基于tcf1基因多态性治疗糖尿病和相关病症的方法

专利名称：基于tcf1基因多态性治疗糖尿病和相关病症的方法
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发明领域本发明涉及治疗以血糖控制受损为特征的紊乱，特别是糖尿病(Diabetes Mellitus)和相关病症。尤其是，本发明涉及使用基因组分析确定受试者对血糖控制剂如二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂和其它血糖控制方法和策略——包括开始治疗的时间选择和最佳药剂、治疗方案和剂量的选择——的反应性。
相关技术的描述糖尿病是人类一大组紊乱的一种形式，以血糖控制受损或血液中葡萄糖水平控制受损为特征。糖尿病本身是以葡萄糖和其它产能燃料的代谢受损，以及晚期发展出严重的血管和神经并发症为特征的慢性激素紊乱。糖尿病占美国健康护理费用的近15％，并且是工作年龄人们失明以及终末期肾脏病(ESRD)和非创伤性截肢的主导原因。糖尿病使心脏、脑和外周血管病变的风险增加2-7倍且是新生儿发病和死亡的主要原因。
糖尿病是一组复杂和多变的紊乱，但是所有形式都与共同的激素缺乏，即胰岛素缺乏相关。在抗胰岛素性共存时观察，这种缺乏可以是全部、部分或相对的。相对或绝对胰岛素缺乏在糖尿病相联系的代谢紊乱中起主要作用，而所导致的高血糖又在该疾病的很多并发症中起关键作用。
分类表1总结了糖尿病的最新修订分类。临床糖尿病可以分为四个一般亚型，包括(1)1型(由β细胞破坏引起并以绝对胰岛素缺乏为特征)，(2)2型(以抗胰岛素性和相对胰岛素缺乏为特征)，(3)其它特殊类型的糖尿病(与各种可识别的临床病症或综合征相关)，和(4)妊娠糖尿病。除了这些临床种类，两种病症-葡萄糖耐量受损和空腹葡萄糖受损-是指正常葡萄糖内环境稳定和明显糖尿病之间的中间代谢状态。这些病症显著增加糖尿病的后期风险并且在一些情况下可以是其自然病史的一部分。应该注意，任何形式的糖尿病患者在某个时候可能都需要胰岛素治疗。由于这个原因，以前使用的术语胰岛素依赖型糖尿病(对于1型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(对于2型)已经取消。
表1.糖尿病的分类临床糖尿病I.1型糖尿病，以前称为胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)或“幼年型糖尿病”A.免疫介导的B.特发的II.2型糖尿病，以前称为非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)或“成年型糖尿病”III.其它特殊类型A.β细胞功能的遗传缺陷(如青春晚期糖尿病[MODY]1-3型和线粒体DNA点突变)B.胰岛素作用的遗传缺陷C.外分泌胰腺病变(如胰腺炎，创伤，胰腺切除术，瘤形成，囊性纤维化，血色素沉着症，纤维结石性胰病)D.内分泌病(如肢端肥大症，柯兴氏综合征，甲状腺机能亢进，嗜铬细胞瘤，胰胰高血糖素瘤，生长激素释放抑制因子瘤，醛固酮瘤)E.药物或化学药剂诱导的(如糖皮质类固醇，噻嗪类，二氮嗪，戊烷脒，灭鼠优，甲状腺激素，苯妥英[大仑丁]，β-激动剂，口服避孕药)
F.感染(如先天性风疹，巨细胞病毒)G.罕见形式的免疫介导的糖尿病(如“僵人”综合征，抗胰岛素受体抗体)H.其它遗传综合征(如唐氏综合征，克兰费尔特综合征，特纳综合征，亨廷顿疾病，肌强直性营养不良，脂肪营养不良，共济失调-毛细血管扩张症)IV.妊娠糖尿病风险类型I.空腹葡萄糖受损II.葡萄糖耐量受损1型 糖尿病具有这种紊乱的患者胰岛素分泌能力很低或无并且依赖于外来胰岛素预防代谢的代偿失调(如酮症酸中毒)和死亡。通常但不是总是，以前健康的无肥胖儿童或年轻成人突然出现糖尿病(即数日和数周内)；在较大年龄群中，它可能逐渐起病。在初次估计时，典型患者常常出现疾病，具有明显症状(如多尿，烦渴，贪食和体重减轻)，并且可能证明酮症酸中毒。据信1型糖尿病具有很长的无症状临床前期，通常持续数年，在此期间胰腺β细胞逐渐由受到HLA和其它遗传因子以及环境影响的自身免疫攻击所破坏。最初，胰岛素治疗对于使代谢恢复正常是必要的。然而，所谓的蜜月期可能到来并持续数周或数月，在此期间需要较小剂量的胰岛素，因为β细胞功能部分恢复和由急性病变引起的抗胰岛素性逆转。其后，胰岛素分泌能力逐渐丧失(经过几年)。1型糖尿病与特殊免疫反应(HLA)基因的关系和针对胰岛细胞及其成分的抗体的存在为1型糖尿病是自身免疫疾病的理论提供了强大支持。在美国这种综合征占糖尿病的10％以下。
2型 糖尿病发现糖尿病患者群体中90％以上是2型，即，至今该疾病最普通的形式。这些患者保留了明显水平的内源胰岛素分泌能力。然而，胰岛素水平相对于抗胰岛素性和周围葡萄糖水平的值为低。2型患者不依赖于胰岛素进行立即存活并很少发展为酮症，除了在强大身体压力的情况下。然而，这些患者可能需要胰岛素治疗来控制高血糖。典型地2型糖尿病在40岁以后出现，与HLA基因不相关的遗传外显率的比例高，并且伴有肥胖。2型糖尿病的临床特征可能是轻微的(疲劳，虚弱，头晕，视力模糊或其它非特殊主诉可能占优势)或在患者求医前可以被忍受很多年。此外，如果高血糖的水平不足以产生症状，该疾病可能仅在发生并发症后才变得明显。
其它特殊类型的糖尿病这类包括特殊疾病、药物或病况所致的各种糖尿病症状。遗传研究已经为以前包括在2型糖尿病形式里的MODY的发病机理提供了新的认识。MODY包括β细胞功能的几种遗传缺陷，其中已经鉴定出在不同染色体上几个基因座位的突变。最普通形式-MODY3型—与染色体12上编码的被称为肝细胞核因子1α(HNF1，也称TCF1)的转录因子的突变有关，而MODY2型与葡萄糖激酶基因(染色体7上)突变有关。HNF-4α基因(染色体20上)突变引起1型MODY。这些病症的每一种都以常染色体显性方式遗传。两种新的罕见MODY形式与HNF-1β(染色体17上)和术语称为PDX-1或1DX-1的胰岛素基因转录因子(染色体13上)的突变有关。
各种糖尿病亚型之间的区别通常建立在临床基础上。然而，少数患者亚群难于分类，也就是说，他们表现出与1型和2型糖尿病共同的特征。这种患者通常无肥胖并且胰岛素分泌能力降低，但不足以使他们产生酮症倾向。很多最初对口服制剂产生反应，但是随着时间推移，仍需要胰岛素。一些看来是缓慢进展形式的1型糖尿病，然而其它的难于简单分类。
妊娠糖尿病术语妊娠糖尿病描述了在妊娠期出现或首次检测到葡萄糖耐量受损的女性。妊娠糖尿病通常在第2和第3个三个月，即，妊娠相关的胰岛素拮抗激素峰的时间出现。分娩后，葡萄糖耐量通常(但不总是)恢复正常。诊断当存在多尿、烦渴和体重减轻的典型症状时，糖尿病的诊断通常很明确。仅需要的是静脉血随机血浆葡萄糖测定是200mg/dl或更高。如果糖尿病是猜测的，由随机葡萄糖测定不能证实，那么所选择的筛选测试是过夜空腹血浆葡萄糖水平。如果在至少两个分开的时间下，空腹葡萄糖等于或高于126mg/dl，那么诊断确立。
相关病症葡萄糖耐量受损和空腹葡萄糖受损对于葡萄糖水平高于正常(分别在用餐或空腹情况下)但低于诊断糖尿病时所接受的水平的个体，应用术语葡萄糖耐量受损(IGT)和空腹葡萄糖受损(IFG)。两种情况都伴随心血管疾病风险增加，但是不产生与糖尿病相关的典型症状或微血管和神经病变并发症。然而，在一个患者亚群(大约25％-30％)中，最终发展为2型糖尿病。
葡萄糖代谢受损葡萄糖代谢受损(IGM)定义为血液葡萄糖水平高于正常范围但又不足够高到满足2型糖尿病的诊断标准。IGM的发病率不同国家之间不同，但是通常比明显糖尿病频繁2-3倍。直到最近，IGM个体被认为是糖尿病前期，但是几个流行病学研究资料争辩有IGM的受试者在糖尿病和心血管发病率和死亡率方面风险不同。资料提示有IGM的受试者，尤其是葡萄糖耐量受损(IGT)的那些人并不总是发展为糖尿病，但是无论他们是否是糖尿病，他们的心血管发病和死亡的风险都高。在IGM受试者中，大约58％具有葡萄糖耐量受损(IGT)，另29％具有空腹葡萄糖受损(IFG)，而13％具有两种异常(IFG/IGT)。如上讨论，IGT以餐后(食后)升高的高血糖为特征，而IFG由ADA基于空腹血糖值定义。
1997年ADA定义了(a)葡萄糖耐量正常(NGT)，(b)葡萄糖代谢受损(IGM)和(c)明显2型糖尿病的分类如下(a)葡萄糖耐量正常(NGT)＝空腹血浆葡萄糖水平＜6.1mmol/L或低于110mg/dl和餐后2小时葡萄糖水平＜7.8mmol/L或＜140mg/dl。
(b)葡萄糖代谢受损(IGM)是空腹葡萄糖受损(IFG)＝空腹葡萄糖水平6.1-7mmol/L或140-220mg/dl，和/或葡萄糖耐量受损(IGT)＝餐后(75g OGTT)2小时葡萄糖水平7.8-11.1mmol/L或140-220mg/dl。
(c)2型糖尿病＝空腹葡萄糖高于7mmo/L或126mg/dl或餐后(75gOGTT)2小时葡萄糖水平高于11.1mmol/L或200mg/dl。
这些标准使用WHO推荐的用于口服葡萄糖耐量测试的条件((75gOGTT)，即口服给予相当于含有溶于水的75g无水葡萄糖的葡萄糖负荷，2小时后取血液样品分析餐后葡萄糖)定义。其它OGTT测试条件已经证实与IGT和IFG相关的风险，这些条件包括1)使用50g葡萄糖代替75g，2)使用偶然(非空腹)葡萄糖样品作为分析物，和3)葡萄糖负荷1小时后，而不是2小时后分析餐后葡萄糖。所有这些条件下，上面定义的血糖种类都已经与下述风险的增加联系起来，但是为了使测试结果变异最小，优选标准化的OGTT。
已知IGM个体，特别是IFG子类的那些个体进展为糖尿病的比例明显高于血糖正常的个体，并且已知心血管风险高，特别是当他们发展为糖尿病时。有趣的是，IGM个体，更特别是IFG子类的那些个体还具有癌症、心血管疾病及死亡的高发生率，即使他们从不发生糖尿病。因此，看来IGM且更特别的IFG亚群的心血管风险高，特别是在患者变成明显糖尿病之后。另一方面，IGT(也称为餐后高血糖症(PPHG))还与无糖尿病和糖尿病中的癌症、心血管疾病及死亡的高风险有关。见Hanefeld M和Temelkova-Kurktschiev T，Diabet.Med 1997；14 Suppl.3S6-S11。
IGT相关的风险增加与所有其它已知的心血管风险因素相独立，包括年龄、性别、高血压、低LDL和高LDL胆固醇水平，见Lancet 1999；354617-621。此外，流行病学研究提示餐后高血糖症(PPHG)或高胰岛素血症是发展为糖尿病的大血管并发症的独立风险因素。见Mooradian AD和Thurman JE，Drugs 1999；57(1)19-29。PPHG与HbA1c类似，与糖尿病并发症，特别是视网膜病和肾病的存在相关。见Pettitt DJ等Lancet 1980；21050-2，Jarrett RJ Lancet 1976；21009-2和Teuscher A等DiabetesCare 1988；11246-51。
使IGM，更特别地，IGT，在不存在糖尿病特征性的异常FPG的情况下与微血管和大血管并发症相联的一个机制是餐后高血糖症。已经显示独立的餐后高血糖症，甚至在无糖尿病时，可减少血清中存在的天然自由基捕获物质(TRAP)。而在实验条件下，已经证实TRAP水平降低与自由基形成增加和氧化压力增加有关。而在与动脉粥样硬化、心血管发病率和死亡率和癌症有关的病理微血管和大血管改变中牵涉到这些自由基。见Ceriello，A，Diabetic Medicine 15188-193，1998。餐后高血糖过程中天然抗氧化剂(象TRAP)的降低可解释不发展为糖尿病的IGM，特别是IGT个体的心血管风险增加。
IGT是无糖尿病以及糖尿病中的独立风险因素的事实证明，它是与糖尿病无关的预防和治疗心血管发病和死亡以及癌症的新指征。因此，IGM与下列潜在疾病或病症有关1)进展为明显2型糖尿病(国际疾病分类第9版的代码250.2＝ICD-9代码250.2)[Diabetes Research and ClinicalPractice 1998；40S1-S2]；2)增加的糖尿病的微血管并发症，特别是糖尿病性视网膜病变和其它眼并发症(ICD-9代码250.5)，肾病(ICD-9代码250.4)，神经病变(ICD-9代码250.6)[Diabetes Care 2000，，231113-1118]，和外周血管病或坏疽(ICD-9代码250.7)；3)增加的心血管发病率(ICD-9代码410-414)，特别是心肌梗塞(ICD-9代码410)，冠心病或动脉粥样硬化(ICD-9代码414)和其它急性和亚急性形式的冠状动脉缺血(ICD-9代码411)；4)过度脑血管疾病象中风(ICD-9代码430-438)[Circulation 1998，982513-2519])；5)增加的心血管死亡率(ICD-9代码390-459)[Lancet 1999；354617-621]，和猝死(ICD-9代码798.1)；6)更高的恶性肿瘤发生率和死亡率(ICD-9代码140-208)[Am J Epidemiol.1990，，131254-262，Diabetologia 1999；421050-1054]。与IGIVI有关的其它代谢失调包括异常脂血症(ICD-9代码272)，高尿酸血症(ICD-9代码790.6)以及高血压(ICD-9代码401-404)和心绞痛(ICD-9代码413.9)[Ann Int Med1998，128524-533]。很清楚，与IGM，尤其是IGT相关的广大范围的疾病和病况代表着一个具有巨大医学需要的领域。
