)中的悬浮液加热回流48小时。通过用HPLC监测确定反应完成。将该反应混合物冷却至室温，并倒入过量的水中。在滤器上收集固体材料，真空干燥，获得了13.05克粗产物，其不用进一步纯化即用于下一个步骤。
N7-(4-氨基-丁基)-N7-(2-乙氧基萘-1-基甲基)-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺
在快速搅拌下，用10分钟将单-boc-保护的中间体(13g)缓慢地加到冰冷的三氟乙酸(75ml)中。通过等份试样的HPLC/MS分析观察到反应完全。将该反应混合物倒入冰冷的乙醇钠溶液(5％)中以沉淀出产物。在滤器上收集HPLC产物，干燥，获得了8.0克固体HPLC Rt＝2.882分钟，99％纯度，MS m/z 433(pos)。
步骤1还原胺化
将20.0g(0.12mole)酮溶解在100ml(～2当量)甲胺的2M甲醇溶液中。向一个单独的冷却至0℃的烧瓶内加入在10ml MeOH中的8.3g(0.5当量)ZnCl2和7.7g(1.0当量)NaCNBH3。将Zn(CNBH3)2在0℃混合约5分钟，然后作为浆液加到酮/胺混合物中。将该反应轻微回流过夜。让该反应冷却至室温，旋转蒸发至干。将残余物置于高度真空下以除去任何残余的甲基胺。
用乙醚研制该白色固体，形成了粘稠的油状物。通过加入足够MeOH以防止产物向外油化，可获得更好的用乙醚研制结果。将产物过滤，用乙醚洗涤，让其风干。TLC固体相对于ET提供的真实样品表现出了相同的移动性。然而，根据重量，收率＞100％，估计其中仍然存在无机盐。
由于存在盐杂质，在下一个步骤中使用少量产物。没有观察到任何明显问题。所以该氨基酸不用进一步纯化即可使用。
步骤2与Cl-嘧啶反应
将25g(理论产量为21.8g)上述氨基酸溶解在约50ml乙氧基乙醇中。向其中加入17.0g(0.9当量，按酮计)的4-氨基-2-氯嘧啶-5-甲腈和42ml(2.0当量)DIEA，将该反应在80℃(油浴温度)混合约2小时。TLC表明没有剩余的氯化物。让该反应冷却至室温，在旋转蒸发仪中浓缩至约10ml。将所得浆液用约400ml水稀释，使用浓的HOAc将pH调节至5-6(pH试纸)，此时形成了浅黄色固体。将该物质在0℃静置过夜，过滤，用约1L水洗涤，并风干。从H2O/MeOH中重结晶，获得了～25g中间体(69％)。TLC(CH2Cl2 10％MeOH)Rf0.1。似乎出现了迅速移动的物质，然而，其非常少，产物不用进一步纯化即可使用。
步骤3环合反应
为了增加反应规模，使用乙氧基乙醇作为溶剂以将反应的温度提高至约135℃。将16.0g(54mmol)上面的中间体溶解在～75ml乙氧基乙醇中。向其中加入10.2g(2.0当量)盐酸胍和11.6g(4.0当量)NaOMe，将该反应在氩气氛下轻微回流。使用TLC来监测原料的消失。约30小时后，将该反应冷却，再加入5.1g(1.0当量)盐酸胍和2.9g(1.0当量)NaOMe，将该混合物回流。TLC表明，反应似乎在约72小时后完成。
让该反应冷却，在旋转蒸发仪中浓缩至约20ml。将所得浆液用约600ml水稀释，使用浓的HOAc将pH调节至5-6。产物从溶液中沉淀出来，让其在0℃静置过夜，过滤出产物，用大量水洗涤，然后用大量MeOH洗涤(除去任何反应的原料)，并风干。分离出了～13.5g(～75％)产物。HPLC分析表明其中有少量极性杂质，在小规模反应中也观察到了相同杂质。该产物不用进一步纯化即可使用。
将[2-(4-氨基-5-氰基-嘧啶-2-基氨基)-乙基]-氨基甲酸叔丁酯(5g，18mmol)溶解在60ml 50/50v/v二氯甲烷/三氟乙酸溶液中。在将液体加到固体中时观察到剧烈冒泡。然后将该溶液在惰性气氛下搅拌30分钟，然后取样进行HPLC分析以确定反应是否完全。当脱保护反应完全时，将该溶液真空浓缩至明显变干。
