干燥转谷氨酰胺酶组合物的制作方法

干燥转谷氨酰胺酶组合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及干燥转谷氨酰胺酶组合物，所述组合物可通过将包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种另外的选自糖、氨基酸和缓冲液的组分的含水组合物冻干或喷雾干燥而获得，其中含水组合物中盐的浓度范围为5?100 mM。在进一步的方面，本发明涉及制备所述干燥转谷氨酰胺酶组合物的方法、复溶溶液、药物组合物以及治疗方法。
【专利说明】干燥转谷氨醜胺酶组合物
[0001 ] 本申请是申请日为2009年4月20日、申请号为200980124151.5、发明名称为"干燥 转谷氨酷胺酶组合物"的发明专利申请的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明设及转谷氨酷胺酶组合物，具体地讲是凝血因子XIII的稳定的冻干或喷雾 干燥组合物，而且还设及制备所述组合物的方法、复溶溶液、药物组合物W及治疗方法。
[0003] 发明背景
[0004] 转谷氨酷胺酶是化h依赖性酶，该酶催化蛋白质中的谷氨酷胺侧链丫-甲酯胺基与 赖氨酸侧链E-氨基之间形成异肤键。转谷氨酷胺酶存在于细胞外和细胞内。转谷氨酷胺酶 的实例包括因子XIII、表皮转谷氨酷胺酶、II型转谷氨酷胺酶(组织型转谷氨酷胺酶、肝转 谷氨酷胺酶)和I型转谷氨酷胺酶(角质形成细胞转谷氨酷胺酶）。
[0005] 凝血因子Xin(FXIII)是血浆转谷氨酷胺酶，亦称为"血纤维连接酶"和"血纤蛋白 稳定因子"，其在血浆中的循环浓度为20微克/ml。该蛋白质在血浆中W由两个A亚基和两个 B亚基组成的四聚体(A2B2)存在。每个亚基的分子量约为SOOOODa,整个蛋白质的分子量约为 330000化。A亚基含有转谷氨酷胺酶催化部位，而B亚基没有催化活性，但是却起着结构蛋白 的作用，保护A亚基不被清除。
[0006] 因子XIII的活化取决于凝血酶和化2+。凝血酶在A亚基Ar的7的C端侧切割，从而释 放出活化肤(A亚基的残基1-37)和B亚基，留下活性形式的A2二聚体。活化的FXIII A2亚基 (FXIIIa)是FXIII的催化活性形式。
[0007] FXIII酶是凝血级联中被激活的最后一个酶，其作用是使a-血纤蛋白链与丫-血纤 蛋白链交联，形成对血纤蛋白溶解的抗性提高的更牢固的凝块。此外，多种抗纤维蛋白溶 解、促止血和黏附蛋白交联成凝块，因此提供牢固的血纤蛋白结构，该结构对纤维蛋白溶酶 和其它蛋白水解酶溶解的机械阻力增强。
[000引在许多情况下，市售可得的纯或部分纯的转谷氨酷胺酶或因子XIII制品含有添加 的稳定剂，例如人血清白蛋白化SA)。蛋白质稳定剂的使用尚有疑问，因为当给予患者时，其 降低蛋白质比活，增加蛋白质负荷，并且可能干扰纯度评价。还可能使蛋白质制品产生免疫 原性。蛋白质稳定剂的运些缺点使得它们特别不利于稳定非常纯的蛋白质（例如重组蛋 白）。另外，当加入例如白蛋白时，蛋白质稳定剂的使用可能会造成被病毒抗原污染。
[0009] 自胎盘或血浆分离FXIII或者新鲜冰冻血浆形式的FXIII多年来一直被用来治疗 因子XIII缺陷症。然而，运些制剂受含有外源蛋白质的缺点W及与之相连的所有问题(例如 不利的免疫原性)所困。
[0010] 目前可采用重组DNA技术来制备转谷氨酷胺酶和因子XIII。本文所使用的rFXIII 是指重组因子XIII。然而迄今为止，市场上尚无市售的rFXin产品。
[0011] 用于治疗的蛋白质制品中的组合物和活性必须在相对较长的时间内处于稳定。在 溶液中几乎不能达到运种稳定性，因此，运类产品通常W干燥状态销售。适度的冷冻干燥 (冻干)是将运类产品干燥的精选方法之一。然而，即使当采用运种方法时，也难W得到满足 完整性和持久性需要的稳定制品。
[0012] 例如，转谷氨酷胺酶或因子XIII溶液的冷冻干燥可能导致活性明显下降W及纯度 损失。例如，冷冻干燥的因子XIII的另一个问题是由因子XIII的降解产物造成的，因子XIII 的降解产物即所谓的非蛋白酶水解活化型(FXIIIa°)，亦称为前激活因子XIII。一般认为 尸乂111曰°会出现严重的毒性风险，注射FXIIIa°可能引起潜在的不良副作用。因此，需要使转 谷氨酷胺酶或因子XIII制剂稳定W免形成非蛋白酶水解活化产物。
[0013] 本领域已知各种干燥FXIII组合物。下面公开的是冻干FXHI组合物的公开内容的 实例。W02002/36155披露了可W用ImM抓TA、IOmM甘氨酸、2 %薦糖的水溶液，或者用20mM组 氨酸、3% (重量/体积)薦糖、2mM甘氨酸和0.01 % (重量/体积)聚山梨醇醋(pH 8.0)来制备 冻干FXIII组合物。US 6204036(Aventis Behring)设及稳定的冻干转谷氨酷胺酶制剂，所 述制剂包含至少一种选自D-氨基酸和レ氨基酸及其盐、衍生物、类似物和二聚体、糖和糖 醇、表面活性成分和还原剂的添加剂，前提条件是添加剂不是甘氨酸，也不是精氨酸，其中 所述制剂不含蛋白质稳定剂，且其中所述制剂在适用于胃肠外给药的含水溶剂中是溶解 的，并无任何浊度。
[0014] 然而，上述运些制剂可能受上述高水平非蛋白酶水解活化的因子XIII的缺点所 困，一般认为运有碍于运些制剂的临床和商业可行性。因此显而易见的是，非常需要具有低 水平非蛋白酶水解活化产物的稳定的干燥转谷氨酷胺酶和因子XIII制剂。而且，运类制剂 不需要添加蛋白质稳定剂，例如HSA。
[001引发明概述
[0016] 本发明基于出乎意料的发现，即就纯度和前激活转谷氨酷胺酶的形成而言，盐(例 如一价盐)对干燥转谷氨酷胺酶(例如因子XIII)组合物具有明显的稳定效应或作用。运种 效应是干燥状态特有的，并且对于生产稳定的商品特别重要。
[0017] 在一个方面，本发明提供干燥转谷氨酷胺酶组合物，所述组合物可通过将含水组 合物冻干或喷雾干燥而获得，所述含水组合物包含转谷氨酷胺酶、盐和至少一种另外的选 自糖、氨基酸和缓冲液的组分，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-1 OOmM。
[0018] 在又一个方面，本发明提供制备所述干燥转谷氨酷胺酶组合物、复溶溶液、药物组 合物的方法W及治疗方法。
[0019] 本发明的其它目的、特征和优势从下面的发明详述来看是显而易见的。然而，应当 了解的是，发明详述和具体实施例虽然提供本发明的优选实施方案，但只是通过实例给出， 因为从发明详述来看，本发明的精神和范围内的各种变动和修改对于本领域技术人员是显 而易见的。
[0020] 附图描述
[0021 ] 图1:薦糖和NaCl水平的评价。25mMNaCl对保存于40°C的样品的AIE-HPLC纯度的作 用的Modde分析。