很多此类疾病和病症与IGM和糖尿病都相关，但是仅在最近才可以明确具有IGM，特别是IGT的无糖尿病群体应该是预防和治疗的适宜对象。因此，在IGM和特别是IGT和/或IFG受试者中，恢复早期胰岛素分泌和/或降低进餐高血糖应该有助于预防或延迟个体进展为明显糖尿病及通过预防个体发展为明显糖尿病来预防或降低糖尿病相关的微血管并发症。此外，在IGM，特别是IGT和/或IFG的个体中，恢复早期胰岛素分泌和/或降低餐后高血糖应该也预防或降低过多心血管发病率和死亡率，以及在个体中预防癌症或降低癌症死亡率。
胰岛素分泌和作用胰岛素首先在胰腺β细胞中合成为大单链多肽—胰岛素原，随后切割胰岛素原导致连接链(C肽)切除并出现较小的双链胰岛素分子(51个氨基酸残基)。葡萄糖浓度是胰岛素分泌的关键调节剂。对于葡萄糖激活的分泌，其应该首先被蛋白(GLUT 2)转运到β细胞中，被葡萄糖激酶磷酸化并代谢。直接的触发过程现知之甚少，但可能包括信号转导途径的活化，三磷酸腺苷(ATP)敏感性钾通道的关闭和钙进入β细胞。正常情况下，当血液葡萄糖升高，甚至仅稍高于75至100mg/dL的空腹水平时，β细胞即分泌胰岛素，该胰岛首先来自预先形成的储存胰岛素，随后来自新胰岛素合成。葡萄糖进入的途径以及其浓度决定反应的大小。由于肠肽(如，胰高血糖素样肽I、肠抑胃肽)的同时释放，口服给予葡萄糖比静脉内给予产生更高的胰岛素水平。其它胰岛素促分泌因素包括氨基酸和迷走神经刺激。一旦分泌入门脉血液，胰岛素移走近50％的胰岛素并降解之。这种吸收的结果是门静脉胰岛素总是比外周循环中的胰岛素高至少两至四倍。相反，当血液葡萄糖水平下降，甚至仅稍低(如至70mg/dL)，胰岛素分泌迅速减少。
胰岛素通过首先穿过血管区室并到达其目标，结合其特异性受体，而作用于效应组织。胰岛素受体是由二硫键桥形成的两条α-和β-链的异源二聚体。α-亚基停留于细胞外表面并且是胰岛素结合部位。β-亚基跨膜并可在细胞质表面的丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸残基上被磷酸化。β-亚基的内在酪氨酸激酶活性对胰岛素受体功能是必需的。快速的受体自磷酸化和细胞底物的酪氨酸磷酸化(如胰岛素受体底物1和2)是胰岛素作用的重要早期步骤。其后，触发一系列磷酸化和去磷酸化反应，最终在胰岛素敏感性组织(肝脏、肌肉和脂肪组织)中产生胰岛素效应。胰岛素活化各种受体后信号转导途径，包括P13(磷脂酰肌醇3’)激酶——看来对葡萄糖转运蛋白(GLUT4)移位到细胞表面并由此对葡萄糖吸收很关键的酶。
术语称为反调节激素的很多其它激素(胰高血糖素、生长激素、儿茶酚胺和皮质醇)可以对抗胰岛素的代谢作用。这些当中，胰高血糖素和较低程度地生长激素在糖尿病综合征的发展中起重要作用。在对低血糖、氨基酸、自主神经系统活化作出反应时胰高血糖素由胰腺α细胞分泌。其主要作用在肝脏上，在那里它通过环单磷酸腺苷-依赖机制刺激糖原分解、糖异生和生酮作用。正常情况下它由高血糖抑制，但是在1型和2型糖尿病中尽管存在高血糖，它仍绝对或相对增加。
糖尿病以摄取碳水化合物后明显的餐后高血糖为特征。在2型糖尿病中，胰岛素分泌延迟和肝脏抗胰岛素性的联合作用损害了对肝脏葡萄糖产生的抑制和肝脏储存葡萄糖作为糖原的能力。接着引起高血糖，即使胰岛素水平最终可能升高至超过在无糖尿病个体中见到的水平(相对于占优势的葡萄糖水平，胰岛素分泌仍缺乏)，这是因为抗胰岛素性降低了肌肉移走肝脏释放出的过量葡萄糖并在肌细胞中将其储存为糖原的能力。
糖尿病的药理学治疗传统包括用胰岛素干预或口服降糖药物。1型糖尿病中，主要焦点是代替胰岛素分泌。2型糖尿病中，建立得最好的治疗策略旨在增加胰岛素的分泌或生理作用。这可通过用促胰岛素分泌剂如磺酰脲类或苯甲酸衍生物直接刺激胰岛素分泌，或通过用药剂如PPARγ激动剂噻唑烷二酮类药物为代表的那些药剂降低外周抗胰岛素性来完成。在一些2型糖尿病中，在稳定化过程的早期需要胰岛素本身，或与一种或多种其它类药物联合。对于糖尿病的一般综述见Cecil Textbook of Medicine第21版；Goldman，L.和Bennett J.C.编.Saunders Co.Phili(2000)，尤其是1263-1285页。
治疗糖尿病的几种新方法利用胰高血糖素样肽1(GLP-1)的作用。GLP-1是对用餐产生反应从肠道释放到血流的肽激素。GLP-1具有几种降低葡萄糖水平的作用，包括直接作用于胰腺β细胞来增加胰岛素释放和促进胰岛素的合成。GLP-1来自肠道L细胞中胰高血糖素前体的组织特异性翻译后加工，见，rskov C.Diabetologia 35701-711(1992)。
在健康受试者中，GLP-1通过很多生理机制，包括胰岛素和胰高血糖素浓度的调节，有力影响血糖水平，见rskov C.Diabetologia 35701-711(1992)；Holst JJ等，《Glugagon III.Handbook of ExperimentalPharmacology》；Lefevbre PJ，Ed.Berlin，Springer Verlag，311-326(1996)；和Deacon CF等，Diabetes，Vol.47764-769(1998)。GLP-1的胰腺作用是葡萄糖依赖性的，见Kregmann B等，Laneifii 1300-1304(1987)；Weir GC，Diabetes 38338-342(1989)。
这些相同的作用也发生在糖尿病患者中并使2型糖尿病受试者的血液葡萄糖水平倾向于正常化和改善1型患者的血糖控制，见Gutniak M等，N Engl J Med 2361316-1322(1992)；Nathan DM等，Diabetes Care15270-276(1992)；和Nauck MA等Diabetologia 36741-744(1993)。
内源和外源给予的GLP-1被快速代谢，在体内血浆半衰期(t1/2)仅1-2分钟。氨肽酶二肽基肽酶IV(DPP4)是这种快速代谢的主要原因。DPP4对GLP-1的作用产生NH2-末端截短的代谢物GLP-1(9-36)酰胺，见KiefferTJ等Endocrinology 1363585-3596(1995)；MentlienR等，Eur J Biochem214829-835(1993)；Deacon CF等，J Clin Endocrinol Metab 80952-957(1995)；Deacon CF等，Diabetes 441126-1131(1995)。
二肽基肽酶IV(DPP4；EC 3.4.14.5)等同于ADA复合蛋白-2和T细胞活化抗原CD26。DPP4是从多肽的N末端切割X-脯氨酸二肽的丝氨酸外肽酶。它是通过其N末端而锚定在细胞膜中的膜内糖蛋白。在肾脏近曲小管和小肠的刷状缘膜中发现高水平的该酶，但几种其它组织也表达该酶。该酶存在于胎儿结肠，但是出生时消失。它异位表达于一些人的结肠腺癌和人结肠癌细胞系。Darmoul等Ann.Hum.Genet.54191-197，(1990)从这些结肠癌细胞系中分离出肠道DPP4的cDNA探针，并通过体细胞杂种的Southern分析，将该基因分配到染色体2上。Mathew等Genomics 22211-212(1994)证实了这种分配，他们通过荧光原位杂交将DPP4基因更细定位到2q23。Misumi等，Biochim.Biophys.Acta 1131333-336，(1992)分离并测序编码DPP4的cDNA。cDNA的核苷酸序列(3,465bp)含有编码包含766个氨基酸的多肽的开放阅读框架，比大鼠蛋白少1个残基。预测的氨基酸序列显示与大鼠酶84.9％的同一性。
Abbott等Immunogenetics 40331-338(1994)证明CD26跨越大约70kb并含有26个外显子，大小范围从45bp至1.4kb。编码丝氨酸识别位点(G-W-S-Y-G)的核苷酸在2个外显子之间分开。这将丙基寡肽酶家族与典型的丝氨酸蛋白酶家族的基因组结构清楚区分开来。CD26编码大小大约4.2和2.8kb的2个信使。它们在胎盘和肾脏中都以高水平表达，在肺脏和肝脏中以中等水平表达。在骨骼肌、心脏、脑和胰腺中仅4.2kbmRNA以低水平表达。通过荧光原位杂交，前述Abbott等(1994)将该基因制图到2q24.3。
任何药学上有活性的DPP4(DPP IV)抑制剂可用于延长GLP-1在体内的半衰期并增加其作用。几个研究已经发现DPP4的抑制提高大鼠内的葡萄糖内环境稳定并增加猪对静脉内葡萄糖负载的原位反应，见Deacon F.等，Diabetes 47764-769(1998)；Pauly RP等Regal Pept 643148(1996)；Balkan B等，Diabetologia 40(增刊1)A131(1997)和LiX等，Diabetes 46(增刊1)237A(1997)。
在猪研究中，DPP4的体内抑制防止GLP-1的NH2末端降解，因此延长了此生物活性肽的t1/2。DPP4抑制剂的存在加强了对与GLP-1灌注一起给予的静脉内葡萄糖的原位反应，并且还可以通过增强内源GLP-1的作用来改善在无外源GLP-1时口服葡萄糖后见到的葡萄糖耐量，见DeaconCF.Diabetes 47764-769(1998)。
在其它研究中，DPP4(或CD26)基因的定向失活产生了在空腹状态下血液葡萄糖水平正常，而葡萄糖挑战后血糖变化范围降低的健康小鼠。见Marguet D等，Proc Natl Acad Sci USA 976874-6879(2000)。这个小组也发现DPP4基因失活的纯合小鼠中葡萄糖刺激的循环胰岛素水平增加且完整的促胰岛形式的GLP-1也增加。
发现给予DPP4酶活性的药理学抑制剂可改善野生型小鼠，但不改善DPP4基因失活小鼠的葡萄糖耐量。也发现这种DPP4抑制剂改善缺乏产生GLP-1受体的基因的小鼠的葡萄糖耐量。这提示DPP4抑制是可以通过控制GLP-1以及其它底物，包括相关肠降血糖素激素——抑胃肽(GIP)的活性来改善血液葡萄糖调节的有效药理学方法，见Marguet D等，前述引文。其它研究也已经显示DPP4酶活性的药理学抑制可提高2型糖尿病动物的葡萄糖清除率，见Deacon CF等，Diabetes 47764-769(1998)；Pederson RA等，Diabetes 471253-1258(1998)；Paalg RP等，Metab-ClinExp 48385-389(1999)；和Balkan B.Diabetologia 421324-1331(1999)。这些资料揭示DPP4抑制剂在生理葡萄糖内环境稳定中具有价值并且DPP4活性的抑制剂或其它调节剂具有潜力以有效治疗涉及改变的葡萄糖内环境稳定性的疾病，包括糖尿病，以及通过酶DPP4的存在、浓度或活性能够改变的病症。
预期可以抑制或改变DPP4活性的药剂将是治疗人类糖尿病和其它疾病的独特和有效药剂。在多中心、双盲、随机、平行临床研究中已经测试了至少一种DPP4抑制剂，即2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)，比较了各种剂量下的该抑制剂与安慰剂对以前仅以膳食治疗的2型糖尿病患者(NIDDM)的作用，见Ahren B等糖尿病50(增刊2)A104(2001)。
X综合征X综合征是认为与糖尿病相关的代谢综合征。术语X综合征是Reaven等给定的，描述特征是中心性肥胖和包括如下的代谢表现的病症对胰岛素刺激的葡萄糖摄取的抵抗、高胰岛素血症、不耐受葡萄糖(不一定是明显糖尿病)、极低密度脂蛋白甘油三酯(VLDL)水平增加、高密度脂蛋白胆固醇(HDL)浓度水平降低和高血压。这些特征性特性的每一种都被认为是发生动脉粥样硬化和其它“老年”病的危险因素。据信X综合征是由抗胰岛素性引起的，但是目前没有可利用的疗法。见Reaven，G.Diabetes.371595-1607，1988和Ferrannini，E.等，Diabetologia.34416-422，1991。
分子生物学和遗传学发展在过去二十年中，分子生物学和遗传学的显著发展已经革命性地促进了对基因在人类疾病中的含义的理解。已经显示基因是某些疾病状态的直接原因。例如，对镰刀细胞性贫血是人β珠蛋白基因的单一突变引起的已经知之很久。在很多其它情况下，一种基因与环境因素和/或其它基因一起对引起疾病或增加疾病易感性起作用。这种情况的突出实例包括·ApoE中的DNA序列变异在阿尔茨海默氏病中的作用，·CKR5与HIV感染的易感性；·因子V与深静脉血栓形成的风险；·MTHFR与心血管疾病和神经管缺陷；·p53在HPV感染中的作用；·各种细胞色素P450在药物代谢中的作用；·和HLA在自身免疫疾病中的作用。