在一个单独的容器内，在惰性气氛下将金属钠(0.675g)缓慢地加到30ml 2-甲氧基乙醇中直至溶液中观察不到金属钠。在另一个单独的容器内制备盐酸胍(2.645g)在2-甲氧基乙醇(30ml)中的溶液。向该溶液中加入甲氧基乙醇钠溶液。加入后，形成了白色的氯化钠沉淀，将所得溶液搅拌30分钟。将该溶液在惰性气氛下过滤，加到步骤1的残余粗产物中，并剧烈搅拌。在15分钟内观察到了黄色沉淀。过滤出沉淀，获得了N7-(2-氨基-乙基)-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-2，4，7-三胺(2.1g，产率为52％)。
4-(N-[2，4-二氨基-6-喋啶基-甲基]-N-甲基氨基)-苯甲酸4-氨基丁基酰胺
向4-[N-(2，4-二氨基-6-喋啶基甲基)-N-甲基氨基]苯甲酸半盐酸盐(250mg，0.73mmol)在无水DMF(20ml)内的悬浮液中加入N，N-二异丙基乙基胺(250μl，1.46mmol，2当量)和氰基膦酸二乙酯(225μl，1.46mmol，2当量)。迅速发生了溶解，将该反应在室温搅拌4小时。然后加入1，4-二氨基丁烷(367μl，3.65mmol，5当量)和N，N-二异丙基乙基胺(250μl，1.46mmol，2当量)，将该溶液在室温搅拌45分钟。通过HPLC证实反应完全，加入固体NaHCO3。然后将溶剂减压蒸发，把残余物悬浮在少量甲醇中。加入稀的NH4OH水溶液，然后过滤，用水洗涤，干燥后获得了153mg(53％)产物MS m/z(M+H)396，HPLC Rt＝3.80分钟。
4-(N-[2，4-二氨基-6-喋啶基-甲基]-N-甲基氨基)-苯甲酸4-羟基苯基酰胺
向4-[N-(2，4-二氨基-6-喋啶基甲基)-N-甲基氨基]苯甲酸半盐酸盐(100mg，0.29mmol)在无水DMF(～6ml)内的悬浮液中加入2当量N，N-二异丙基乙基胺(100μl，0.58mmol)和2当量氰基膦酸二乙酯(90μl，0.58mmol)。迅速发生了溶解，将该反应在室温搅拌3-4小时。为了生成4-羟基苯基酰胺，加入1.05当量对氨基苯酚(33mg，0.30mmol)和2当量N，N-二异丙基乙基胺(100μl，0.58mmol)，将该溶液在室温搅拌过夜。通过HPLC证实反应完全，加入固体NaHCO3。然后将溶剂减压蒸发，把残余物悬浮在少量甲醇中。加入稀的NH4OH水溶液，然后过滤，用稀的乙酸水溶液洗涤，干燥后获得了产物。产量77mg(0.19mmol，64％)，MS m/z(M-H)415，HPLC保留时间4.66分钟。
(N-苄基[2，4-二氨基-6-喋啶基-甲基]-N-甲基胺)
在装配有磁搅拌器的15ml螺帽小瓶内，将5倍过量的N-甲基苄基胺(245.4mg，261μl，2.02mmol)溶解在DMF(4ml)中。加入2，4-二氨基-6-氯甲基喋呤(100mg，0.405mmol)，并充分混合。将该反应混合物在60℃搅拌4小时。等份试样的分析HPLC检查表明已没有喋呤原料。在60℃减压除去溶剂。将所得混合物用EtOH(2×15ml)洗涤，然后在氮气流下除去溶剂，将所得产物在高度真空下干燥18小时。获得了NMR和MS，并确认产物结构和纯度。
(N-(α-甲基-4-甲基苄基)[2，4-二氨基-6-喋啶基-甲基]-N-甲基胺)
在装配有磁搅拌器的15ml螺帽小瓶内，将5倍过量的(S)-(+)-α-4-二甲基苄基胺(272mg，298μl，2.02mmol)溶解在DMF(4ml)中。加入2，4-二氨基-6-氯甲基喋呤(100mg，0.405mmol)，并充分混合。将该反应混合物在60℃搅拌4小时。等份试样的分析HPLC检查表明已没有喋呤原料。在60℃减压除去溶剂。将所得混合物用EtOH(2×15ml)洗涤，然后在氮气流下除去溶剂，将所得产物在高度真空下干燥18小时。分析HPLC、1H-NMR和MS与产物结构一致，产物具有高纯度。
实施例2-D-Ala-D-Ala-连接酶Ki测定
在筛选当天，将实施例1的合成类似物以100mM的浓度溶解在二甲亚砜(DMSO)中，使用涡旋混合器以及如果需要的话进行超声处理来促进溶解。将该溶液保持在室温直至筛选完成。