[0022] 图2: NaCl和组氨酸水平的全析因研究。25 °C rFXII Ia°数据的Modde分析。
[0023] 图3:NaQ和组氨酸水平的全析因研究。AIE-HPLC纯度数据的Modde分析。
[0024] 定义
[002引本发明的术语"前激活"或"非蛋白酶水解活化"转谷氨酷胺酶是指不是蛋白酶水 解激活的转谷氨酷胺酶，例如当因子XIII在凝血酶(凝血酶具有蛋白水解切割FXHI的能 力)不存在时被激活，便被称为非蛋白酶水解活化;有关参考文献可参见例如化Igar J.等， Biochem J 1990;267:557-600Muszbek L.等，Ilirombosis Research 94(1999)271-305。作 为FXIII的降解产物的非蛋白酶水解活化因子XIII(FXIIr )不利于FXHI药物组合物的效 力(viability),因为一般认为运种降解产物会出现严重的毒性风险。
[0026] 本文使用的术语"生物活性"是指在生物中具有活性，例如医学活性、农业活性或 美容活性。
[0027] 本发明的术语"含水组合物"是指包含液体水分的组合物。运类组合物通常是溶液 或悬浮液。用于本
【发明内容】
的术语"含水组合物"是指包含W重量计至少50% (重量/重量） 的水的制剂。
[0028] 本发明的术语"稀释剂"是指液体溶液或悬浮液。用于本
【发明内容】
的术语"稀释剂" 是指包含W重量计至少50% (重量/重量)水的溶液或悬浮液。在本发明的情况下，稀释剂用 于干燥转谷氨酷胺酶组合物的复溶。
[0029] 所有参考文献，包括本文引用的出版物、专利申请和专利都通过引用其整体特此 结合，其程度与每个参考文献单独而具体指明通过引用结合一样，并W其整体列举在本文 中（至法律允许的最大程度）。
[0030] 所有标题和副标题在本文中仅出于方便而使用，不应解释为W任何方式限制本发 明。
[0031] 本文提供的任何和全部实例或示例性语言(诸如"例如"）的使用，仅仅是为了更好 地说明本发明，并非对本发明的范围提出限制，除非另有要求。本说明书中的任何语言都不 应解释为表示任何非要求保护的要素是实施本发明必需的。
[0032] 本文对专利文件的引用和结合只是出于方便，并不反映对运类专利文件的有效 性、专利性和/或可实施性有任何观点。
[0033] 本发明包括适用法律所允许的随附权利要求书中所述主题的所有修改和等同内 容。
[0034] 发明详述
[0035] 本发明提供转谷氨酷胺酶组合物，具体地讲是稳定的冻干或喷雾干燥的转谷氨酷 胺酶(例如凝血因子Xin(FXIII))组合物。本发明还提供制备所述干燥转谷氨酷胺酶组合 物、复溶溶液、药物组合物的方法及治疗方法。
[0036] 本发明提供包含转谷氨酷胺酶(例如因子XIII)的产品，其具有在整个转谷氨酷胺 酶产品的制备过程、胆存和使用期间均可接受的纯度水平和前激活水平。
[0037] 就前激活水平和总纯度而论，提供稳定性改进的本发明的组合物包含干燥转谷氨 酷胺酶组合物，所述组合物可通过将包含转谷氨酷胺酶、盐和至少一种另外选自糖、氨基酸 和缓冲液的组分的含水组合物冻干或喷雾干燥而获得，其中含水组合物中盐的浓度范围为 5-lOOmM。
[003引在一个实施方案中，本发明的干燥组合物包含干燥转谷氨酷胺酶组合物，所述组 合物可通过将包含转谷氨酷胺酶、盐和至少一种另外选自糖、氨基酸和缓冲液的组分的含 水组合物冻干或喷雾干燥而获得，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-lOOmM，前提条件是 组合物不是通过将含有0.5%化Cl和2.25%甘氨酸的因子XIII溶液冻干而获得的干燥因子 XIII组合物。
[0039] 在一个实施方案中，本发明的干燥组合物不含任何蛋白质稳定剂，例如白蛋白。
[0040] 下述实施方案和实施例主要描述和公开了重组FXIII (rFXII I)的组合物，但是本 发明并不限于运些实施方案和实施例，而是可适用于目前已知的或未来开发的任何转谷氨 酷胺酶的组合物。
[0041 ] 组合物的组分
[0042]本发明的组合物包含转谷氨酷胺酶。可通过本发明的制剂稳定的转谷氨酷胺酶的 实例包括但不限于因子XIII、表皮转谷氨酷胺酶、II型转谷氨酷胺酶(组织型转谷氨酷胺 酶、肝转谷氨酷胺酶)和I型转谷氨酷胺酶(角质形成细胞转谷氨酷胺酶）。
[00创 因子XIII
[0044] 在一个实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物包含因子XIII化合物。因子 XIII化合物可W是例如天然野生型因子XIII和因子XIII的天然等位变异体。运些FXIII化 合物可W来源于例如人或其它动物源，例如人FXIII、猪FXIH和牛FXIII。人因子XIII的野 生型序列可参见例如EP 268772和EP 236978。本发明的因子XIII化合物，包括完整的因子 XIII酶原四聚体(A2B2)和因子XII Ia及其亚基，包括A亚基和A2二聚体。
[0045] 本发明的因子XIII化合物可W是例如保持至少部分野生型因子XIII特有的交联 活性的因子XIII的生物活性片段、衍生物或变体。运种交联活性可通过本领域已知方法测 定。
[0046] 在一些实施方案中，因子XIII的生物活性片段、衍生物或变体保持10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的野生型因子XIII的交联活性。
[0047] 因子XIII的片段、衍生物和变体包括取代、插入和缺失变体。插入变体包含氨基端 和/或簇基端融合W及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。例如，可将插入残基引入野生 型因子XIII蛋白的成熟编码序列内。缺失变体的特征在于从野生型因子XIII蛋白除去一个 或多个氨基酸残基。一般在编码蛋白质的DNA的核巧酸中通过位点专一诱变来制备运些变 体，从而产生编码变体的DNA，之后在重组细胞培养物中表达所述DNA。然而，还可W通过体 外合成制备变体蛋白质片段。虽然引入氨基酸序列变异的位点通常是预先确定的，但是突 变本身不是预先确定的。例如，为了使在指定位点的突变性能最优化，可W在目标密码子或 目标区进行随机诱变，并筛选表达蛋白质变体所需活性的最优组合。在具有已知序列的DNA 的预定位点上进行取代突变的技术是众所周知的，例如M13引物诱变。取代变体是其中除去 至少一个残基序列并在其位置上插入不同残基的变体。氨基酸取代通常为单一残基的取 代;插入一般约为1-10个氨基酸残基;缺失的范围可约为1-30个残基。例如，缺失或插入可 W相邻的一对进行，即2个残基的缺失或2个残基的插入。可W结合取代、缺失、插入或其任 何组合W得到最终的构建体。显然，将在编码变体蛋白质的DNA中产生的突变不必把该序列 置于读框外，且优选将不会产生可形成二级HiRNA结构的互补区。经遗传工程改造的因子 XIII的变体的一个实例是野生型人因子XIII的化13化eu变体（即其中野生型人因子XIII氨 基酸序列第34位的化1残基被亮氨酸残基置换的变体）。