令人惊奇的是，导致基因参与人类疾病的遗传变异相对很小。构成人类基因组的DNA碱基中大约1％是多态性的，即，它们在个体间是可变的。所有生物体，包括人类的基因组，在它们的连续进化过程中经历自发突变。大多数这种突变产生多态性，因此该突变的序列和最初的序列共存于种群中。然而，大多数DNA碱基差异在功能上不重要，因为它们既不影响所编码蛋白质的氨基酸序列，也不影响所编码蛋白质的表达水平。基因或它们的启动子中存在的一些多态性确实具有表型效应，就是这一小部分基因组变异解释了个体间所有差异的遗传成分，如身体外形，疾病易感性，抗病性和药物治疗的反应性。人类遗传变异性和人类表型之间的关系是现代人类遗传学研究的中心主题。人类基因组包括大约三十亿个DNA碱基。
单核苷酸多态性人类基因组中的序列变异主要由单核苷酸多态性(″SNP″)组成，其余序列变异是短串联重复(包括微卫星)、长串联重复(小卫星)和其它插入和缺失。SNP是群体中以可测频率(即＞1％)出现两个可替换碱基的位置。SNP被称为是″等位的″，因为由于此多态性的存在，一个物种的一些成员可能具有未突变序列(即，原始“等位基因”)，而其它成员可能具有突变序列(即变体或突变等位基因)。在最简单的情况下，可能仅存在一个突变序列，该多态性被称为二对等位基因多态性。可替换突变的发生可产生三对等位基因多态性等。SNP广泛存在于基因组中，改变基因功能的SNP可能直接有助于表型变异。由于它们的流行和普遍本质，SNP有潜力成为定位参与人类疾病情况的基因的重要工具，见如Wang等，Science 2801077-1082(1998)，它公开了一个探索性研究，其中2,227个SNP被作图定位于一个2.3兆碱基的DNA区域内。
单核苷酸多态性和特定表型之间的关系不表示或需要SNP是该表型的原因。相反，这种关系可能仅表示SNP位于表型决定因子在基因组上的存在位置的附近，由此更可能被发现与这些决定因子关联和由此与感兴趣的表型关联。因此，SNP可能与“真正”的功能变异存在连锁不平衡(LD)。当基因组两个不同位置上的等位基因的相关性比期望的相关性更高时存在LD，又称作等位基因相关(allelic association)。因此，SNP可以用作标记，由于其接近引起特定表型的突变而具有价值。
与疾病相关的SNP可能也对它们所处基因的功能具有直接作用。序列变异可能引起氨基酸改变或可能改变外显子-内含子剪接，由此直接改变相关蛋白，或SNP可能存在于调节区域，从而改变表达循环或mRNA稳定性，见Nowotny P，Current Opinions in Neuobiology，2001，11637-641。
载脂蛋白E(APOE)ε4等位基因在阿尔茨海默氏病(AD)中的作用最好地例证了普通基因组变异在疾病易感性中可能起的作用。ε4等位基因与AD的存在和该疾病在较小年龄起病高度相关。在研究的很多群体中见到强烈相关。见St George-Hyslop等，Biol Psychiatry 2000，47183-199。中风和心血管疾病中(见Wu等Am J Cardiol 2001，87；1361-1366)和多发性硬化中(见Oksenberg等J Neuroimmuol 2001，113171-184)也涉及多态性变异。
愈来愈清楚，很多常见紊乱的发生风险和用于治疗这些病症的药物的代谢都实质地受到根本上的基因组变异的影响，尽管任何一个变异的作用可能很小。
因此，SNP与临床表型之间的相关性将提示，1)SNP在功能上负责表型，或2)基因组上SNP的位置附近有引起该表型的其它突变。第二个可能性以遗传生物学为基础。大段DNA遗传时，彼此紧邻的标记在很多代无关的个体中可能都不会发生重组，即，这些标记存在连锁不平衡(LD)。
可获得的证据强烈提示，通过改变或抑制DPP4活性或否则其作用而可以改善血糖控制受损紊乱患者的代谢或血糖控制的化合物或疗法在治疗以血糖控制受损为特征的紊乱如糖尿病和其它相关疾病中将有用。这些化合物或药剂包括但不限于DPP4抑制剂、2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈)。
然而，在过去，没有方法确定哪个个体将对DPP4修饰剂或其它血糖控制剂产生反应而哪个不产生。因此，需要一种方法来确定罹患血糖控制受损而将对血糖控制剂或疗法(包括但不限于DPP4修饰剂或抑制剂或其它抗糖尿病药)或旨在改善血糖控制的任何药剂或治疗产生反应的那些个体，和不产生反应的个体。而且，需要方法来确定罹患血糖控制受损而将对低剂量治疗产生反应的那些个体和那些将需要更高剂量才可获得最佳结果的个体，并由此给个体制定个性化疗法以提供副作用和药物相互作用危险最小的有效治疗。而且，需要方法以优化对血糖控制剂或疗法进行的临床试验，以便将现在已知的个体间的显著差异反应考虑进去。
发明概述如这里以下所述，本发明通过鉴定与血糖控制剂或疗法的临床反应相关的TCF1座位中的多态性，克服了用血糖控制剂或疗法如DPP4修饰剂或抑制剂治疗糖尿病的目前可利用方法中的缺陷，其中所述血糖控制剂或疗法如DPP4修饰剂或抑制剂，包括但不限于2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈。这种多态性的鉴定允许开发简单测试来确定哪位患者会对DPP4修饰剂或抑制剂治疗(包括用2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)或1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈进行治疗)或其它基于GLP-1的疗法、以及通过倾向于使血糖控制正常化的其它作用机制而起作用的疗法发生反应，和预测所需剂量水平。这将允许临床医师对是否用血糖控制剂或疗法如DPP4修饰剂或抑制剂治疗糖尿病患者和如果治疗则使用多大量，作出认识更加全面的决定。
这些药剂和疗法包括但不限于GLP-1或其类似物，包括合成类似物或天然模拟物，包括Exendin-4，和活化GLP-1受体的药剂，活化GIP、PACAP或胰高血糖素的受体的药剂，影响胰腺β细胞的胰岛素分泌或葡萄糖感知的药物，包括磺酰脲类药剂，氯茴苯酸药剂，影响葡萄糖激酶活性的药剂，影响磷酸二酯酶活性的药剂，影响葡萄糖的产生或中间代谢的药剂，包括胰高血糖素分泌或作用的抑制剂，糖皮质激素受体活化调节剂，双胍，乙酰CoA羧化酶抑制剂和其它脂肪酸氧化活化剂，影响胰岛素作用的疗法，包括活化或调节核激素受体的PPAR家族的化合物，蛋白磷酸酶抑制剂，糖原合成酶激酶抑制剂，NFkB途径抑制剂，SHP2调节剂，胰岛素模拟剂和双胍，并包括影响能量平衡的疗法，包括膳食脂肪消化或吸收的抑制剂(胰腺脂肪酶、脂肪酸转运蛋白、微粒体甘油三酯转移蛋白、胆汁酸转运蛋白、二酰基甘油酯酰基转移酶、或胰腺蛋白酶抑制剂)，和此外，影响碳水化合物消化、葡萄糖吸收或肠道葡萄糖利用的疗法，包括α-糖甙酶抑制剂，淀粉酶抑制剂和延迟胃排空的药剂如糊精或双胍。
因此，本发明提供了使用个体的TCF-1基因型评估血糖控制剂或疗法(包括DPP4抑制剂)在以血糖控制受损为特征的疾病的处理中的用途的方法，所述疾病包括2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受损，空腹葡萄糖受损，X综合征，进餐脂血症，高胆固醇血症，葡萄糖代谢受损，妊娠糖尿病，和指向进餐过程中血清葡萄糖过度或异常增加的进餐血糖反应(PGR)异常(进餐或餐后高血糖)。
因此，本发明提供了确定罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的个体对血糖控制剂或疗法治疗的反应性的方法，包括确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，如果两对都是GC或如果一对是AT而一对是GC则将该个体分配到良好反应组，而如果两对都是AT则将个体分配到低反应组。
该方法可以使用任何血糖控制剂或疗法，包括但不限于二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)或1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈或式I或式II的任何化合物。
该方法可以用于治疗以血糖控制受损为特征的任何紊乱，包括但不限于2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受损，空腹葡萄糖受损，X综合征，妊娠糖尿病或对DPP4抑制剂有反应的任何紊乱。
本发明的另一个实施方案提供了治疗罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的个体的方法，包括确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，如果两个核苷酸对都是CG或如果一对是AT而一对是CG，则用血糖控制剂或疗法治疗该个体，而如果核苷酸对都是AT，则用替代换疗法治疗该个体。
这些方法可以使用任何血糖控制剂或疗法，包括但不限于二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂，如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)或1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈或式I或式II的任何化合物。
这些方法可以用于治疗以血糖控制受损为特征的任何紊乱，包括但不限于2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受损，空腹葡萄糖受损，X综合征，妊娠糖尿病或对DPP4抑制剂有反应的任何紊乱。
本发明另一实施方案提供了鉴定性状和TCF1基因的至少一个基因型或单元型之间的相关性的方法，包括比较在表现出该性状的群体中此基因型或单元型的频率与在参考群体中此基因型或单元型的频率，其中所述基因型或单元型包括位于多态性位点483A＞G的核苷酸对或核苷酸，其中当该性状群体中基因型或单元型的频率高于参考群体中的频率时，表示该性状与基因型或单元型有关。这个性状可以是，但不限于对靶向TCF1或DPP4的药物的临床反应。
本发明另一实施方案提供了治疗罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的个体的方法，该方法包括确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，如果两个核苷酸对都是CG或如果一对是AT而一对是CG，则用低剂量血糖控制剂治疗该个体，而如果核苷酸对都是AT，则用高剂量血糖控制剂治疗该个体。
上面的方法可以使用任何血糖控制剂或疗法，包括但不限于，二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂，如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)或1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈或式I或式II的任何化合物。
上面的方法可以用于治疗以血糖控制受损为特征的任何紊乱，包括但不限于2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖耐量受损，空腹葡萄糖受损，X综合征，妊娠糖尿病或对DPP4抑制剂有反应的任何紊乱。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了治疗罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的患者的方法，包括给患者和患者家庭提供遗传咨询，确定患者的TCF1基因在多态性位点483A＞G的基因型，然后基于基因型确定结果来确定对所述患者的适当治疗。
本发明更进一步的实施方案提供了用于优化血糖控制剂的临床试验设计的方法，包括确定被考虑包括在临床试验中的个体的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，如果两个核苷酸对都是CG，或如果一对是AT而一对是CG，那么该个体包括在临床试验中，而如果核苷酸对都是AT，则不包括该个体。
本发明更进一步的实施方案提供了鉴定罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的个体是否将相对于药物B而受益于药物A的方法，包括确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，如果两个核苷酸对都是CG，或如果一对是AT而一对是CG，则该个体将受益于血糖控制剂或疗法，而如果核苷酸对都是AT，则该个体将受益于替代的血糖控制剂或疗法。
本发明更进一步的实施方案提供了确定罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的个体是否可以用血糖控制剂治疗而具有减少的副作用的方法，包括确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，如果两个核苷酸对都是CG，或如果一对是AT而一对是CG，则可用较低剂量血糖控制剂治疗该个体且副作用较少，而如果核苷酸对都是AT，则必须用较高剂量血糖控制剂治疗该个体并因此副作用较大。