在筛选当天，通过将32μmol NADH溶解在3.2ml双重蒸馏水中来制备10mM NADH(Sigma)贮备液。将该NADH溶液保持在冰上。含有50mM磷酸烯醇丙酮酸(PEP；Sigma)，500μM HERMES，30mM三磷酸腺苷(ATP；Sigma)，200mM D-丙氨酸(Sigma)和4×核心缓冲液(即400mM Hepes，40mM氯化镁和40mM氯化钾)的贮备液也保持在冰上。丙酮酸激酶/乳酸脱氢酶(PK/LDH)的贮液也得自Sigma。
表中的终浓度取决于筛选类型
实施例3-测定类似物的Ki
对于每组被测试化合物，使用2个96孔板抑制剂板和酶板。测试化合物对应平板的第A-G排。溶解在DMSO中的用作对照的腺苷(Sigma)在每个板的第H排。
让酶溶液在25℃平衡。
如下所述在抑制剂板中制备稀释液将50μl DMSO加到抑制板的第1-11列、第A-G排的每个孔中。将50μl DMSO加到第1-11列、第H排的每个孔中。将100μl 100mM测试溶液加到第12列、第A-G行中(即第一种化合物在第A排中，第二种化合物在第B排中，如此类推)。将100μl的100mM腺苷溶液加到第12列、第H行中。
将50μl测试溶液从每一排的第12列转移到相同排的第11列中，将该溶液与DMSO混合。然后将50μl溶液从每一排的第11列转移到相同排的第10列中，将50μl从第10列转移到第9列中，如此类推直至第2列。没有溶液转移到第1列中。使用多通道吸移管来制备系列稀释液。
将120μl酶溶液加到酶板的每个孔中。
将底物溶液置于25℃温度下。
然后将类似物与酶在25℃培养。因为反应是在列中开始的，所以类似物也加到列中。在t＝0分钟，将5μl类似物从抑制剂板第1-4列的每个孔中转移到酶板的相应孔中。在t＝4分钟，将5μl类似物从抑制剂板第5-8列的每个孔中转移到酶板的相应孔中。在t＝8分钟，将5μl类似物从抑制剂板第9-12列的每个孔中转移到酶板的相应孔中。然后将抑制剂板冷冻。
在t＝18-19分钟，将底物溶液从25℃转移到SpectromaxUV-vis分光光度计。在t＝20分钟，在30秒的时间框架中，将125μl基质溶液加到第1-4列的每个孔中，读取在340nm的吸收度。在t＝24分钟和t＝28分钟，分别用第5-8和9-12列重复该操作。
因此，在每一排的第1-12列中，化合物的浓度分别是0、1.9μM、3.9μM、7.8μM、15.6μM、31.2μM、62.5μM、125μM、250μM、500μM、1mM和2mM。
将减小值乘于-4.06以将mOD/分钟单位转化成nM/秒(OD＝λLM；λ＝6220l/Mcm；L＝0.66cm；mOD/秒＝6220×0.66×(mM/秒)×60；(mOD/秒)×4.06＝nM/秒)；乘于-1是因为NADH吸收度随着更多产物的生成而降低)。
使用Kaleidograph产生反应速度对抑制剂浓度的曲线，将数据拟合到适当方程上之后，确定Ki值。
使用SciClone自动液体操作机器交替进行大部分步骤。这些步骤是将酶混合物加到酶板中，将50μlDMSO分配到抑制剂板的第1-11列、A-H排的每个孔中，在抑制剂板中系列稀释类似物+腺苷对照，将类似物抑制剂从抑制剂板加到酶板中，将底物加到酶板中。
实施例4-类似物％抑制
重复上述测定操作，但是在平板中用5mM抑制剂溶液(而不是系列稀释液)制备抑制剂板，以在最终的反应混合物中产生100μM抑制剂的终浓度。在DMSO存在下的酶活性用作100％活性对照。
确切浓度参见上表。
实施例5-类似物的Ki和抑制方式
使用分别在不同酶板中的3种不同底物溶液重复上述测定操作。反应混合物中的终浓度为(A)2mM ATP和1mM D-丙氨酸；(B)2mMATP和32mM D-丙氨酸；和(C)50μM ATP和32mM D-丙氨酸。所有这3个酶板都使用相同的抑制剂板。使用腺苷(Sigma)和环丝氨酸(Sigma)作为对照。确切浓度参见上表。
实施例6-微稀释抗微生物敏感性测试
在DMF中制备浓度为5mg/ml的测试化合物的贮备液。然后由贮备液在Mueller-Hinton肉汤(MHB)中以64μg/ml的起始浓度制备测试化合物的工作溶液(即在974.4μl MHB中的25.6μl贮备液＝128μg/ml，按照下述操作用等体积的细菌接种物将其稀释)。