[004引本发明的因子XIII可从多种生物材料中提纯，包括天然产生因子XIII的细胞的裂 解物、匀浆物或提取物，而且还包括通过遗传工程修饰W产生因子XIII的细胞，例如用因子 XIII编码DNA转化的酵母细胞。提纯因子XIII的方法的实例可参见W0/2006/021584。
[0049] 本发明的因子XIII可W通过例如重组DNA技术来制备。制备重组因子XIII的方法 是本领域已知的。参见例如Davi e等，EP 268,772; Grun血ann等，AU-A-69896/87; Bi shop等， Biochemistry 1990,29:1861-1869;Board等，Thromb.Haemost.1990，63:235-240; Jagadeeswaran等，Gene 1990，86: 279-283; W及Bt湖ter 等，FEBS Lett. 1989，248:105- 110。在一个实施方案中，因子XIII A2二聚体在酵母酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)的细胞质中制备，参见美国专利申请顺序号07/741263。收获细胞后裂解，制备 澄清的裂解液。在中性到略微碱性的pH下，使用衍生化琼脂糖柱，例如DEAE化St-Flow Sepharose?(Pharmacia)等，通过阴离子交换层析法对裂解液进行分级分离。然后将洗脱液 浓缩，并通过例如用班巧酸锭缓冲液渗滤调节pH至5.2-5.5,从而使因子XIII从柱洗脱液中 沉淀出。然后将沉淀物溶解，并采用常用层析技术(例如凝胶过滤和疏水相互作用层析法） 进一步纯化。
[0050] 在本发明的一个实施方案中，因子XIII是重组因子XIII。在本发明的一个实施方 案中，因子XIII是人因子XIII。在本发明的一个实施方案中，因子XIII是重组人因子XIII。 在本发明的一个实施方案中，因子XIII是A亚基的二聚体。
[0051] 在待冻干或喷雾干燥的含水组合物中，因子XIII的浓度可在例如一个大的范围内 变化，在一个实施方案中范围为0.003-100mg/ml，在进一步的实施方案中范围为l-30mg/ ml,在更进一步的实施方案中范围为2-15mg/ml。
[00对莖
[0053] 本发明的含水组合物包含盐或盐的混合物。盐用来改进干燥组合物在前激活W及 总纯度方面的稳定性。本发明的稀释剂可包含例如盐或盐的混合物。在一些实施方案中，盐 为一价盐。例如，可W使用的一价盐的实例包括但不限于氯化钢、氯化钟、乙酸钢、硫酸钢、 葡糖酸钢及其混合物。在一些实施方案中，盐为二价盐。在一些实施方案中，盐为二价盐，前 提条件是二价盐不是化(II)盐。
[0054] 例如，所采用的盐(例如化Cl)的浓度可在一定范围内变化，在一个实施方案中，范 围为 5-lOOmM，在进一步的实施方案中，范围为 5-99mM、7-95mM、8-90mM、10-80mM、15-70mM、 25-75mM和20-60mM，在更进一步的实施方案中，范围为25-50mM。
[00巧]糖和糖醇
[0056] 在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物包含一种或多种糖 或糖醇。例如，用于干燥组合物复溶的稀释剂可包含一种或多种糖或糖醇。在本发明的干燥 组合物中，糖或糖醇可用于在冷冻干燥期间通过防止物理/化学失稳效应(例如解折叠)而 使蛋白质稳定。例如，可W使用的糖或糖醇的实例包括但不限于薦糖、甘露糖、海藻糖、乳 糖、麦牙糖、山梨醇、棉子糖、糊精、环糊精及其衍生物、类似物和混合物。
[0057] 所使用的糖和糖醇的浓度范围可在例如大的范围变化，在一个实施方案中的范围 为0.1-15% (重量/重量），在进一步的实施方案中的范围为0.1-8.5% (重量/重量），在更进 一步的实施方案中的范围为0.5-5.0% (重量/重量）。
[005引 氨基酸
[0059]在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物包含一种或多种氨 基酸。在本发明的一些实施方案中，用于干燥组合物复溶的稀释剂可包含一种或多种氨基 酸。例如，可W使用氨基酸W改进冻干或喷雾干燥组合物的稳定性。在一个实施方案中，使 用一种或多种氨基酸来降低组合物胆存期间转谷氨酷胺酶(例如FXIII)聚集体的形成。可 W使用的氨基酸的实例包括但不限于甘氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、 赖氨酸、丙氨酸、异亮氨酸和半脫氨酸(617、化3、4'肖、6111、16*、1'虹、1^73、41日、116和切3)及 其盐、衍生物、类似物、二聚体、寡聚体和混合物。
[0060] 合适的衍生物和类似物是众所周知的。合适的衍生物包括但不限于:簇基的醋、硫 醋和酷胺;氨基的酷化衍生物，包括氨基甲酸醋衍生物;及侧链官能团的醋、酷胺和醋。合适 的类似物包括例如鸟氨酸(赖氨酸的类似物）、高丝氨酸和Q-氨基下酸。生理上可接受的盐 也是本领域众所周知的，可参见例如Remington's化armaceutical Science:D;rug Receptors and Receptor Theory，（第十八片反.），Mack Publishing Co . ,Easton Pa. (1990)。
[0061] 使用的氨基酸的浓度可在例如0.01-10% (重量/重量)的范围或在0.1-3% (重量/ 重量)的范围变化。
[006。缓冲液
[0063] 在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于干燥组 合物复溶的稀释剂包含缓冲液。缓冲液是包含某一物质的溶液，当向该溶液中加入少量酸 或碱时，所述物质能够防止溶液的pH发生明显变化，从而在很大程度上保持溶液的原酸度 或碱度。缓冲液通常包含弱酸或弱碱及其盐。
[0064] 含水组合物的pH的范围可为2-10,特别介于7和8之间。上述氨基酸或pH范围为2- 10的缓冲液可用来促进缓冲效果。例如可W使用的缓冲液的实例包括但不限于乙酸盐缓冲 液、碳酸盐缓冲液、巧樣酸盐缓冲液、甘氨酷甘氨酸缓冲液、组氨酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、 赖氨酸缓冲液、精氨酸缓冲液、憐酸盐缓冲液(含有例如憐酸二氨钢、憐酸氨二钢或憐酸= 钢）、TRIS[S(^甲基)氨基甲烧]缓冲液、N-二巧圣乙基)甘氨酸缓冲液、N-S(^甲基）甲基 甘氨酸缓冲液、苹果酸盐缓冲液、班巧酸盐缓冲液、马来酸盐缓冲液、富马酸盐缓冲液、酒石 酸盐缓冲液、天冬氨酸盐缓冲液及其混合物。在一些实施方案中，使用巧樣酸盐缓冲液、组 氨酸缓冲液、憐酸钢缓冲液、班巧酸盐缓冲液和TRIS缓冲液。在一个实施方案中，使用组氨 酸。