在更进一步的实施方案中，本发明提供了确定罹患以血糖控制受损为特征的紊乱的个体对血糖控制剂或疗法治疗的反应性的方法，包括针对个体中存在的TCF1基因的两个拷贝，确定在与TCF1 483A＞G多态性位点连锁不平衡的TCF1基因区域中的多态性位点处的核苷酸对的身份，如果在与多态性位点483A＞G连锁不平衡的TCF1基因区域中的多态性位点处核苷酸对显示在TCF1多态性位点483A＞G处两个核苷酸对都是GC或一对是AT而一对是GC，则将该个体分配到良好反应组，而如果所述核苷酸对显示在TCF1 483A＞G位点处两对都是AT，则将该个体分配到低反应组。
附图简述

图1之柱形图显示了针对于TCF1的483A＞G多态性的每对等位基因，即AG，AA和GG，用安慰剂或如文中所述的DPP-IV抑制剂治疗的受试者的平均(±SEM)进餐血糖反应。图中指出了在安慰剂和抑制剂治疗的相同基因型的受试者之间存在显著性差异水平。
图2之柱形图显示了针对于TCF1的483A＞G多态性的每对等位基因，即AG，AA和GG，用安慰剂或如文中所述的DPP-IV抑制剂治疗的受试者的平均(±SEM)糖基化血红蛋白(HbA1c)反应。图中指出了在安慰剂和抑制剂治疗的相同基因型的受试者之间存在显著性差异水平。
图3显示了TCF1基因中483A＞G多态性所在部分的序列(SEQ IDNO1)。这个序列来自GenBank登记号U72616。此多态性核苷酸位于SEQ ID NO1的核苷酸第183位，且可以是A或G。图3的这个序列中也指出了用于PCR扩增的正向和反向引物的序列。SEQ ID NO2是Invader探针，SEQ ID NOS3和4分别是探针1和探针2。在图3中，*标记的核苷酸是具有多态性的核苷酸，粗体的核苷酸代表用于PCR扩增的正向和反向引物，下划线的核苷酸代表延伸引物。
优选实施方案的描述DPP4抑制剂研究检测入选糖尿病患者中DPP4特异抑制剂研究的76个个体的基因型，检测91个座位的多态性，以鉴定所研究的DPP4抑制剂的个体反应的遗传决定因子(如SNP)或遗传相关性，所述抑制剂即2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)。所检测的遗传座位包括被认为与该化合物的抗糖尿病作用途径相关的那些基因，以及被认为与糖尿病的遗传病因学相关的那些基因。发现在TCF1座位的483A＞G多态性和治疗反应之间存在高度显著相关(p＝0.00051)，其中所述治疗反应为四小时标准化早餐过程中测定到的对综合葡萄糖接触的治疗反应。这个反应称作进餐血糖反应(PGR)，见图1。
TCF1基因产物是肝脏TCF1转录因子1。这个转录因子也被称作LF-B1、肝核因子1α(HNF-1α)和白蛋白proximal因子，并且已知其调节负责胰岛素反应的基因的活化。TCF1基因突变以前已与MODY 3型易感性相关，见Urhammer SA，Diabetologia 1997，40(4)473-5。
TCF1基因位于染色体位置12q24.2。本发明多态性核苷酸置换的标准命名是483A＞G，因此所表达多肽产物中的氨基酸置换是Asn 487 Ser。1997年报道了这个多态性，见Urhammer SA，Diabetologia 1997，40(4)473-5(PMID9112026)。该多态性位于图3所示的部分序列中，来自GenBank登记号U72616。
在DPP4治疗的个体中，GG基因型的个体和AG或AA基因型的个体之间的进餐血糖反应(PGR)有显著性差异，GG纯合患者在治疗后葡萄糖内环境稳定性改善方面，对2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)的反应最好。
现在认识到进餐血糖控制是用于降低糖尿病并发症的综合策略的一个元素，糖尿病并发症的驱动因素被认为是由进餐过程与升高的空腹血浆葡萄糖浓度相组合引起的葡萄糖接触增加。用于改善给定药剂对整体血糖控制的影响的任何策略都必须考虑到需要改善这种综合接触。
这里使用的术语“进餐”是指一餐过程中。
这里使用的术语“餐后”是指摄取一餐后的吸收期(大约0-8小时，取决于膳食的性质(sixe)和组成)。
这里使用的术语“吸收后”是指完成营养吸收后或大约餐后4-8小时。
这里使用的术语“空腹”是指长时间，即12-16小时不进食之后。
这里使用的术语“进餐血糖反应”(PGR)是指进餐过程中或餐后期血清葡萄糖的改变。
循环红细胞中的糖基化血红蛋白(HbA1c)水平已被确立为血糖控制的一个综合标记，其反映了长期接触的葡萄糖浓度。在本发明中，已经发现除了进餐血糖反应和GG TCF1基因型之间的关系外，TCF1 AG和TCF1GG两个基因型都和血糖控制的全面改善有关，证据是AG和GG TCF1基因型与2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)(见图2)治疗四周后糖基化血红蛋白(HbA1c)水平改变的改善相关。
这里使用的术语“以血糖控制受损为特征的紊乱”(IGC)是指代谢紊乱，其中主要疾病表现之一是空腹状态或对用餐或口服葡萄糖负荷发生反应时，血液葡萄糖水平的过度或异常升高，其应包括2型糖尿病，1型糖尿病，葡萄糖代谢受损，即葡萄糖耐量受损(餐后高血糖)和/或空腹葡萄糖受损，X综合征，妊娠糖尿病和指向进餐过程中血清葡萄糖过度或异常增加的异常进餐血糖反应(PGR)(进餐或餐后高血糖)。
这里使用的术语“血糖控制剂或疗法”是指倾向于使2型糖尿病或1型糖尿病，葡萄糖耐量受损，空腹葡萄糖受损，X综合征，餐后高血糖或妊娠糖尿病患者的空腹、进餐或餐后血清葡萄糖水平正常化或糖基化血红蛋白(HbA1c)随时间的反应正常化的任何化合物，药物或治疗形式。
这里使用的术语“DPP4抑制剂”是指能够抑制酶DPP4(DPP-IV；二肽基肽酶IV；EC 3.4.14.5)的催化作用的化合物，该酶是等同于ADA复合蛋白-2和T细胞活化抗原CD26的丝氨酸外肽酶。
许多具有DPP4酶活性抑制剂作用的化合物是已知的，如2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈)，并且包括但不限于美国专利6,011,155、6,124,305、6,166,063、5,602,102、6,110,949、6,274,608 B1、5,462,928、6,172,081、6,107,317、6,110,949、6,172,081、5,939,560、5,543,396和6,107,317以及国际公布WO 01/34594 A1、WO 01/47514A1、WO 00/34241、WO 01/55085 A1、WO 01/52825 A2、WO 01/04156A1、WO 00/10549、WO 01/55105 A1、WO 99/67278、WO 95/15309、WO 98/19998、WO 01/34594、WO 01/62266、WO 97/40832、WO01/72290、WO 01/68603、WO 00/34241、WO 99/61431、WO 99/67279、WO 93/08259、WO 95/11689、WO 91/16339、WO 93/08259、WO95/11689、WO 95/29691、WO 95/34538、WO 99/46272、WO95/29691、WO 00/53171和WO 99/38501和EP1052994、EP1019494、EP0528858、EP0610317、EP1050540、EP1062222和德国专利158109和296075中公开的化合物，这些专利和专利公布的所有内容由此为所有目的引入本文作为参考。在上述专利和出版物中公开的任一DPP4抑制剂均可用于本发明方法中。特别优选的DPP4抑制剂是化合物2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈)。
因此，本发明部分基于发现了在以血糖控制受损为特征的疾病的患者中，TCF1基因的遗传变异或单核苷酸多态性(″SNP″)与血糖控制剂或疗法(包括但不限于给予DPP4抑制剂)的临床反应的新关系。
正如以下将要详细描述的，这些变异与用酶DPP4修饰剂或抑制剂治疗糖尿病和其它疾病时临床反应的显著差异有关，所述其它疾病为应答如下治疗的疾病使用酶DPP4活性的抑制剂或修饰剂的疗法，包括用2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)的疗法和其它基于GLP-1的疗法，以及通过倾向于稳定血糖控制的其它类似作用机制起作用的疗法。在分离自76名个体的基因组DNA中发现了这些变异，这76名个体是参与DPP4抑制剂——2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)的2型糖尿病(NIDDM)治疗效果研究的个体。
式I的化合物可以用于本发明的其它DPP4抑制剂包括但不限于下列N-(N′-取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷化合物，这些化合物是如下所述的式I化合物；式I 其中R是a)R1R1aN(CH2)m-，其中R1是任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、卤素、三氟甲基、氰基或硝基单取代或彼此独立地二取代的吡啶基或嘧啶基部分；或任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或卤素单取代或彼此独立地二取代的苯基；R1a是氢或(C1-8)烷基；并且m是2或3；b)任选地在1位被(C1-3)羟烷基单取代的(C3-12)环烷基；c)R2(CH2)n-，其中R2是任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基、卤素单取代或彼此独立地二取代或彼此独立地三取代的苯基，或任选地在苯环上被羟甲基单取代的苯硫基；或是(C1-8)烷基；任选地被(C1-8)烷基单取代或多取代的[3.1.1]双环碳环部分；任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或卤素单取代或彼此独立地二取代的吡啶基或萘基部分；环己烯；或金刚烷基；且n是1至3；或R2是任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或卤素单取代或彼此独立地二取代的苯氧基；且n是2或3；d)(R3)2CH(CH2)2-，其中每个R3彼此独立地是任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或卤素单取代或彼此独立地二取代的苯基；e)R4(CH2)p-，其中R4是2-氧代吡咯烷基或(C2-4)烷氧基并且p是2至4；f)任选地在1位被(C1-3)羟烷基单取代的异丙基；g)R5，其中R5是2，3-二氧化茚基；任选地被苄基取代的吡咯烷基或哌啶基部分；任选地被(C1-8)烷基单取代或多取代的[2.2.1]-或[3.1.1]双环碳环部分；金刚烷基；或任选地被羟基、羟甲基单取代或彼此独立地多取代的(C1-8)烷基或任选地被(C1-4)烷基、(C1-4)烷氧基或卤素单取代或彼此独立地二取代的苯基；其游离形式或酸加成盐形式。
式I的化合物可以以游离形式或酸加成盐形式存在。盐形式可以以已知方式从游离形式获得，反之亦然。酸加成盐可以是例如可药用有机或无机酸的盐。尽管优选的酸加成盐是盐酸盐，但也可以使用甲磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和醋酸盐。
式I的化合物可以以光学活性异构体或非对映异构体的形式存在，并且可以用常规技术例如色谱法分离和回收。
“烷基”和“烷氧基”是直链或支链的，支链基团的实例是异丙基和叔丁基。
R优选是如上定义的a)、b)或e)。R1优选是如上定义的任选被取代的吡啶基或嘧啶基部分。R1a优选是氢。R1a优选是如上定义的任选被取代的苯基。R3优选是未取代的苯基。R4优选是如上定义的烷氧基。R5优选是如上定义的任选被取代的烷基。m优选是2。n优选是1或2，特别是2。p优选是2或3，特别是3。
吡啶基优选是吡啶-2-基；优选是未取代或单取代的，优选在5位取代。嘧啶基优选是嘧啶-2-基。它优选是未取代或单取代的，优选在4位取代。优选的吡啶基和嘧啶基的取代基是卤素、氰基和硝基，特别是氯。
当被取代时，苯基优选是单取代的；优选被卤素取代，优选是氯，或被甲氧基取代。优选在2-、4-和/或5-位取代，特别是在4-位。(C3-12)环烷基优选是环戊基或环己基。当被取代时，它优选被羟甲基取代。(C1-4)烷氧基优选是1或2个碳原子的烷氧基，特别是甲氧基。(C2-4)烷氧基优选是3个碳原子的烷氧基，尤其是异丙氧基。卤素是氟、氯、溴或碘，优选氟、氯或溴，特别是氯。(C1-8)烷基优选是1至6个，优选1至4个，或3至5个，特别是2或3个碳原子的烷基，或甲基。(C1-4)烷基优选是甲基或乙基，特别是甲基。(C1-3)羟烷基优选是羟甲基。