细菌接种物是由过夜培养物制备的(即在5ml MHB中加入的得自琼脂板的一个新鲜菌落；流感嗜血菌在加入酵母提取物、正铁血红素和NAD的MHB中生长)，离心2×5分钟/3000rpm(对于肺炎链球菌和流感嗜血菌，2×10分钟/3000rpm)，每次分配在5ml新鲜的MHB中，这样将细菌悬浮液稀释以在一个微量滴定板孔(总体积100μl)中获得100个菌落形成单位(cfu)。
给微量滴定板孔填充由64μg/ml开始的2倍稀释的测试化合物(50μl)。然后给第2-12列填充50μl细菌接种物(最终体积100μl/孔)。将微量滴定板在37℃培养18-24小时(将肺炎链球菌在富含CO2的气氛下生长)。
然后用TECAN SpectroFluor Plus测定在590nm的每个孔的光密度(OD590)。最小抑制浓度(MIC)定义为表现出90％生长抑制的浓度。
实施例7-使用过量表达的大肠杆菌测定MIC
重复实施例5的操作，但是进行下列改动
用于细菌生长的培养基是加入了抗生素(对于pBAD载体，是20mg/l氯霉素，对用于质粒选择的pTAC载体，是100mg/l氨苄西林)的luria肉汤(LB)或具有D-甘露醇作为碳源的M9最小培养基。
用于在LB中接种的细菌是如下所述制备的将过夜培养物在新鲜的LB培养基中进行1∶50稀释，在250rpm的摇动器上于37℃培养。打到中-对数期后(OD600＝0.5-1.0，约3小时)，加入操纵子调节剂(葡萄糖、阿拉伯糖或IPTG)，将细菌再培养3小时。约3小时后，再测定OD600以估计细菌数目，将培养物在LB培养基(抗生素-氯霉素或氨苄西林和调节剂以两倍浓度加入)中稀释。最终的细菌接种物约为10,000cfu/孔。
在M9最小培养基中用于接种的细菌是是如下所述制备的将LB中的过夜培养物离心2×5分钟/3000rpm，用M9培养基洗涤，在M9最小培养基中进行1∶50稀释，在37℃放置14小时(OD600～0.5)，加入操纵子调节剂，将细菌进一步培养3小时。3小时后，测定OD600以估计细菌数目，将培养物在M9最小培养基(抗生素-氯霉素或氨苄西林和调节剂以两倍浓度加入)中稀释。最终的细菌接种物约为10,000cfu/孔。
因为在最小培养基中细菌生长较慢，所以在24和48小时之后读取光密度。
实施例8-用于预测代表性类似物的连接酶抑制活性的计算机模型方案
通过依据下述合成方案将在下面左侧显示的氯甲基喋啶母核与一系列市售的胺合并来产生7-取代的喋啶的虚拟库
根据下列标准由Available Chemicals Directory(ACD，MDL)选择一系列市售的胺
-MW＜300；
-没有反应性或毒性官能团；
-一般的药物样性质；
-可从已知且可靠的供应商获得。
用在Cerius2(MSI)中执行的类似物构建模块产生相应的喋啶衍生物。用Catalyst(MSI)对所生成的类似物进行构象检索，用EUDOC程序(Mayo Clinic)将总共32,000个构象异构体(～20个/分子)停靠到D-Ala-D-Ala-连接酶的活性位点内。用于停靠的活性位点的构象源自酶、ADP和亚膦酸抑制剂(得自蛋白databank，pdb代码2dln)之间的复合物的X-射线晶体结构，其中将赖氨酸215的侧链构象重排和最小化了。
然后从停靠结果获得每个分子的“最佳”结合构象异构体。用在程序CSCORE(Tripos)中执行的一组得分函数重新给活性位点内的相应定向作用计分。然后根据一致得分，使用函数Chemscore作为第二标准给结果分级。选择一组高76级的化合物，使用相同构象的酶活性位点，用FlexX程序(Tripos)重新停靠。用CSCORE给停靠结果重新计分。最终根据用2个停靠程序获得的结果之间的一致性来选择50个化合物。用Chemscore在FlexX-产生的结果上算得的预测的Ki为0.1-10μM。
计算用SGI Octane(2×250MHz CPU，512MB RAM)、SGI 02(270MHz CPU，128MB RAM)和串联的10台SGI Indigo2计算机(195MHzCPU，512 MB RAM)进行。
其它实施方案