[0065] 所使用的缓冲液的浓度可为例如O-SOmM的范围，或0-25mM的范围。
[0066] 其它组分
[0067] 还可将一种或多种其它组分渗入待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶 干燥组合物的稀释剂中。运类另外的成分包括但不限于非离子型表面活性剂、还原剂、馨合 剂、抗氧化剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、填充剂、张力调节剂（t O n i C i t y m O d i f i e r / tonicity-adjusting agents)、油性溶媒、蛋白质（例如人血清白蛋白、明胶或其它蛋白质） 和两性离子物质（例如甜菜碱、牛横酸或氨基酸例如精氨酸、甘氨酸、赖氨酸或组氨酸）。当 然，运类另外的成分不应对本发明的含水组合物或干燥组合物的总体稳定性产生不利影 响。在运方面，可参照Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版，1995。 [00側非离子型表面活性剂
[0069]在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含非离子型表面活性剂。离子型表面活性剂是通过屏蔽蛋白质的临界 面(例如包裹、固体(solids))而起作用的表面活性剂，可W使用离子型表面活性剂例如改 进冻干或喷雾干燥组合物的稳定性。例如，可W使用的非离子型表面活性剂的实例包括但 不限于吐溫80、吐溫20、PEG、嫁蜡醇、PVP、PVA、羊毛脂醇、失水山梨醇单油酸醋、泊洛沙姆和 聚氧乙締烷基酸。在一个实施方案中，使用吐溫20。
[0070] 例如，所使用的非离子型表面活性剂的浓度可为0.00001-5% (重量/重量）的范 围，或0.0002%和0.1 % (重量/重量)的范围。
[0071] 还原剂
[0072] 在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含还原剂。使用还原剂(例如抗氧化剂）W除去可破坏蛋白质稳定的自 由基。可W使用的还原剂的实例包括但不限于半脫氨酸、N-乙酷基-半脫氨酸、硫代甘油、硫 化钢、生育酪和谷脫甘肤。
[007引馨合剂
[0074]在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含馨合剂。馨合剂用于除去制剂中的金属(铁、铜），并且通常有助于保 护蛋白质免受金属催化的反应。例如，可W使用的馨合剂的实例包括但不限于邸TA的盐、巧 樣酸和天冬氨酸及其混合物。在本发明的一个实施方案中，馨合剂的浓度为O.lmg/ml到 5mg/ml。在本发明的一个实施方案中，馨合剂的浓度为0.1 mg/ml到2mg/ml。在本发明进一步 的实施方案中，馨合剂的浓度为2mg/na到5mg/ml。
[00对抗氧化剂
[0076] 在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含抗氧化剂。在一个实施方案中，含水组合物包含甲硫氨酸(或另一种 含硫氨基酸或氨基酸类似物），当转谷氨酷胺酶(例如FXIII)是包含至少一个易于氧化成其 亚讽形式的甲硫氨酸残基的多肤时，抑制甲硫氨酸残基的运类氧化。术语"抑制氧化"是指 氧化类物质（甲硫氨酸)随时间的积累最小化。甲硫氨酸氧化的抑制导致多肤更多地保持其 适当的分子形式。例如，可W使用甲硫氨酸的任何立体异构体化、D或DL异构体)或其组合。 待添加的量应为足W抑制甲硫氨酸残基氧化的量，使得甲硫氨酸的亚讽形式的量是管理机 构可接受的。运通常意味着组合物含有约10%-约30% W内的甲硫氨酸亚讽形式。运一般可 通过例如按致使加入的甲硫氨酸与甲硫氨酸残基的摩尔比为约1:1 -约1000:1、例如1〇:1- 约100:1的范围的量加入甲硫氨酸来实现。
[0077] 防腐剂
[0078] 在本发明的一些实施方案中，待冻干或喷雾干燥的含水组合物和/或用于复溶干 燥组合物的稀释剂包含防腐剂。可按管理机构对多剂量容器内容物的要求加入防腐剂。防 腐剂被用作抗微生物剂，W免在从小瓶中抽取多剂量时受微生物污染。例如，可使用的防腐 剂的实例包括但不限于苯酪、邻甲酪、间甲酪、对甲酪、氯甲酪、对径基苯甲酸甲醋、对径基 苯甲酸乙醋、对径基苯甲酸丙醋、对径基苯甲酸下醋、2-苯氧乙醇、2-苯基乙醇、苯甲醇、= 氯叔下醇、硫柳隶、漠硝丙二醇、苯甲酸、咪挫烧脈、氯己定(Chlorohexidine)、脱氨醋酸钢、 节索氯锭、氯苯甘酸（3-对氯苯氧基丙烷-1,2-二醇）及其混合物。例如，防腐剂的浓度为 0.1 mg/ml到20mg/ml。在本发明的一个实施方案中，防腐剂的浓度为0.1 mg/m巧Ij5mg/ml。在 本发明进一步的实施方案中，防腐剂的浓度为5mg/ml到lOmg/ml。在本发明另一个实施方案 中，防腐剂的浓度为lOmg/na到20mg/ml。
[0079] 本领域的技术人员能够使用下述方法，仅用常规实验方法便能分析本发明的干燥 组合物或含水组合物中一种或多种添加组分对稳定性、前激活和纯度的作用。
[0080] 干燥组合物一粉末
[0081 ]在冻干或喷雾干燥后，本发明的组合物为干燥形式。例如，本发明的干燥组合物可 W为固体、粉末或粒状物。在一个实施方案中，本发明的干燥组合物为粉末。在胆存期间，该 干燥组合物中残留水分的水平对干燥转谷氨酷胺酶(例如FXIII)的稳定性十分重要。在本 发明的一个实施方案中，干燥组合物含有3% W下的残留水分。在进一步的实施方案中，干 燥组合物含有1 % W下的残留水分。
[0082] 干燥技术和复溶
[0083] 本发明的含水组合物的冻干和喷雾干燥可W采用本领域技术人员熟知的冻干和 喷雾干燥方法进行：有关冻干法参见例如Wi 11 iams和Pol 1 i (1984)，J .化renteral Sci .Technol. 38:48-59。有关喷雾干燥法参见例如Masters，载于Spra}f-Drying 化n化ook (第5版；Lon邑 man Scientific and Technical , Essex , U. K . , 1991)，第491-676页； Broa化ead等（1992)D;rug Devel.Ind.Pharm.18:1169-1206;W及Mumenthaler等（1994) Pharm.Res. 11:12-20。还可采用其它干燥技术，例如风干，参见(^!rpenter和Crowe(1988)， Cryobiology 25:459-470; W及Rose;r( 1991 )Bio地arm.4:47-53。