如上定义的任选被取代的[3.1.1]双环碳环部分优选是任选在6位被甲基二取代的二环[3.1.1]庚-2-基，或任选在2位被一个甲基和在6位被两个甲基取代的三取代的二环[3.1.1]庚-3-基。如上定义的任选被取代的[3.1.1]双环碳环部分优选是二环[2.2.1]庚-2-基。
萘基优选是1-萘基。环己烯优选是环己-1-烯-1-基。金刚烷基优选是1-或2-金刚烷基。
如上定义的任选被取代的吡咯烷基或哌啶基部分优选是吡咯烷-3-基或哌啶-4-基。当它被取代时，优选是N-取代的。
一组优选的式I化合物是其中R是R′的化合物(化合物Ia)，其中R′是R1′NH(CH2)2-，其中R1′是任选地被卤素、三氟甲基、氰基或硝基单取代或彼此独立地二取代的吡啶基；或未取代的嘧啶基；任选地在1位被(C1-3)羟烷基单取代的(C3-7)环烷基；R4’(CH2)3-，其中R4’是(C2-4)烷氧基；或R5，其中R5如上所定义；其游离形式或酸加成盐形式。
更优选的式I化合物是其中R是R”的化合物(化合物Ib)，其中R”是R1”NH(CH2)2-，其中R1”是被卤素、三氟甲基、氰基或硝基单取代或彼此独立地二取代的吡啶基；在1位被(C1-3)羟烷基单取代的(C4-6)环烷基；R4’(CH2)3-，其中R4’如上所定义；或R5’，其中R5’是任选地被(C1-8)烷基单取代或多取代的[2.2.1]-或[3.1.1]双环碳环部分；或金刚烷基；其游离形式或酸加成盐形式。
甚至更优选的式I的化合物是其中R是R的化合物(化合物Ic)，其中R是R1”NH(CH2)2-，其中R1”如上所定义；在1位被羟甲基单取代的(C4-6)环烷基；R4’(CH2)3-，其中R4’如上所定义；或R5”，其中R5”是金刚烷基；其游离形式或酸加成盐形式。
另一组化合物是Ip，其中R是Rp，它是
a)R1pNH(CH2)2-，其中R1p是任选地被卤素、三氟甲基氰基或硝基单取代或彼此独立地二取代的吡啶基或嘧啶基部分；b)任选地在1位被(C1-3)羟烷基单取代的(C3-7)环烷基；c)R2p(CH2)2-，其中R2p是任选地被卤素或(C1-3)烷氧基单取代或彼此独立地二取代或彼此独立地三取代的苯基；d)(R3p)2CH(CH2)2-，其中每个R3p彼此独立地是任选地被卤素或(C1-3)烷氧基单取代的苯基；e)R4(CH2)3-，其中R4如上所定义；或f)任选地在1位被(C1-3)羟烷基单取代的异丙基；其游离形式或可药用酸加成盐的形式。
另一组化合物是其中R是Rs的化合物，所述Rs是a)R1sR1as(CH2)ms-，其中R1s是任选地被氯、三氟甲基、氰基或硝基单取代或彼此独立地二取代的吡啶基；任选地被氯或三氟甲基单取代的嘧啶基；或苯基；R1as是氢或甲基；ms是2或3；b)任选地在1位被羟甲基单取代的(C3-12)环烷基；c)R2s(CH2)ms-，其中R2s是任选地被卤素、1或2个碳原子的烷氧基单取代或彼此独立地二取代或彼此独立地三取代的苯基或在苯环上被羟甲基单取代的苯硫基；(C1-6)烷基；6，6-二甲基二环[3.1.1]庚-2-基；吡啶基；萘基；环己烯；或金刚烷基；且ns是1至3；或R2s是苯氧基；且ns是2；d)(3，3-二苯基)丙基；e)R4s(CH2)ps，其中R4s是2-氧代吡咯烷-1-基或异丙氧基且ps是2或3；f)任选地在1位被羟甲基单取代的异丙基；g)R5s，其中R5s是2，3-二氧化茚基；任选地被苄基N-取代的吡咯烷基或哌啶基部分；二环[2.2.1]庚-2-基；2，6，6-三甲基二环-[3.1.1]庚-3-基；金刚烷基；或任选地被羟基、羟甲基或苯基单取代或彼此独立地二取代的(C1-8)烷基；其游离形式或酸加成盐形式。
式II的化合物此外，其它可用于本发明的DPP4抑制剂包括但不限于下列N-(取代的甘氨酰基)-2-氰基吡咯烷化合物，这些化合物是如下所述的式II化合物；式II 其中R是取代的金刚烷基；并且n是0至3；其游离形式或酸加成盐形式。
式II的化合物可以以游离形式或酸加成盐的形式存在。优选可药用的(即无毒、生理学上可接受的)盐，但其它的盐也是有用的，例如用于分离或纯化本发明的化合物。尽管优选的酸加成盐是盐酸盐，但是也可以使用甲磺酸盐、硫酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐和醋酸盐。
本发明的化合物可以以光学活性异构体或非对映异构体的形式存在，并且可以用常规技术例如色谱法分离和回收。
下面列出的是用于描述本发明的各种术语的定义。这些定义应用于整个本说明书中使用的术语，无论是单独的还是作为大基团的一部分，除非在具体情况下另有限定。术语“烷基”是指具有1至10个碳原子的直链或支链烃基，优选1至7个碳原子，最优选1至5个碳原子。示例的烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、戊基、己基等等。术语“烷酰基”是指烷基-C(O)-。术语“取代的金刚烷基”是指被一个或多个，例如两个选自烷基、-OR1或-NR2R3的取代基取代的金刚烷基，即，1-或2-金刚烷基；其中R1、R2和R3彼此独立地是氢、烷基、(C1-C8-烷酰基)、氨基甲酰基或-CO-NR4R5；其中R4和R5彼此独立地是烷基、取代或未取代的芳基并且其中R4和R5之一还可以是氢，或者R4和R5一起代表C2-C7亚烷基。术语“芳基”优选代表苯基。取代的苯基优选是被一个或多个，如两个选自如烷基、烷氧基、卤素和三氟甲基的取代基取代的苯基。术语“烷氧基”是指烷基-O-。术语“卤素”或“卤代”是指氟、氯、溴和碘。术语“亚烷基”是指2至7个碳原子的直链桥，优选3至6个碳原子，最优选5个碳原子。
一组优选的本发明化合物是其中金刚烷基上的取代基结合在桥头或与桥头相邻的亚甲基上的式I的化合物。在其中甘氨酰基-2-氰基吡咯烷部分与桥头结合的式II化合物中，金刚烷基上的R′取代基优选是3-羟基。在其中甘氨酰基-2-氰基吡咯烷部分结合在与桥头相邻的亚甲基上的式II化合物中，金刚烷基上的R′取代基优选是5-羟基。
特别优选的DPP4抑制剂是化合物2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈)。
因此，在第一个方面，本发明提供了确定罹患2型糖尿病、葡萄糖耐量受损、空腹葡萄糖受损、X综合征、进餐脂血症、高胆固醇血症、高血压、妊娠糖尿病或1型糖尿病或任何DPP4抑制剂反应性疾病的个体对用DPP4抑制剂化合物或血糖控制剂或疗法治疗的反应性的方法。这些方法包括包括确定TCF1基因的基因型或单元型，并基于TCF1基因的一种或多种多态性的存在或缺乏确定反应性。本发明的这个方面也提供了确定糖尿病或相关代谢紊乱的个体对意欲改善代谢控制的其它药剂或疗法的治疗反应性的方法。对这些多态性的检测可用于确定或预测个体对特定药物或其它治疗的反应性。一个本领域的技术人员将容易认识到，除了这里公开的具体多态性外，与所述多态性连锁不平衡的任何多态性也可以用作替代标记，以和其连锁不平衡的SNP一样用于指示对相同的药物或治疗的反应性。因此，与本说明书公开的SNP连锁不平衡的任何SNP都可以使用并且意欲包括在本发明的方法中。
SNP的鉴定和表征很多不同的技术可以用于鉴定和表征SNP，包括单链构象多态性分析，采用变性高效液相色谱(DHPLC)的异源双链分析，直接DNA测序和计算方法，见Shi MM，Clin Chem 2001，47164-172。基于公众数据库中丰富的序列信息，通过独立比对提交的给定基因序列(eDNA或基因组序列)，计算机工具可以用于in silico鉴定SNP。实验获得的SNP和通过in silico方法获得的SNP的比较显示SNPFinder(http//Ipgws.nci.nih.gov82/perl/snp/snp_cgi.pl)发现的候选SNP中55％通过实验也已经发现，见Cox等Hum Mutal 2001，17141-150。然而，这些in silico方法仅能找到27％的真正SNP。
最普通的SNP分型方法目前包括杂交、引物延伸和切割方法。这些方法的每一种都必须与适当检测系统联系起来。检测技术包括荧光极化(见Chan X等Genome Res 1999，9492-499)，焦磷酸盐释放的发光计检测(焦磷酸测序，Pyrosequencing)(见Ahmadiian A等Anal Biochem 2000，280103-10)，基于荧光共振能量转移(FRET)的切割方法，DHPLC和质谱分析(见Shi MM，Clin Chem 2001，47164-172和美国专利6,300,076 B1)。检测和描述SNP特征的其它方法是美国专利6,297,018 B1和6,300,063 B1中公开的那些。上述参考文献公开的全部内容并入这里作为参考。
在特别优选的实施方案中，可以依靠所谓的INVADERTM技术(可得自Third Wave Technologies Inc.Madison，Wis.)完成多态性的检测。在这个实验中，当结合互补DNA模板时，特殊上游″invader″寡核苷酸和部分重叠的下游探针一起形成特殊结构。这个结构被Cleavase酶识别并在特异位点切割，这引起探针寡核苷酸的5’翼的释放。这个片段接着用作反应混合物中所含的第二合成靶和第二荧光标记的信号探针的″invader″寡核苷酸。这引起Cleavase酶对第二信号探针的特异切割。当用能够发生荧光共振能量转移的染料分子标记的这第二探针被切割时，产生荧光信号。对于由重叠DNA序列或翼形成的结构，Cleavase有严格要求，并因此可以用于特异性检测位于下游DNA链上的切割位点紧上游的单碱基对错配。见Ryan D等，Molecular Diagnosis Vol.4 No 2 1999135-144和LyamichevV等Nature Biotechnology Vol 17 1999292-296，也见美国专利5,846,717和6,001,567(其公开的全部内容并入这里作为参考)。
在一些实施方案中，一种组合物含有用于同时探测两个或更多个多态性位点的寡核苷酸身份的两个或更多个不同标记的基因分型寡核苷酸。也可考虑含有两套或更多套等位基因特异性引物对以允许同时靶向和扩增含多态性位点的两个或更多个区域的引物组合物。
本发明的TCF1基因分型寡核苷酸也可以固定在固体表面或在固体表面合成，如芯片、珠或玻片(如见WO 98/20020和WO 98/20019)。这种固定的基因分型寡核苷酸可以用于各种多态性检测试验，包括但不限于探针杂交和聚合酶延伸试验。本发明的固定的TCF1基因分型寡核苷酸可以包括为同时快速筛选DNA样品在多个基因中的多态性而设计的有序寡核苷酸阵列。
本发明等位基因特异性寡核苷酸引物具有与特定SNP的仅一种核苷酸互补的3’末端核苷酸，或优选地3’倒数第二个核苷酸，由此只有存在含该核苷酸的等位基因时其才可以用作聚合酶介导的延伸反应的引物。与编码链或非编码链杂交的等位基因特异性寡核苷酸引物包括在本发明中。使用本领域技术人员已知的技术可以开发检测TCF1基因多态性的ASO引物。
本发明其它基因分型寡核苷酸与位于这里所鉴定的新多态性位点之一下游一个至几个核苷酸处的靶区域杂交。这种寡核苷酸可用于聚合酶介导的引物延伸方法中以检测这里所描述的新多态性之一，因此这种基因分型寡核苷酸这里称作“引物延伸寡核苷酸”。在优选实施方案中，引物延伸寡核苷酸的3’末端是与多态性位点紧临的核苷酸互补的脱氧核苷酸。
在另一个实施方案中，本发明提供了包括包装在分开容器中的至少两个基因分型寡核苷酸的试剂盒。该试剂盒也可以含有包装在分开容器中的其它成分如杂交缓冲液(此时寡核苷酸待用作探针)。可供选择地，当寡核苷酸待用于扩增靶区域时，该试剂盒可以含有包装在分开容器中的聚合酶和用于聚合酶介导的引物延伸如PCR的经优化反应缓冲液。
上述寡核苷酸组合物和试剂盒在个体TCF1基因的基因分型和/或单元型分型方法中有用。这里使用的术语“TCF1基因型”和“TCF1单元型”分别是指包含这里描述的一个或多个新多态性位点处存在的核苷酸对或核苷酸的基因型或单元型，其也可以任选地包括在TCF1基因的另外一个或多个多态性位点处存在的核苷酸对或核苷酸。另外的多态性位点可以是目前已知的多态性位点或以后发现的位点。
基因分型方法的一个实施方案包括从个体分离包含个体中存在的两个TCF1基因拷贝或其片段的核酸混合物，并确定两个拷贝在一个或多个多态性位点处的核苷酸对的身份，从而确定个体的TCF1基因型。如本领域技术人员容易理解的，个体中基因的两个“拷贝”可以是相同的等位基因或可以是不同的等位基因。在特别优选的实施方案中，该基因分型方法包括确定每个多态性位点的核苷酸对的身份。
典型地，核酸混合物分离自取自个体的生物学样品，如血液样品或组织样品。合适的组织样品包括全血、精液、唾液、泪液、尿液、粪便物质、汗液、口腔粘膜涂片、皮肤和头发。该核酸混合物可以由基因组DNA、mRNA或cDNA组成，并且在后两种情况下，生物学样品必须得自表达TCF1基因的器官。而且，本领域技术人员会理解mRNA或cDNA制品不能用于检测位于内含子或5’和3’非转录区域的多态性。如果分离TCF1基因片段，它必须含有待基因分型的多态性位点。