应当理解，虽然已经结合其详细说明描述了本发明，但是上面的描述仅是举例说明，而不是限制本发明范围，本发明范围由权利要求书限定。其它方面、优点和变型都在权利要求书范围内。
权利要求
1.包含下式的化合物
其中
A和B独立地选自N和CR7，其中R7是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；
R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6独立地为氢或含有碳的官能团；
R3选自氢、烷基、氨基、羟基、烷氧基和烷基氨基；
R4是含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团，
条件是，
如果A和B都是氮，并且R5和R6都是氢，则R4不是-NH2、-N(H)(甲基)、-N(H)(丁基)、-N(H)(己基)、-N(H)(苯基)、-N(H)(苄基)、-N(H)(NH2)、-N(H)(CH2CH2OH)、-N(CH2CH2OH)2、苯基、N-哌啶基或-S(乙基)；
如果A是CH，B是氮，并且R5和R6都是氢，则R4不是甲基、异丁基、苯基、4-甲基苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、2-(2，5-二甲氧基苯基)乙基或-CH(OCH3)2；和
如果A和B都是CH基，则R4是不同于-NH2、(3，4-二氯苯基)甲基氨基或(3，4-二氯苯基)亚甲基亚氨基的氨基。
2.权利要求1的化合物，其中R4是取代或未取代的、直链、支链或环状的烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基或烷芳基。
3.权利要求1的化合物，其中R5和R6都是氢。
4.权利要求1的化合物，其中R4包括至少一个芳基。
5.权利要求4的化合物，其中R4选自
6.权利要求4的化合物，其中R4是
(扫描P63
其中R8-12独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
7.权利要求4的化合物，其中所述化合物具有下述结构
其中R8-16独立地为氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
8.权利要求7的化合物，其中R9是氢或甲基。
9.权利要求8的化合物，其中所述化合物具有下述结构
其中n是1、2、3或4；且R17是-NR18R19，其中R18和R19独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
10.权利要求9的化合物，其中R17选自
11.权利要求7的化合物，其中R8是-(CH2)nNR18R19，其中n是1、2、3或4；并且R18和R19独立地为氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
12.权利要求4的化合物，其中R4选自-CH2O-芳基、-CH2S-芳基、-CH＝CH-芳基和-NH(CH2-芳基)。
13.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下述结构
其中R20是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
14.权利要求1的化合物， 其中R4选自-N(CH3)R21、-N(CH2CH3)R21、-N(CH(CH3)2)R21和-N(苄基)R21，其中R21是含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
15.权利要求1的化合物，其中R4选自-CH2NH2、-NHCH2CH2NR22R23和-CH2NHC(＝O)R22，其中R22和R23独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
16.权利要求15的化合物，其中R22是氢，且R23是-C(＝O)R24，其中R24是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