[0084] 至于本发明，当提及冻干和喷雾干燥时，还包括可W采用的其它干燥技术。例如， 本发明的表述"待冻干或喷雾干燥的含水组合物"也包括"待用其它干燥技术干燥的含水组 合物'。
[0085] 在一个实施方案中，本发明的干燥组合物通过冻干获得。冻干方法通常包括下列 步骤:冷冻步骤、初步干燥步骤和再次干燥步骤。在冷冻步骤中，使含水组合物冷却。选择运 类冷冻步骤的溫度和持续时间，使得组合物中的所有组分完全冻结。例如，合适的冷冻溫度 约为-40°C。在初步干燥步骤中，在低溫下真空升华除去冷冻期间结的冰。例如，用于升华的 内腔压力可为例如约40mTorr-400mTorr，溫度可为例如-30°C至-5°C之间。在初步干燥后， 未能通过升华除去的任何残留量的液体都通过再次干燥（即解吸）除去。在再次干燥期间， 溫度接近或大于环境溫度。
[0086] 在本发明的一个实施方案中，在冻干期间的冷冻步骤中引入退火处理 (annealing)(加热步骤）。运种加热使得溫度在制剂的冷冻点W下。运种退火(加热步骤)可 进一步使本发明的干燥组合物稳定。
[0087]
[0088] 在需要时，例如当给予患者转谷氨酷胺酶(例如FXIII)时，本发明的干燥组合物可 用稀释剂复溶。复溶一般在25°C左右的溫度下进行，W确保完全水合，但是需要时可采用其 它溫度。复溶所需时间将取决于例如稀释剂的类型W及转谷氨酷胺酶和其它组分的量。
[0089] 在本发明的一个实施方案中，稀释剂是蒸馈水。例如，使用蒸馈水可具有优势，因 为不需要制备单独定制的稀释剂。
[0090] 在本发明的一个实施方案中，稀释剂是乙醇。
[0091] 在本发明的一个实施方案中，稀释剂例如可包含一种或多种组分，例如盐、糖、氨 基酸、缓冲液、非离子型表面活性剂、还原剂、馨合剂、抗氧化剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、填 充剂、张力调节剂、油性溶媒、蛋白质（例如人血清白蛋白、明胶或其它蛋白质）和两性离子 物质。稀释剂包括的组分和运些组分的量取决于通过运些组分要达到的理想效果。稀释剂 的实例包括但不限于注射用抑菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如憐酸缓冲盐溶液）、无菌盐溶 液和葡萄糖溶液。
[0092] 复溶溶液中蛋白质浓度为至少5mg/ml，例如约lOmg/ml-约400mg/ml、约20mg/ml- 约200mg/ml或约30mg/ml-约150mg/ml。如果从皮下递送复溶溶液，则复溶溶液中的高蛋白 质浓度被视为是特别有益的。然而，对于其它给药途径，例如静脉内给药，在复溶溶液中可 能需要较低的蛋白质浓度(例如复溶溶液中的蛋白质约5-50mg/ml或约10-40mg/ml)。在某 些实施方案中，复溶溶液中的蛋白质浓度比预干燥制剂中的显著较高。例如，复溶溶液中的 蛋白质浓度可W是预干燥含水组合物的约2-40倍、3-10倍和/或3-6倍(例如至少3倍或至少 4倍)。
[0093] 在本发明的一个实施方案中，例如包含因子XIII的干燥转谷氨酷胺酶组合物胆存 3年W上是稳定的，且复溶溶液使用6周W上是稳定的。在本发明的一个实施方案中，例如包 含因子XIII的干燥转谷氨酷胺酶组合物胆存2年W上是稳定的，且复溶溶液使用4周W上是 稳定的。在本发明的一个实施方案中，例如包含因子XIII的干燥转谷氨酷胺酶组合物胆存1 年W上是稳定的，且复溶溶液使用2周W上是稳定的。在本发明的一个实施方案中，不超过 1%的复溶因子XIII组合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。在本发明的一个实施方案中，不 超过0.5%的复溶因子XIII组合物是非蛋白酶水解活化因子XIII。
[0094] 示例性变化方案
[0095] 表1和表2是本发明的示例性变化的非限制性表。
[0096] 表1:示例性变化的非限制性列表
[0100]
[0101] 药物组合物
[0102] 本发明提供包含转谷氨酷胺酶(例如因子XIII)的药物组合物。该药物组合物包含 本发明的复溶溶液或干燥组合物。
[0103] 在一个实施方案中，药物组合物是由医生或患者在临用前加入稀释剂复溶的干燥 组合物(例如冷冻干燥或喷雾干燥组合物）。
[0104] 含有转谷氨酷胺酶(例如因子XIII)的本发明的药物组合物可W通过若干不同的 途径给予需要运类治疗的患者，例如局部(例如用于皮肤或黏膜）、通过避开吸收的途径(例 如在动脉中、静脉中或屯、脏内给药)及通过设及吸收的途径(例如在皮肤中、皮肤下、肌肉内 或腹部给药）。
[0105] 可W通过各种给药途径给予有需要的患者本发明的药物组合物，例如舌、舌下、口 腔、口服、胃或肠内、鼻、肺(例如通过细支气管和肺泡或两者）、表皮、真皮、经皮、阴道、直 肠、眼（例如通过结膜）、尿道或胃肠外。
[0106] 可W各种剂型给予本发明的药物组合物，例如溶液剂、混悬剂、乳剂、微乳剂、复合 型乳剂、泡沫制剂、油膏剂、糊剂、硬膏剂、软膏剂、片剂、包衣片、漱洗剂(rinse)、胶囊剂(例 如硬明胶胶囊剂或软明胶胶囊剂）、栓剂、直肠胶囊剂、滴剂、凝胶剂、喷雾剂、散剂、气雾剂、 吸入剂、滴眼剂、眼用软膏剂、眼用冲洗剂(0地thalmic rinse)、阴道栓剂、阴道环、阴道软 膏剂、注射溶液剂、原位转化溶液剂（in situ trans化rming solution)(例如原位胶凝、原 位沉积（in situ setting)、原位沉淀或原位结晶）、输注溶液剂或植入物。
[0107] 本发明的药物组合物还可W(例如通过共价、疏水或静电相互作用）与药物载体、 药物递送系统或高级药物递送系统混合、结合或缀合，W进一步提高转谷氨酷胺酶(例如因 子XIII)的稳定性、提高生物利用度、提高溶解度、降低不良反应、实现本领域技术人员熟知 的择时治疗和/或提高患者依从性。载体、药物递送系统和高级药物递送系统的实例包括但 不限于聚合物，例如纤维素及其衍生物、其它多糖(例如葡聚糖及其衍生物、淀粉及其衍生 物）、聚乙締醇、丙締酸醋和甲基丙締酸醋聚合物、聚乳酸和聚乙醇酸及其嵌段共聚物、聚乙 二醇、载体蛋白（例如白蛋白）、凝胶(例如热凝胶系统，例如本领域技术人员熟知的嵌段共 聚物系统）、微团、脂质体、微球、纳米颗粒、液晶及其分散体、脂质-水系统的相特征领域技 术人员熟知的L2相及其分散体、聚合物微团、复乳（自乳化和自微乳化）、环糊精及其衍生物 和树状聚体。