单元型分型方法的一个实施方案包括从个体分离仅包含个体中存在的两个TCF1基因拷贝之一或其片段的核酸分子，在那个拷贝中确定一个或多个多态性位点的核苷酸身份，从而确定个体的TCF1单元型。可以使用能够分离TCF1基因或其片段之两个拷贝的任何方法分离该核酸，包括但不限于上述制备TCF1同源基因的方法之一，体内定向克隆是优选方法。如本领域技术人员容易领会的，任何单个克隆将仅提供个体中存在的两个TCF1基因拷贝之一上的单元型信息。如果想要个体的另一拷贝上的单元型信息，则需要检测另外的TCF1克隆。典型地，应该检测至少五个克隆，以便有90％以上的可能性对个体中的两个TCF1基因拷贝均实现单元型分型。在特别优选的实施方案中，鉴定每个多态性位点的核苷酸。
在优选实施方案中，通过鉴定个体中存在的每个TCF1基因拷贝在一个或多个多态性位点的核苷酸定相序列(phased sequence)来确定个体的TCF1单元型对。在特别优选的实施方案中，单元型分型方法包括鉴定TCF1基因每个拷贝的每个多态性位点的核苷酸定相序列。当对两个基因拷贝进行单元型分型时，优选对位于分开容器中的每个基因拷贝实施鉴定步骤。然而，也可以预想到当用不同标签标记两个拷贝，或否则当两个拷贝可分别区分或鉴定时，在有些情况下可以在相同容器中实施该方法。例如，如果分别用不同的第一和第二荧光染料标记该基因的第一和第二拷贝，而用以第三不同的荧光染料标记的等位基因特异性寡核苷酸检测多态性位点，则可以通过检测第一和第三染料的组合来鉴定第一基因拷贝中的多态性，而通过检测第二和第三染料的组合来鉴定第二基因拷贝中的多态性。
在基因分型和单元型分型方法中，可以直接从一个或两个拷贝的TCF1基因或其片段扩增含多态性位点的靶区域，并以常规方法确定扩增区域的序列，由此确定多态性位点的核苷酸(核苷酸对)的身份。本领域技术人员将容易领会到，对于多态性位点纯合的个体，将仅在多态性位点处检测到一个核苷酸，而对于该位点是杂合的个体，将检测到两个不同的核苷酸。可以直接鉴定多态性，称作正向鉴定，或通过推断鉴定称作反向鉴定。例如，当已知SNP在参考群体中是鸟嘌呤和胞嘧啶时，对于那个位点纯合的所有个体，可以正向确定该位点是鸟嘌呤或胞嘧啶，或如果该个体在那个位点是杂合的，则是鸟嘌呤和胞嘧啶。可供选择地，可以反向确定该位点不是鸟嘌呤(因此是胞嘧啶/胞嘧啶)或不是胞嘧啶(因此是鸟嘌呤/鸟嘌呤)。
此外，对与感兴趣的多态性位点连锁不平衡的这里未公开的多态性位点进行基因分型，可以间接确定在这里描述的任何一个新多态性位点中存在的等位基因的身份。如果一个位点的特定变异的存在增强了第二位点的另一个变异的预知性，两个位点被称为是连锁不平衡(见，Stevens，JC 1999，Mol Diag 4309-317)。与目前公开的多态性位点连锁不平衡的多态性位点可能位于该基因的区域或这里未检测的其它基因组区域中。可以通过但不限于任何上面提及的检测多态性位点的等位基因身份的方法进行与这里描述的新多态性位点连锁不平衡的多态性位点的基因分型。
可以使用任何寡核苷酸定向扩增方法扩增靶区域，包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)(美国专利4,965,188)，连接酶链式反应(LCR)(Barany等，Proc Natl Acad Sci USA 88189-193，1991；WO 90/01069)，和寡核苷酸连接试验(OLA)(Landegren等，Science 2411077-1080，1988)。在这种方法中用作为引物或探针的寡核苷酸应该与含有或相邻于多态性位点的核酸区域杂交。典型地该寡核苷酸长度在10和35个核苷酸之间，优选长度在15和30个核苷酸之间。最优选，该寡核苷酸是20至25个核苷酸长。该寡核苷酸的确切长度将依赖于本领域技术人员常规认为和实践的很多因素。
其它已知的核酸扩增步骤可以用于扩增靶区域，包括基于转录的扩增系统(美国专利5,130,238；EP 329,822；美国专利5,169,766，WO 89/06700)和等温方法(Walker等，Proc Natl AcadSci USA 89392-396，1992)。
也可以在扩增前或后，使用本领域已知的几种基于杂交的方法之一检测靶区域中的多态性。典型地，实施这种方法时利用等位基因特异性寡核苷酸。等位基因特异性寡核苷酸可以以不同标记的探针对使用，这一对中的一个成员显示出与靶序列的一个变异完好匹配，另一个成员显示与不同变异完好匹配。在一些实施方案中，使用一组等位基因特异性寡核苷酸或寡核苷酸对可以一次检测一个以上多态性位点。优选，当与检测的每个多态性位点杂交时，该组的成员彼此之间具有5℃以内的解链温度，更优选2℃以内。
等位基因特异性寡核苷酸与靶多核苷酸的杂交可以以两个实体都在溶液中实施，或可以当寡核苷酸或靶多核苷酸共价或非共价固定于固相载体时，实施这种杂交。可以例如通过抗体-抗原相互作用，聚-L-Lys，链霉抗生物素或抗生物素蛋白-生物素，盐桥，疏水相互作用，化学键，UV交联烤焙等介导此固定。等位基因特异性寡核苷酸可以在固相载体上直接合成或在合成后结合于固相载体上。适合用于本发明检测方法的固相载体包括由硅、玻璃、塑料、纸等制造的底物，它们可以形成例如孔(如96孔板)、载片、薄片、膜、纤维、芯片、盘和珠。可以处理、包被或衍生化固相载体以利于等位基因特异性寡核苷酸或靶核酸固定。
个体的TCF1基因的基因型或单元型也可以通过含该基因的一个或两个拷贝的核酸样品与如WO 95/11995所述的核酸阵列和亚阵列杂交确定。该阵列将含有代表包括在该基因型或单元型中的每个多态性位点的一组等位基因特异性寡核苷酸。
也可以使用错配检测技术确定多态性的身份，包括但不限于使用riboprobe的RNA酶保护方法(Winter等，Proc Natl Acad Sci USA 827575，1985；Meyers等Science 2301242，1985)和识别核苷酸错配的蛋白，如大肠杆菌mutS蛋白(Modrich P.Ann Rev Genet 25229-253，1991)。可供选择地，单链构象多态性(SSCP)分析(Orita等，Genomics 5874-879，1989；Humphries等，《Molecular Diagnosis of Genetic Diseases》，R.Elles，ed.，pp.321-340，1996)或变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell et at.，Nucl Acids Res182699-2706，1990；Sheffield等，Proc Natl Acad Sci USA 86232-236，1989)可鉴定等位基因变体。
聚合酶介导的引物延伸方法也可以用于鉴定多态性。专利和科学文献中已经公开了几个这种方法，包括“遗传二进制分析”方法(WO 92/15712)和连接酶/聚合酶介导的遗传二进制分析(美国专利5,679,524)。WO91/02087，WO 90/09455，WO 95/17676，美国专利5,302,509和5,945,283中公开了相关方法。可以如美国专利5,605,798所述用质谱分析仪检测含多态性的延伸引物。另外的引物延伸方法是等位基因特异性PCR(Ruafio等，Nucl Acids Res 178392，1989；Ruafio等，Nucl Acids Res 19，6877-6882，1991；WO 93/22456；Turki等，I Clin Invest 951635-1641，1995)。此外，使用Wallace等(WO 89/10414)所述的等位基因特异性引物组同时扩增核酸的多个区域可以研究多个多态性位点。
在优选的实施方案中，检测每个地理种群组的单元型频率数据，确定它是否与哈迪-温伯格平衡一致。哈迪-温伯格平衡(D.L Hartl等，Principles of Population Genomics，Sinauer Associates(Sunderland，MA)，3rd Ed.，1997)假定发现单元型对H1/H2的频率等于当H1≠H2，PH-W(H1/H2)＝2p(H1)p(H2)；当H1＝H2，PH-W(H1/H2)＝p(H1)p(H2)。观察到的和预期的单元型频率之间的统计学显著差异可能是由于一个或多个因素引起，包括该组群体中的明显近亲交配，对基因的强大选择压力，取样偏差，和/或基因分型方法中的误差。如果在一个地理种群组中观察到与哈迪温伯格平衡大的偏差，那么可以增加那个组的个体数量看看该偏差是否由于取样偏差引起。如果更大的样本量不降低观察到的和预期的单元型对频率之间的差异，那么可能希望考虑使用直接单元型分型方法对个体进行单元型分型，如CLASPER SystemTM技术(美国专利5,866,404)，SMD或等位基因特异性长距离PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res244841-4843，1996)。
在预测TCF1单元型对的这个方法的一个实施方案中，单元型确定步骤包括实施下列分析。第一，每个可能的单元型对与参考群体的单元型对进行比较。通常，参考群体中仅一个单元型对与可能的单元型对匹配，故该个体被确定为该单元型对。偶尔，参考单元型对中仅一个单元型与个体可能的单元型对一致，在这种情况下，该个体的单元型对被确定为包含这个已知单元型和从该可能单元型对中减去此已知单元型得到的新单元型。在很少的情况下，参考群体中无单元型与可能的单元型对一致，或可替换地，多个参考单元型对与可能的单元型对一致。在这种情况下，优选使用直接分子单元型分型方法对个体进行单元型分型，例如，CLASPERSystemTM技术(美国专利5,866,404)，SMD或等位基因特异性长距离PCR(Michalotos-Beloin等，Nucl Acids Res 244841-4843，1996)。
本发明也提供了确定群体中TCF1基因型或TCF1单元型频率的方法。该方法包括确定群体中每个成员的TCF1基因的基因型或单元型对，其中所述基因型或单元型包括在TCF1基因的一个或多个多态性位点检测到的核苷酸对或核苷酸，包括但不限于483A＞G；和计算群体中发现的任何特定基因型或单元型的频率。该群体可以是参考群体，家族群体，相同性别群体，群体组，性状群体(如，显示出感兴趣性状，如医学疾病或对治疗处理的反应的个体组)。
在本发明的另一个方面，参考群体中发现的TCF1基因型和/或单元型的频率数据被用于鉴定性状和TCF1基因型或TCF1单元型之间关系的方法中。该性状可以是任何可检测表型，包括但不限于对疾病的易感性或对治疗的反应。该方法包括获得参考群体以及显示出该性状的群体中感兴趣基因型或单元型的频率数据。参考和性状群体之一或二者的频率数据可以使用上述方法之一对群体中每个个体的基因型或单元型进行分型而获得。性状群体的单元型可以直接确定或可供选择地通过上述预测性基因型或单元型方法确定。
在另一个实施方案中，通过访问书面或电子形式的以前确定的频率数据获得参考和/或性状群体的频率数据。例如，该频率数据可以存在于计算机可进入的数据库中。一旦获得该频率数据，就比较参考和性状群体中感兴趣的基因型或单元型的频率。在优选实施方案中，比较群体中观察到的所有基因型和/或单元型的频率。如果在性状群体中TCF1基因的特定基因型或单元型的频率与参考群体中的频率相比高出统计学显著量，那么可以预测该性状与此TCF1基因型或单元型有关。
在优选实施方案中，使用标准ANOVA检验及Bonferoni Correction法和/或模拟很多次基因型表型关系并计算显著性值的boot-strapping方法实施统计学分析。当分析很多多态性时，可以实施针对因素的校正来纠正可能因偶然而存在的显著性关系。对于用于本发明方法中的统计学方法，见Statistical Methods in Biology，第3版，Bailey NTJ，Cambridge Univ.Press(1997)；Introduction to Computational Biology，Waterman MS，CRCPress(2000)和Bioinformatics，Baxevanis AD及Ouellette BFF编(2001)John Wiley & Sons，Inc。
在该方法的优选实施方案中，感兴趣的性状是患者对某种治疗处理显示出的临床反应，例如，对靶向TCF1的药物的反应或对医学疾病治疗处理的反应。
在本发明的另一个实施方案中，与感兴趣的TCF1基因型或单元型连锁不平衡的可检测基因型或单元型可以用作替代标记。与TCF1基因型连锁不平衡的基因型可通过如下方式发现确定在也显示潜在替代标记基因型的群体中TCF1基因的特定基因型或单元型的频率是否比参考群体中的频率高出统计学显著量，然后可预测该标记基因型与此TCF1基因型或单元型有关并可代替此TCF1基因型用作替代标记。
这里使用的术语“医学病症”包括但不限于表现出一种或多种身体和/或心理症状的期望进行治疗的任何病症或疾病，并包括以前和新近鉴定的疾病和其它紊乱。
这里使用的术语“临床反应”是指下列任何一个或全部定量测定的反应，无反应和副反应(即副作用)。
为了推出对治疗的临床反应和TCF1基因型或单元型之间的关系，需要获得接受该治疗的一群个体(下文称“临床群体”)显示出的临床反应的数据。这个临床数据可以由分析已经运行的临床试验的结果而获得和/或可以由设计并实施一种或多种新临床试验而获得。
这里使用的术语“临床试验”是指为收集对特定治疗的反应的临床数据而设计的任何研究，并包括但不限于I期、II期和III期临床试验。可以使用标准方法来限定患者群体和入选受试者。