17.权利要求1的化合物，其中所述化合物具有下述结构
其中R25和R26独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
18.权利要求17的化合物，其中R25是氢、烷基、羟基烷基或芳烷基；且R26是卤代烷基、羟基、C(＝O)NR27R28、C(＝O)OR27或NR27R28，其中R27和R28独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
19.权利要求17的化合物，其中R26是-C(H)(芳基)(R29)，其中R29是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团。
20.权利要求19的化合物，其中R29包括至少一个酰基。
21.权利要求19的化合物，其中所述芳基是萘基或苯并噻吩基。
22.权利要求19的化合物，其中R29包括α-羟基羧酸酯基。
23.包含下式的化合物
其中R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6可独立地为氢或含有碳的官能团，且R4是不同于-NH2或
的氨基。
24.抑制D-Ala-D-Ala连接酶的方法， 所述方法包括将D-Ala-D-Ala连接酶暴露于式I或式II化合物
其中
A和B独立地选自N和CR7，其中R7是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；
R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6独立地为氢或含有碳的官能团；且
R3和R4独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；条件是R3和R4不都是氢。
25.权利要求24的方法，其中R1和R2都是-NH2。
26.权利要求24的方法，其中R3是氢。
27.权利要求24的方法，其中
R3和R4独立地选自支链或直链烷基、-O-烷基、-O-烷基-COOH、-O-烷基-NR7R8、-O-烷基-OH、-NR7R8、-NR7-烷基-NR8R9、-NR7-烷基-COOH、-NR7-烷基-OH；-CONR7R8、-CONR7-烷基-NR8R9、-CONR7-烷基-COOH、-CONR7-烷基-OH、-S-烷基、-S-烷基-COOH、-S-烷基-NR7R8、-S-烷基-OH、-O-芳基、-O-芳基-COOH、-O-芳基-NR7R8、-O-芳基-OH、-S-芳基、-S-芳基-COOH、-S-芳基-NR7R8、-S-芳基-OH、-NR7-芳基-NR8R9、-NR7-芳基-COOH、-NR7-芳基-OH；-CONR7-芳基-NR8R9、-CONR7-芳基-COOH、-CONR7-芳基-OH、-CH2NR5C6H4COOH；条件是R3和R4不能同时为相同的支链或直链烷基；
R1和R2独立地选自氢、-NH2和NR11R12，其中R1和R2当中至少有一个是-NH2；
R5是低级烷基、-H或-CH2NR10C6H4CONHR6；其中R6选自-烷基、-烷基-COOH、-烷基-NH2和-烷基-OH；
R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地为直链烷基、支链烷基、芳基和酰基，所述基团可任选被一个或多个基于氧、氮、硫或卤素的官能团取代，且
A选自N和CH。
28.治疗患者的方法，所述方法包括给所述患者施用有效量的式I或式II化合物
其中
A和B独立地选自N和CR7，其中R7是氢或含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；
R1和R2是相同或不同的-NR5R6基团，其中每个R5和R6独立地为氢或含有碳的官能团；且
R3和R4独立地选自氢和含有碳、氮、硫、卤素和/或氧的官能团；条件是R3和R4不都是氢。
29.权利要求28的方法，其中R1和R2都是-NH2。
30.权利要求28的方法，其中R3是氢。
31.权利要求28的方法，其中