[0108] 本发明的药物组合物适用于使用例如定量吸入器、干粉吸入器或雾化器(所有运 些是本领域技术人员熟知的装置)经肺给药的固体、半固体、粉末和溶液制剂。
[0109] 本发明的药物组合物适用于W控释、缓释、延迟释放、迟滞释放或慢速释放药物递 送系统的制剂使用。本发明的药物组合物可用于例如本领域技术人员熟知类型的胃肠外控 释和缓释系统(两种系统导致给药次数成倍减少)的制剂，例如用于皮下给药的控释和缓释 系统。在不限制本发明范围的情况下，有益的控释系统和组合物的实例为水凝胶、油质凝 胶、液晶、聚合物微团、微球和纳米微粒。生产用于本发明药物组合物的控释系统的方法包 括但不限于结晶、缩合、共结晶、沉淀、共沉淀、乳化、分散、高压均化、胶囊化、喷雾干燥、微 囊化、凝聚、相分离、溶剂蒸发产生微球、挤出和超临界流体方法。一般参考文献参见 Handbook of Pharmaceutical Controlled Release(Wise，D丄.主编，Marcel Dekker,New York,2000WDrugs and the Pharmaceutical Sciences，第99卷：Protein Formulation and Delivery(MacNally，E.J.主编，Marcel Dekker，化W York,2000)。
[0110] 胃肠外给药可用注射器(例如笔型装置的注射器)通过皮下、肌内、腹膜内或静脉 内注射进行。或者，胃肠外给药可W通过例如输注累进行。W溶液剂或混悬剂形式给予本发 明的药物组合物的又一选择是作为鼻或肺喷雾剂给予。作为另一种选择，本发明的药物组 合物可适于经皮给药，例如通过无针注射、通过贴剂(例如离子导入贴剂)或经黏膜(例如口 腔)给药。
[0111] 对本发明来说，W其各种语法形式的术语"治疗"是指治愈、逆转、减轻、缓解、改 善、抑制、减至最小、阻止或中止(1)疾病的有害作用，（2)疾病进程，或(3)致病因子。
[0112] 在本发明的情况下，"有效量"的药物组合物的定义是药物组合物(例如因子XIII) 的量足W单独或与其它所给予的治疗剂组合预防、治愈、逆转、减轻、缓解、改善、抑制、减至 最小、阻止、或中止(1)疾病的有害作用，（2)疾病进程，或(3)致病因子。
[0113] 研究表明，因子XIII可用于治疗或预防患有先天性因子XIII缺陷症的患者W及未 患先天性因子XIII缺陷症的患者的出血事件，参见例如US 5.1 14.916、US 5.607.917、W0 2002038167、W0 2002036155、W0 200267981和WO 200267980。
[0114] 本发明提供用于治疗或预防出血事件的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗 者有效量的包含FXHI的本发明的药物组合物。在进一步的实施方案中，本发明设及用于缩 短受治疗者的凝血时间的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者本发明的药物组合 物。在进一步的实施方案中，本发明设及用于延长哺乳动物血浆中血块溶解时间的方法，所 述方法包括给予有需要的受治疗者本发明的药物组合物。在进一步的实施方案中，本发明 设及用于增加哺乳动物血浆中血块强度的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效 量的本发明的药物组合物。在进一步的实施方案中，本发明设及增强哺乳动物血浆中血纤 蛋白凝块形成的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的本发明的药物组合 物。在进一步的实施方案中，本发明设及用于预防早产婴儿的脑室出血的方法，所述方法包 括给予有需要的受治疗者有效量的本发明的药物组合物。在进一步的实施方案中，本发明 设及用于在手术期间或手术后减少受治疗者的手术相关失血的方法，所述方法包括给予有 需要的受治疗者有效量的本发明的药物组合物。在进一步的实施方案中，本发明设及用于 治疗血友病A的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的本发明的药物组合物。 在进一步的实施方案中，本发明设及用于治疗血友病B的方法，所述方法包括给予有需要的 受治疗者有效量的本发明的药物组合物。在进一步的实施方案中，本发明设及用于治疗血 小板疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的本发明的药物组合物。在 进一步的实施方案中，本发明设及用于治疗冯威勒布兰特氏病（von Wi Ilebrand ' S disease)的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的本发明的药物组合物。
[0115] 本发明的药物组合物当包含FXHI时，还可用于全身或局部使用W治疗疾病，包括 骨愈合或伤口愈合、溃瘍性结肠炎、硬皮病（SChleroderma)、舍恩莱因-亨诺赫紫齋 (Scholein Henoch PU巧ura)、蛛网膜下腔出血（subarchnoidal hemorrhage)、脑室出血和 不明原因出血。
[0116] 在运些方法进一步的实施方案中，本发明的药物组合物(例如包含因子XIII)按WO 200185198中所述方法与有效量的因子Vila组合给予。
[0117] 在一些实施方案中，本发明的药物组合物是给予受治疗者的唯一活性剂用于规定 疗法。
[0118] 在一个实施方案中，待治疗的受治疗者是人;在一个实施方案中，受治疗者患有凝 血酶产生减少;在一个实施方案中，受治疗者的血纤蛋白酶原的血浆浓度下降（例如多次输 血的雙治疗者的情况）。
[0119] 参照下列实施例可W更容易地理解W此概述的本发明，实施例W实例方式提供， 并不意味着是对本发明的限制。 实施例
[0120] 为了开发本发明的组合物，研究了多种组合物及其在胆存期间对组合物后续稳定 性的作用。
[0121 ]实施例1:因子XIII的冻干和复溶
[0122] 冷冻干燥实验在市售可得的冻干机中进行。根据合适的冷冻干燥程序，将在酵母 细胞中表达而制备的重组因子XIII溶液与其它组分一起干燥。然后用蒸馈水将冻干物复 溶。
[0123] 实施例2:干燥因子XIII组合物的稳定性
[0124] 按照实施例1，通过冻干制备一系列的干燥rFXIII组合物，并进行了稳定性研究， 其中通过AIE-HPLC测定了纯度，通过SEC-HPLC测定了聚集体。该项研究分析了灌装水溶液 中所包括的S种NaCl水平:OmM、12.5mM和25mM NaCl，W及四种薦糖水平，参见表3和表4。
[0125] 表3:在NaCl存在和不存在时对组合物进行的研究
[0126]
[0127]表4:薦糖和NaCl的含量