优选已经就感兴趣的医学病症的存在对临床群体包括的个体进行了分级。这在患者表现的症状可以由一种以上的病根所引起，和这些病根的治疗不同时很重要。一个这样的例子是由于哮喘或呼吸道感染，患者遭受呼吸困难。如果两组都用哮喘药物治疗，将有一个实际未患哮喘的明显无反应者的假组。这些人将影响检测单元型和治疗结果之间任何关系的能力。潜在患者的这种分级可以使用标准身体检查或一种或多种实验室检测。可供选择地，当单元型对和疾病易感性或严重性之间有强烈关系时，患者的分级可以使用单元型分型进行。
将感兴趣的治疗处理给予试验群体的每个个体，使用一种或多种预先确定的标准测定每个个体对该治疗的反应。可以考虑到，在很多情况下，该试验群体将表现出一个反应范围，研究者可以选择由各种反应组成的反应者组的数量(如低、中、高)。此外，试验群体每个个体的TCF1基因的基因分型和/或单元型分型可在给予治疗前或后进行。
在临床和多态性数据都获得之后，建立个体反应和TCF1基因型或单元型内容之间的关系。几种方法可以产生相关性。在一个方法中，根据个体的TCF1基因型或单元型(或单元型对)对个体进行分组(也称作多态性组)，接着计算每个多态性组成员所显示的临床反应的平均数和标准差。
接着分析这些结果以确定多态性组之间任何观察到的临床反应差异是否有统计学显著性。L.D.Fisher和G.vanBelle，“BiostatisticsAMethodology for the Health Sciences”，Wiley-lnterscience(New York)1993描述了可以使用的统计学分析方法。这种分析也可以包括回归计算TCF1基因中哪个多态性位点对表型差异有最显著性贡献。2000年6月26日提交的名为“Methods for Obtaining and Using Haplotype Data”的PCT申请中描述了本发明中有用的一个回归模型。
找到TCF1单元型内容和临床反应之间的关系的第二个方法使用基于误差最小化优化算法的预测性模型。很多可能的优化算法中的一个是遗传算法(R.Judson，“遗传算法及其在化学中的应用”，《Reviews inComputational Chemistry》，Vol.10，pp.1-73，K.B.Lipkowitz和D.B.Boyd，eds.(VCH Publishers，New York，1997)。也可以使用模拟退火(Press等，“Numerical Recipes in CThe Art of Scientific Computing”，CambridgeUniversity Press(Cambridge)1992，Ch.10)，神经网络(E.Rich和K.Knight，“Artificial Intelligence”，2nd Edition(McGraw-Hill，New York，1991，Ch.18)，标准梯度下降方法(Press等，上引文，Ch.10)，或其它全局或局部优化方法(见Judson讨论，前述引文)。优选，使用2000年6月26日提交的名为“Methods for Obtaining and Using Haplotype Data”的PCT申请中描述的遗传计算法则方法找到相关性。
也可以使用方差分析(ANOVA)技术确定TCF1基因的不同多态性位点亚组解释了临床数据中的多少差异来分析相关性。如2000年6月26日申请的名为“Methods for Obtaining and Using Haplotype Data”的PCT申请中所述，ANOVA可以用于检验关于反应变量是否由一种或多种性状或可测定的变量引起或是否与之相关的假说(Fisher和vanBelle，同上引文，Ch.10)。
根据上述分析，本领域技术人员可以很容易构建数学模型，以将临床反应作为TCF1基因型或单元型内容的函数来加以预测。优选，在一个或多个为检验该模型设计的随访临床试验中验证该模型。
临床反应和TCF1基因的基因型或单元型(或单元型对)之间关系的鉴定可以作为基础用于设计诊断方法以确定会或不会对治疗产生反应，或可供选择地，会以低水平反应并因此需要更多治疗，即更大剂量药物的那些个体。诊断方法可以采用几种形式之一例如，直接DNA检测(即对TCF1基因之一个或多个多态性位点进行基因分型或单元型分型)，血清学检测，或身体检查测定。唯一的需要是诊断检测结果和根源性TCF1基因型或单元型之间要有好的相关性，而此基因型或单元型又与临床反应有关。在优选实施方案中，这个诊断方法使用上述预测性单元型分型方法。
计算机可以实施本发明方法中涉及的任何或全部分析和数学操作。而且，计算机可以执行程序，该程序产生显示装置上显示的视图(或屏幕)，通过和该界面的互作，使用者可以浏览和分析与TCF1基因及其基因组变异相关的大量信息，包括染色体位置、基因结构和基因家族、基因表达数据、多态性数据、基因序列数据和临床数据、群体数据(如，一个或多个群体的地理种群来源、临床反应、基因型和单元型的数据)。这里所述的TCF1多态性数据可以保存为关系数据库的一部分(如，Oracle数据库的一个实例或一组ASCII平面文件)。这些多态性数据可以保存在计算机硬驱或可以保存在例如CD-ROM或计算机可使用的一个或多个其它存储装置上。例如，数据可以保存在通过网络可与计算机相通讯的一个或多个数据库中。
在其它实施方案中，本发明提供了对个体中TCF1基因的单元型和/或基因型进行分型的方法、组合物和试剂盒。该方法包括鉴定GenBank登记号U72616的核苷酸483A＞G位所存在的核苷酸或核苷酸对。这个核苷酸置换使个体TCF1基因的一个或两个拷贝中的氨基酸Asn 487改变为Ser。该组合物含有设计与含有多态性位点或与之相邻的一个和多个靶区域特异性杂交的寡核苷酸探针和引物。建立个体在这里所描述的新多态性位点处的基因型或单元型的方法和组合物可用于研究该多态性在TCF1蛋白表达和功能所影响的疾病的病因学中的作用，研究靶向TCF1的药物的功效，预测个体对TCF1蛋白表达和功能所影响的疾病的易感性和预测个体对靶向TCF1的药物的反应性。
仍在另一个实施方案中，本发明提供了鉴定基因型或单元型和性状之间关系的方法。在优选实施方案中，该性状是对疾病的易感性，疾病的严重性，疾病的时期或对药物的反应。这种方法可用于开发诊断检测和治疗处理，以用于基因型和治疗结果之间可能存在关系的所有药物遗传学应用中，包括功效确定、PK确定和副作用确定。
本发明提供了存储和显示针对TCF1基因确定的多态性数据的计算机系统。该计算机系统包括计算机处理器；显示器；和含有多态性数据的数据库。该多态性数据包括在参考群体中鉴定的TCF1基因的多态性、基因型和单元型。在优选实施方案中，该计算机系统能够显示根据进化关系而组织的TCF1单元型。
在另一个方面，本发明提供了SNP探针，它在根据人们的遗传变异类型而对人们进行分类时有用。根据本发明的SNP探针是寡核苷酸，它可在传统等位基因辨别试验中对SNP核酸的两个等位基因进行辨别。
这里使用的“SNP核酸”是核酸序列，它包括一个核苷酸序列内在个体或个体组之间可变，因此，以等位基因存在的核苷酸。这种SNP核酸长度优选大约15至大约500个核苷酸。该SNP核酸可以是染色体的一部分，或它们可以是一部分染色体的确切拷贝，如，通过PCR或通过克隆得到的这一部分染色体的扩增物。SNP核酸以下简称为“SNP”。根据本发明的SNP探针是与SNP核酸互补的寡核苷酸。
这里使用的术语“互补”是指在Watson和Crick的字义上的全长寡核苷酸确切互补。
在某些优选实施方案中，根据本发明这个方面的寡核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，但不与SNP核酸的任何其它等位基因互补。根据本发明这个实施方案的寡核苷酸可以以各种方法区分SNP核酸的两个等位基因。例如，在严格杂交条件下，适当长度的寡核苷酸将与SNP核酸的一个等位基因杂交，但是不与SNP核酸的任何其它等位基因杂交。可以用放射性标记或荧光标记来标记该寡核苷酸。可供选择地，适当长度的寡核苷酸可以用作PCR引物，其中3’末端核苷酸与SNP核酸的一个等位基因互补，但是不与其它任何等位基因互补。在这个实施方案中，由PCR扩增的存在或缺乏可以确定SNP核酸的单元型。
因此，在一个实施方案中，本发明提供了分离的多核苷酸，其包含是TCF1基因或其片段的参考序列的多态性变体的核苷酸序列。参考序列包括UniGene Cluster Hs.73888，多态性变体包含至少一个多态性，包括但不限于核苷酸483A＞G。特别优选的多态性变体是TCF1基因天然存在的同种型(这里也称作“同源基因”)。
本发明的基因组和cDNA片段包含至少一个这里鉴定的新多态性位点，具有至少10个核苷酸的长度，并且范围可以达到基因全长。优选，根据本发明的片段的长度在100和3000个核苷酸之间，更优选长度在200和2000个核苷酸之间，最优选长度在500和1000个核苷酸之间。
在描述这里鉴定的多态性位点时，为了方便，提及该基因的有义链。然而，如本领域技术人员认识的，含有TCF1基因的核酸分子可以是互补双链分子，因此提及到有义链上的特定位点时同样也指互补反义链上的相应位点。因此，可以提及任何一条链上的相同多态性位点，并可以设计寡核苷酸与任何一条链上含该多态性位点的靶区域特异性杂交。因此，本发明也包括与这里所述的TCF1基因组变体的有义链互补的单链多核苷酸。
在本发明更进一步的方面，提供了鉴定患者TCF1多态性位点483A＞G的多态性模式的试剂盒，所述试剂盒包含确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具。
在优选实施方案中，这种试剂盒可以进一步包括DNA样品收集工具。
在优选实施方案中，确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具中包含至少一个TCF1基因分型寡核苷酸。特别地，确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具中包含两个TCF1基因分型寡核苷酸。而且，确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具中可以包含至少一个含有至少一个TCF1基因分型寡核苷酸的TCF1基因分型引物组合物。特别地，TCF1基因分型引物组合物可以包含至少两组等位基因特异性引物对。优选，两个TCF1基因分型寡核苷酸包装在分开的容器中。
应该理解的是，这里描述的本发明的方法通常还可以包括使用根据本发明的试剂盒。通常，本发明的方法可以离体实施，并且本发明特别考虑这种离体方法。而且，当本发明的方法可以包括可以在人或动物体上实施的步骤时，本发明特别考虑仅包含不在人或动物体上实施的那些步骤的方法。
制备含TCF1基因的多态性变体的重组细胞和/或生物体，优选重组动物，可以研究这里鉴定的多态性对TCF1表达的作用。这里使用的“表达”包括但不限于下列一种或多种基因转录为mRNA前体；前体mRNA的剪接和其它加工以产生成熟mRNA；mRNA稳定性；成熟mRNA翻译为TCF1蛋白(包括密码子使用和tRNA利用率)；和翻译产物的糖基化和/或其它修饰，如果为正确的表达和功能所需要的话。
为了制备本发明的重组细胞，期望的TCF1同源基因可以在载体中导入细胞，使得同源基因保持在染色体外。在这种情况下，细胞从染色体外位置表达该基因。在优选实施方案中，TCF1同源基因以与细胞中存在的内源TCF1基因重组的方式导入细胞。这种重组需要发生双重组事件，由此产生期望的TCF1基因多态性。用于基因导入进行重组和染色体外保持的载体是本领域已知的，任何合适的载体或载体构建体都可以用于本发明。DNA导入细胞的方法如电穿孔，粒子轰击，磷酸钙共沉淀和病毒转导是本领域已知的；因此，方法的选择在于熟练技术人员的能力和喜好。
可以导入TCF1同源基因的细胞实例包括但不限于连续培养细胞，如COS，NIH/3T3和相关组织类型(即，它们表达TCF1同源基因)的原代或培养细胞。这种重组细胞可以用于比较不同蛋白变异体的生物学活性。
使用本领域标准程序制备表达变异TCF1基因变体的重组生物体，即转基因动物。优选，包含该变体基因的构建体在胚胎期，即一细胞期或通常不晚于大约八细胞期导入非人动物或动物祖先。用本领域技术人员已知的几种方法可以制备携带本发明构建体的转基因动物。一种方法包括用构建含有一个或多个绝缘子(insulator)元件、感兴趣的一个或多个基因和本领域技术人员已知的其它成分的逆转录病毒转染胚胎，此病毒提供了一个完整的包含被隔绝的基因作为转基因的穿梭载体，如见美国专利5,610,053。另一种方法包括直接将转基因注射到胚胎中。第三种方法包括使用胚胎干细胞。
可以导入TCF1同源基因的动物实例包括但不限于小鼠、大鼠、其它啮齿动物和非人灵长类动物(见“The Introduction of Foreign Genes intoMice”和其中引用的文献，在《Recombinant DNA》，Eds.J.D.Watson，M.Gilman，J.Witkowski，和M.Zoller；W.H.Freeman and Company，NewYork，254-272页)。稳定表达人TCF1同源基因并产生人TCF1蛋白的转基因动物可以用作生物学模型，用于研究与TCF1表达和/或活性异常相关的疾病，筛选和检测各种候选药物、化合物和治疗方案以减少这些疾病的症状或作用。