R3和R4独立地选自支链或直链烷基、-O-烷基、-O-烷基-COOH、-O-烷基-NR7R8、-O-烷基-OH、-NR7R8、-NR7-烷基-NR8R9、-NR7-烷基-COOH、-NR7-烷基-OH；-CONR7R8、-CONR7-烷基-NR8R9、-CONR7-烷基-COOH、-CONR7-烷基-OH、-S-烷基、-S-烷基-COOH、-S-烷基-NR7R8、-S-烷基-OH、-O-芳基、-O-芳基-COOH、-O-芳基-NR7R8、-O-芳基-OH、-S-芳基、-S-芳基-COOH、-S-芳基-NR7R8、-S-芳基-OH、-NR7-芳基-NR8R9、-NR7-芳基-COOH、-NR7-芳基-OH；-CONR7-芳基-NR8R9、-CONR7-芳基-COOH、-CONR7-芳基-OH、-CH2NR5C6H4COOH；条件是R3和R4不能同时为相同的支链或直链烷基；
R1和R2独立地选自氢、-NH2和NR11R12，其中R1和R2当中至少有一个是-NH2；
R5是低级烷基、-H或-CH2NR10C6H4CONHR6；其中R6选自-烷基、-烷基-COOH、-烷基-NH2和-烷基-OH；
其中R7、R8、R9、R10、R11和R12独立地为直链烷基、支链烷基、芳基和酰基，所述基团可任选被一个或多个基于氧、氮、硫或卤素的官能团取代，且
A选自N和CH。
32.包含权利要求1的化合物和适于对个体施用的赋形剂的制剂。
33.治疗患有微生物感染的个体的方法，所述方法包括给所述个体施用有效量的权利要求32的制剂。
34.权利要求33的方法，其中所述个体是动物。
35.在非生活系统中抑制细菌生长的方法，所述方法包括将所述系统与有效量的权利要求1的化合物接触以抑制细菌生长。
36.权利要求24的方法，其中所述D-Ala-D-Ala连接酶包括这样的序列，其与选自下列物种来源的D-Ala-D-Ala连接酶的序列有至少90％的同源性大肠杆菌、肺炎衣原体、砂眼衣原体、鼠疫耶尔森氏菌、流感嗜血菌、杜氏嗜血菌、铜绿假单胞菌、噁臭假单胞菌、柯养木杆菌、百日咳博德特氏菌、氧化亚铁硫杆菌、脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌、蚜虫巴克纳氏菌、Bacillus halodurans、Geobactersulfurreducens、普氏立克次氏体、运动发酵单胞菌、Aquifex aeolicusthermophile、海栖热袍菌、艰难梭菌、屎肠球菌、丰加链霉菌、东方拟无枝酸菌、鹑鸡肠球菌、小肠肠球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、耐放射异常球菌、集胞蓝细菌属、鼠伤寒沙门氏菌、结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、侵肺军团菌、肠膜明串菌株、布氏疏螺旋体、苍白密螺旋体、霍乱弧菌和幽门螺杆菌。
37.制备权利要求1的化合物的方法，包括取用任一种本文所述的中间体化合物，并在一个或多个步骤中将其与一或多种化学试剂反应以生成权利要求1的化合物。
38.通过权利要求37的方法制备的产物。
全文摘要
本发明是基于发现了具有例如抗菌性质的一类新的杂环化合物。D－Ala－D－Ala连接酶是细菌细胞壁合成中的关键途径酶。本发明化合物可结合并抑制D－Ala－D－Ala连接酶。本发明新化合物的活性与其交联细菌细胞膜的能力结合在一起使得其适于用作抗菌药物或其它抗菌应用。
文档编号A61K31/519GK1547472SQ02816660
公开日2004年11月17日 申请日期2002年6月28日 优先权日2001年6月28日
发明者S·T·莫, S T 莫, P·J·阿拉, 阿拉, E·佩罗拉, 蘩, C·H·法尔曼, 法尔曼, J·J·克莱蒙特, 克莱蒙特, J·A·阿里, 阿里, P·M·威尔, 威尔, S·A·马奇斯, 马奇斯, A·S·马吉, 马吉, J·V·加扎尼加, 加扎尼加, C·法拉迪, 纳维亚, M·A·纳维亚, 康纳利, P·R·康纳利 申请人:医贤治疗学公司, 普利瓦股份公司