[01
[01
[01
[0131] 表5和图I中所给出的结果表明，于40°C胆存的样品在NaCl与AIE-HPLC纯度之间有 统计显著性关系。对样品的初始纯度没有影响。因此，可W得出结论，化Cl特异性对干燥状 态（即干燥组合物)起作用，从而显著改进干燥rFXin组合物的胆存稳定性。
[0132] 实施例3:全析因研究
[0133] 本研究的目的在于对rFXin的冻干制剂进行初步筛选实验，W研究在冻干时组氨 酸和氯化钢对rFXIIIa°形成的作用。利用实验的全析因设计来评价干燥rFXIII组合物中 20-60mM范围内的组氨酸浓度和O-SOmM范围内的NaCl浓度。
[0134] 表6:实验因素
[0135：
[0136] 表7:结果表
[0137]
[0138] 表7及图2和图3所给出的结果表明，加入化Cl对分别于40°C和25°C胆存达I个月和 2个月的样品的纯度及对rFXIIIa°形成具有显著的稳定效应。在起始时间点上加入化Cl对 样品没有显著作用。于25°C2个月后，本文研究的化Cl和组氨酸水平对通过SE-HPLC得到的 聚集体水平没有显著影响。本研究表明，就％纯度和％rFXIIIa°而言，在干燥rFXnI组合物 中包括NaCl显著改进组合物的胆存稳定性。
[0139] 实施例4:复溶研究
[0140] 进行了本实验W证实化Cl的稳定效应是干燥状态（即干燥组合物)特有的。在本项 实验中，将一小瓶冻干rFXIII组合物用水复溶，然后分成等体积的两份，向其中加入一份 化Cl。将该溶液室溫胆存24小时，然后分析rFXIIIa°。对S种浓度的化Cl进行了评价。实验 设计见下表8。
[0141] 表8:实验设计一溶液中NaCl对rFXII Ia°形成的作用
[0142]
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[01
[0145] 表9给出的结果表明，与相应的不含NaCl的对照溶液相比，在24小时后含有化Cl的 样品具有略高的巧乂111曰°值。运些结果表明，就重。乂111曰°形成而言，在浓度范围25-75mM内， 含水组合物中的NaCl不具有稳定效应。可W得出结论，如上述实施例的数据所证实的，化Cl 在冻干rFXn I组合物中的稳定效应是干燥状态(干燥组合物)特异性的。运种效应是出人意 料的，而且在此之前无人知晓。
[0146] 测定法
[0147] 测定法（I):测定FXIIIa°的方法
[014引为了研究冻干对FXIIIa。的量的作用，可W通过酶促FXIII活性测定法(enzymatic FXIII activity assay)对纯的重组因子XIII进行分析，其中将没有起始凝血酶活化的等 分样品与另一等分量的加入凝血酶的相同样品进行比较，来测定FXIIIa°活性。％FXIIIa° 用100*[无凝血酶的样品活性]/[具有凝血酶的样品的活性]计算。
[0149] 测定法（II):测定FXHI纯度的方法
[0150] 为了研究冻干对FXIII的纯度的作用，可通过阴离子交换高效液相层析法(AIE- HPLC)对纯的重组FXHI进行分析。
[0151] 测定法（III):测定FXHI活性的方法
[0152] 测定FXIII交联活性的方法是本领域众所周知的。FXHI活性可W使用市售可得的 试剂盒例如Beric虹om FXIIIR试剂盒来测定。
[0153] 测定法(IV):测定水分含量的方法
[0154] 为了研究干燥转谷氨酷胺酶（例如FXI11)组合物的水分含量，可W采用Kar 1 Fischer滴定法。
[01W]本发明的优选特征：
[0156] 14.干燥转谷氨酷胺酶组合物，所述组合物可通过将含水组合物冻干或喷雾干燥 获得，所述含水组合物包含转谷氨酷胺酶、盐和至少一种另外的选自糖、氨基酸和缓冲液的 组分，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-lOOmM。
[0157] 15.第1项的组合物，其中所述转谷氨酷胺酶是因子XIII化合物。
[015引16.第2项的组合物，其中因子XIII化合物是人因子XIII。
[0159] 17.第2-3项中任一项的组合物，其中所述因子XIII化合物是重组因子XIII。
[0160] 18.第2-4项中任一项的组合物，其中所述因子XIII化合物是A亚基的二聚体。
[0161] 19.第2项的组合物，其中所述因子XIII化合物选自因子XIII及其保持至少部分野 生型因子XIII的特有交联活性的生物活性片段、衍生物和变体。
[0162] 20 .第1 -6项中任一项的组合物，其中所述因子XIII化合物的浓度范围为1 -约 lOOmg/ml。
[0163] 21.第1-7项中任一项的组合物，其中所述盐是一价盐。
[0164] 22.第8项的组合物，其中所述一价盐是氯化钢盐。
[01化]23.第1 -9项中任一项的组合物，其中含水组合物中所述盐的浓度范围为10-7 5mM。
[0166] 24.第10项的组合物，其中含水组合物中所述盐的浓度范围为20-60mM。
[0167] 25.第1-11项中任一项的组合物，其中所述含水组合物包含糖，且其中所述糖是选 自薦糖、甘露糖、海藻糖、乳糖、麦牙糖、山梨醇、棉子糖、糊精、环糊精的糖或糖醇及其衍生 物、类似物和混合物。
[0168] 26.第12项的组合物，其中所述糖和糖醇的浓度介于0.1%和8.5% (重量/重量)之 间。
[0169] 27.第1-13项中任一项的组合物，其中所述含水组合物包含氨基酸，且其中所述氨 基酸选自甘氨酸、组氨酸和精氨酸。
[0170] 28.第1-14项中任一项的组合物，其中所述含水组合物包含缓冲液，且其中所述缓 冲液选自巧樣酸盐、组氨酸、憐酸钢、班巧酸盐和TRIS。
[0171] 29.第1-15项中任一项的组合物，其中所述含水组合物还包含一种或多种选自W 下的其它组分:非离子型表面活性剂、还原剂、馨合剂、抗氧化剂、防腐剂、润湿剂、乳化剂、 填充剂、张力调节剂和两性离子物质。
[0172] 30.第1-16项中任一项的组合物，其中所述组合物是粉末形式。
[0173] 31.第1-17项中任一项的组合物，其中所述干燥组合物含有3% W下的水分含量。
[0174] 32.第18项的组合物，其中所述干燥组合物含有1% W下的水分含量。
[0175] 33.制备第1-19项中任一项的干燥组合物的方法，所述方法通过将包含转谷氨酷 胺酶、盐和至少一种另外的选自糖、氨基酸和缓冲液的组分的含水组合物干燥，其中所述含 水组合物中盐的浓度范围为5-lOOmM。
[0176] 34.第20项的方法，其中所述含水组合物的干燥通过冻干或喷雾干燥进行。
[0177] 35.第20-21项中任一项的方法，其中所述方法用来产生因子XIII组合物，所述组 合物在复溶后包含不超过1%的非蛋白酶水解活化的因子XIII。
[0178] 36.包含转谷氨酷胺酶的复溶溶液，其中所述溶液通过将第1-19项中任一项的干 燥组合物用稀释剂复溶而制得。
[0179] 37.第23项的溶液，其中所述稀释剂是蒸馈水。
[0180] 38.第23项的溶液，其中所述稀释剂是包含一种或多种选自W下其它组分的稀释 剂:盐、糖、氨基酸、缓冲液、非离子型表面活性剂、还原剂、馨合剂、抗氧化剂、防腐剂、润湿 剂、乳化剂、填充剂、张力调节剂、油性溶媒、蛋白质和两性离子物质。
[0181] 39.第23-25项中任一项的溶液，其中所述转谷氨酷胺酶是因子XIII化合物。
[0182] 40.第26项的溶液，其中不超过1%的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化的 因子xni。
[0183] 41.第27项的溶液，其中不超过0.5%的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化 的因子XIII。
[0184] 42.包含第23-28项中任一项的溶液或第1-19项中任一项的干燥组合物的药物组 合物。
[01化]43.第29项的药物组合物，其用于减少失血。
[0186] 44.第29项的药物组合物，其用于预防早产婴儿的脑室出血。
[0187] 45.第29项的药物组合物，其用于在手术期间或手术后减少患者的手术相关失血。
[0188] 46.第29项的药物组合物，其用于治疗血友病A。
[0189] 47.第29项的药物组合物，其用于治疗血友病B。
[0190] 48.第29项的药物组合物，其用于治疗血小板疾病。
[0191] 49.第29项的药物组合物，其用于治疗冯威勒布兰特氏病。
[0192] 50.治疗或预防出血事件的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的 第29项的药物组合物。
[0193] 51.用于缩短受治疗者的凝血时间的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者 第29项的药物组合物。
[0194] 52.用于缩短受治疗者的凝血时间的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者 第29项的药物组合物。
[01M] 53.用于加强血块强度的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者第29项的药 物组合物。
[0196] 54.用于促进血纤蛋白凝块形成的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者第 29项的药物组合物。
[0197] 55.用于预防早产婴儿的脑室出血的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者 有效量的第29项的药物组合物。
[0198] 56.用于在手术期间或手术后减少受治疗者的手术相关失血的方法，所述方法包 括给予有需要的受治疗者有效量的第29项的药物组合物。
[0199] 57.用于治疗血友病A的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的第29 项的药物组合物。
[0200] 58.用于治疗血友病B的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的第29 项的药物组合物。
[0201] 59.用于治疗血小板疾病的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有效量的 第29项的药物组合物。
[0202] 60.用于治疗冯威勒布兰特氏病的方法，所述方法包括给予有需要的受治疗者有 效量的第29项的药物组合物。
[0203] 61.-种W干燥形式胆存使转谷氨酷胺酶组合物稳定的方法，该方法使得非蛋白 酶水解活化的转谷氨酷胺酶的水平占在复溶后立即测定的转谷氨酷胺酶总含量的1% W 下，其中所述稳定效果的实现在于将包含转谷氨酷胺酶、盐和至少一种另外的选自糖、氨基 酸和缓冲液的组分的含水组合物干燥，其中含水组合物中盐的浓度范围为5-1 OOmM。
[0204] 62.第48项的方法，其中所述转谷氨酷胺酶组合物是因子XIII组合物。
【主权项】
1. 一种干燥转谷氨酰胺酶组合物，所述组合物可通过将含水组合物冻干或喷雾干燥 获得，所述含水组合物包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种选自糖、氨基酸和缓冲液的另外的 组分，其中含水组合物中的盐浓度为5-100 mM。2. 权利要求1的组合物，其中因子XIII化合物是人因子XIII。3. 权利要求1或2的组合物，其中所述盐是一价盐。4. 权利要求3的组合物，其中所述一价盐是氯化钠盐。5. 权利要求1-4中任一项的组合物，其中含水组合物中所述盐的浓度为10-75 mM。6. 权利要求1-5中任一项的组合物，其中所述组合物为粉末形式。7. -种制备权利要求1 _6中任一项的干燥组合物的方法，所述方法包括将包含转谷氨 酰胺酶、盐和至少一种选自糖、氨基酸和缓冲液的另外的组分的含水组合物干燥，其中含水 组合物中的盐浓度为5-100 mM。8. 权利要求7的方法，其中所述方法用于生产因子XIII组合物，所述组合物在复溶后包 含不超过1%的非蛋白酶水解活化的因子XIII。9. 包含转谷氨酰胺酶的复溶溶液，其中所述溶液通过将权利要求1-6项中任一项的干 燥组合物用稀释剂复溶制得。10. 权利要求9的溶液，其中不超过1%的所述因子XIII化合物是非蛋白酶水解活化的因 子XIII。11. 一种药物组合物，其包含权利要求10-11中任一项的溶液或权利要求1-6中任一项 的干燥组合物。12. -种以干燥形式贮存使转谷氨酰胺酶组合物稳定的方法，使得非蛋白酶水解活化 的转谷氨酰胺酶的水平占在复溶后立即测得的转谷氨酰胺酶总含量的1%以下，其中所述稳 定效果的实现在于将包含转谷氨酰胺酶、盐和至少一种选自糖、氨基酸和缓冲液的另外的 组分的含水组合物干燥，其中含水组合物中的盐浓度为5-100 mM。13. 权利要求12的方法，其中所述转谷氨酰胺酶组合物是一种因子XIII组合物。
【文档编号】C12N9/96GK105925545SQ201610285066
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2009年4月20日
【发明人】M.布拉德, T.法尔克, G.K.克里斯琴森
【申请人】诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司