此外，使用血糖控制剂或疗法进行的治疗可以用于血糖控制受损的受试者，包括2型和1型糖尿病，葡萄糖代谢受损(葡萄糖耐量受损和/或空腹葡萄糖受损)，X综合征，进餐脂血症，妊娠糖尿病，来预防或延迟个体进展为明显2型糖尿病；预防、减少或延迟选自下组的情况的发生微血管并发症增加；心血管发病率增加；过度脑血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；恶性肿瘤的发生率和死亡率增高；和其它与IGM相关的代谢失衡。
此外，血糖控制剂或疗法可以用于血糖控制受损(IGC)的受试者来预防、减少或延迟选自如下组的疾病的发生视网膜病、糖尿病的其它眼并发症、肾病、神经病变、外周血管病、坏疽、心肌梗塞、冠心病、动脉粥样硬化、其它急性和亚急性形式的冠状动脉缺血、中风、异常脂血症、高尿酸血症、高血压、心绞痛、导致截肢的微血管病变、癌症、癌症死亡、肥胖、尿酸血症、抗胰岛素性、动脉闭塞疾病和动脉粥样硬化。
根据本发明，血糖控制剂或治疗药剂可以用于IGC患者，以在IGC个体中预防或延迟进展为明显糖尿病，减少糖尿病的微血管并发症，减少血管，特别是心血管死亡率和发病率，特别是心血管发病率和死亡率，和减少与癌症相关的死亡率的增加。
因此，本发明涉及在IGC个体中用于预防或延迟个体进展为明显2型糖尿病；预防、减少或延迟选自下组的情况的发生的方法微血管并发症增加；心血管发病率增加；过度脑血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；恶性肿瘤的发生率和死亡率增加；和其它与IGM相关的代谢失衡。特别地，本发明涉及用于在IGC个体中预防，减少或延迟选自例如如下的病症发生的方法视网膜病、糖尿病的其它眼并发症、肾病、神经病变、外周血管病、外周血管病坏疽、心肌梗塞、冠心病、动脉粥样硬化、其它急性和亚急性形式的冠状动脉缺血、中风、异常脂血症、高尿酸血症、高血压、心绞痛、导致截肢的微血管病变、癌症、癌症死亡、肥胖、尿酸血症、抗胰岛素性、动脉闭塞疾病和动脉粥样硬化。
因此，本发明涉及在IGM个体，特别是IFG和IGT个体中预防或延迟个体进展为明显糖尿病，特别是2型(ICD-9代码250.2)，预防或减少微血管并发症样视网膜病(ICD-9代码250.5)，神经病变(ICD-9代码250.6)，肾病(ICD-9代码250.4)和外周血管病变或坏疽(ICD9代码250.7)(后者术语称为“微血管并发症”)的方法。本发明进一步涉及在IGC个体中在每种情况下预防或减少过度心血管发病率(ICD-9代码410-414)，如心肌梗塞(ICD-9代码410)，动脉闭塞疾病，动脉粥样硬化和其它急性和亚急性形式的冠状动脉缺血(ICD-9代码411-414)(后者术语称为“心血管发病”)的情况；预防、减少或延迟过度脑血管疾病样中风(ICD-9代码430-438)的起病，减少心血管死亡率(ICD-9代码390-459)和猝死(ICD-9代码798.1)增加；预防发展为癌症(ICD-9代码140-208)和减少癌症死亡的方法。
该方法还涉及预防或减少IGC个体在每种情况下与IGC相关的其它代谢紊乱的方法，所述紊乱包括高血糖(包括单独的餐后高血糖)、异常脂血症(ICD-9代码272)、高尿酸血症(ICD-9代码790.6)以及高血压(ICD-9代码401-404)和心绞痛(ICD-9代码413.9)。根据国际疾病分类第9版在上文和下文标记的代码及分配给它的相应定义在此并入作为参考并同样成为本发明的一部分。
本发明方法包括将有效量血糖控制剂或疗法或这种药剂或化合物的药物可接受盐给予需要之的受试者。需要这种方法的受试者是恒温动物，包括人。本发明也涉及用于IGC和相关疾病和病症如单独进餐高血糖个体中以预防或延迟发展为明显糖尿病，特别是2型糖尿病，预防、降低或延迟微血管并发症的起病，预防或减少导致截肢的坏疽或微血管病变，预防或减少过度心血管发病率和心血管死亡率，预防癌症和减少癌症死亡的方法。
本发明同样也涉及治疗IGC(包括单独进餐高血糖)相关病症和疾病的方法，包括肥胖、老化增加、妊娠期间糖尿病、异常脂血症(dyslipide-mia)、高血压、尿酸血症、抗胰岛素性、动脉闭塞疾病、动脉粥样硬化、视网膜病、肾病、心绞痛、心肌梗塞和中风。优选，所述预防应该对葡萄糖水平处于大流行病学研究中已经证明可增加心血管、微血管和癌症风险的范围内的个体起作用。这些水平包括OGTT或随机葡萄糖评价后血浆葡萄糖水平7.8mmol/L和/或空腹血浆葡萄糖在IFG范围(空腹血浆葡萄糖在6.1和7mmol/l之间)。当新的流行病学资料加入降低了勿庸置疑与上面提及的风险相关的血糖水平时，或当定义风险组的国际标准改变时，本发明也同样有理由可以用于治疗这些风险组。
本发明也涉及用于IFG个体的方法，包括给需要它的个体施与治疗有效量的血糖控制剂，包括但不限于DPP-IV抑制剂。
本发明涉及血糖控制剂或其药物可接受盐在制备预防或延迟IGC受试者进展为明显2型糖尿病，预防、减少或延迟选自下组的情况的发生的药物中的应用微血管并发症增加；心血管发病率增加；过度脑血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；恶性肿瘤的发生率和死亡率增高；和与IGC相关的其它代谢紊乱。
本发明涉及血糖控制剂包括DPP4抑制剂或其药物可接受盐在制备在IGC和相关疾病和病症如单独进餐高血糖的受试者中用于下列情况的药物中的应用预防或延迟进展为明显糖尿病，特别是2型糖尿病，预防或减少微血管并发症，预防或减少过度心血管发病率和心血管死亡率，预防癌症和减少癌症死亡。
相应的活性成分或其药物可接受盐也可以以水合物形式使用或包括用于结晶的其它溶剂。此外，本发明涉及组合，如组合的制剂或药物组合物，其分别包含一种以上血糖控制剂，用于在IGM个体，特别是IFG和/或IGT个体中预防或延迟进展为明显2型糖尿病；预防、减少或延迟选自下组的情况的发生微血管本发明增加；心血管发病率增加；过度脑血管疾病；心血管死亡率和猝死增加；恶性肿瘤的发生率和死亡率增高；和与IGM相关的其它代谢紊乱。
应用本发明的组合时的其它益处是根据本发明进行组合的各单个药物的较低给药可用于减少剂量，例如，需要的剂量通常不仅更少而且施用频率更小，或可用于减少副作用的发生。这是符合待治疗患者的愿望和需要的。优选，根据本发明的组合，可以将联合治疗有效量的活性剂同时地或以任何顺序相继地、分开地或以固定组合给予。
这里使用的术语“治疗有效量”是指药物或组合的量会在恒温动物(包括人)中引起为达到根据本发明所说明的治疗效果所需的生物学或医学反应。当给予单一药剂和两种或两种以上化合物的固定或自由组合时，可以给予“治疗有效量”。
这里使用的“联合有效量”是指当联合给予(固定或自由的)多种药剂可达到整体治疗作用时，联合中的一种或多种成分的量，该量本身可能无效，但当根据本发明与一种或多种其它药剂组合联合使用时，却可以是治疗有效的。上文和下文所述根据本发明的药物组合物可以同时使用或以任何顺序相继使用，分开使用或以固定组合使用。
优选的血糖控制剂包括但不限于DPP4抑制剂，如化合物2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)和(1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈)，或如果适当，在每种情况下，其药物可接受盐。
在变通方案中，本发明也涉及“多部分试剂盒”，例如，如下意义上的“多部分试剂盒”根据本发明组合的成分可以单独给药或使用具有可区分量的这些成分的不同固定组合给药，即同时或在不同时间点给药。因此多部分试剂盒的各部分可以例如同时或按时间顺序交错给予，即在不同时间点和以相同或不同时间间隔给予多部分试剂盒的任何部分。优选，选择时间间隔使得这些部分的联合使用对被治疗的疾病或病症的作用大于仅使用任何一种成分时获得的作用。本发明进一步涉及包括根据本发明的组合连同用于同时、分开或相继使用的说明书的商业包。待组合的化合物可以以药物可接受盐存在。如果这些化合物具有例如至少一个碱性中心，那么它们可形成酸加成盐。如果期望，也可以形成具有另外存在的碱性中心的相应酸加成盐。具有酸性基团(例如COOH)的化合物也可以与碱形成盐。药物可接受盐为例如与碱形成的盐，即阳离子盐如碱和碱土金属盐，以及铵盐。
根据本发明的药物组合物可以以本身已知的方式制备，并可以是适合肠道内，如口服或直肠，和非肠道给予哺乳动物(恒温动物)，包括人，的那些，其包括单独或与一种或多种药物可接受载体，特别是适合肠道内或非肠道应用的载体组合的治疗有效量的药理学活性化合物。
新的药物制剂含有，例如，大约10％至大约100％，优选80％，最优选大约90％至大约99％的活性成分。根据本发明的肠道内或非肠道给予的药物制剂是例如以单位剂量形式存在的那些，如糖衣片剂、片剂、胶囊或栓剂，或安瓿。以本领域技术人员熟知的方式可以制备这些制剂，例如利用常规混和、成粒、包糖衣、溶解或冻干方法。因此，口服使用的药物制剂可以通过活性成分与固体载体混合，如果期望，将所得混合物成粒，并加工该混合物或颗粒——如果期望或需要，在添加适当赋形剂后加工——得到片或糖衣片核芯而获得。
待用于治疗以血糖控制受损为特征的疾病或紊乱的本发明化合物和它们相应的药物可接受酸加成盐的精确剂量依赖于几个因素，包括宿主、所治疗疾病的性质和严重性，使用的给药方式和特定化合物。然而通常，当肠道内如口服，或非肠道如静脉内(但优选口服)，以每日0.002-10mg/kg体重的剂量，优选0.02-2.5mg/kg体重，或对于最大的灵长目，每日0.1-250的剂量，优选1-100mg给予本发明的化合物或相应药物可接受酸加成盐时，可有效治疗以血糖控制受损为特征的疾病或紊乱。典型的口服剂量单位是0.01-0.75mg/kg，每日一至三次。
通常，最初以小剂量给予，逐步增加剂量直到确定治疗下对宿主的最佳剂量。剂量上限受副作用影响，可通过试验确定正治疗的宿主的剂量上限。
本发明的化合物和它们相应的药物可接受酸加成盐可以与一种或多种药物可接受载体，和任选地一种或多种其它常规药物辅料组合，并以片剂、胶囊、囊片(Caplet)等形式肠道内给予，如口服，或以无菌注射液或悬液形式非肠道给予，如静脉内给予。
本发明的化合物和它们相应的药物可接受酸加成盐可以配制成含有对于治疗以血糖控制受损为特征的疾病或紊乱有效的量的活性物质和药物可接受载体的肠道内和非肠道药物组合物，这种组合物可以配制成单位剂量形式。
本发明的化合物(包括其每个亚范围和每个实施例的化合物)可以以纯对映体形式(如一种对映体纯度大于98％和优选纯度大于99％)或两种对映体同时存在的形式，如外消旋形式给予。上述剂量范围基于本发明化合物的单一对映体。(不包括活性较小的对映体的量，即使其存在的话)本领域技术人员完全能够基于其知识确定具体血糖控制剂，包括DPP4抑制剂的具体剂量，无论其是单独或组合使用。
实施例在下列实施例中描述本发明的优选实施方案。根据对这里公开的本发明说明书或实施的理解，在权利要求范围内的其它实施方案对本领域技术人员来说很明显。意思是认为说明书，连同实施例仅是示例性的，实施例后的权利要求表示本发明的范围和精神。
实施例1常规筛选中，发现一位40岁女性有升高的血液葡萄糖水平。她的医师进行口服葡萄糖耐量测试并确定该患者为葡萄糖耐量受损。该医师与患者讨论葡萄糖耐量受损的短和长期结果和进展为明显糖尿病的可能性。该医师也讨论了可使用的治疗形式，包括膳食、减重、锻炼和药物，包括各种血糖控制剂如DPP4抑制剂。此外，该医师与该患者商议关于测试她的TCF1基因中多态性存在的可能性并解释了对于使用药物包括DPP4抑制剂，这个结果将意味着什么。
该患者同意测试，基因分型显示存在GG基因型。基于这些结果，该医师推荐并且该患者同意药物如DPP4抑制剂试验来帮助校正她的异常葡萄糖耐量和餐后高血糖。
实施例2医师观察到一位52岁II型糖尿病男性。该患者正在服用血糖控制剂并且葡萄糖水平控制很好，但是该患者遭受着来自该药物的很多副作用。医师推荐基因分型并且与该患者商议了基因分型结果将允许的治疗选择。该患者经过测试被确定具有与对DPP4抑制剂产生最有利反应相关的基因型。基于这个结果和预期对DPP4抑制剂的高敏感性，该医师能够推荐伴减少的副作用可能性的低剂量DPP4抑制剂治疗方案。这种治疗可以补充使用降低剂量的以前治疗这个患者时使用的且不能耐受的血糖控制剂进行的连续治疗，或可代替为单独低剂量DPP抑制剂方案。
定义本公开物的上下文中，除非另有说明，下列术语定义如下等位基因一种特定形式的遗传座位，其以特定的核苷酸序列和其它形式相区别。
候选基因假定为对疾病、病症或治疗反应负责，或与这些中的一种相关的基因。
基因含有使RNA产物受调节地生物合成的所有信息的DNA片段，包括启动子、外显子、内含子和控制表达的其它非翻译区域。
基因型个体的一对同源染色体上一个座位中的一个或多个多态性位点处存在的无定相的(unphased)5’至3’核苷酸对序列。这里使用的基因型包括如下所述的全基因型和/或亚基因型。
全基因型单个个体的一对同源染色体上一个座位中的所有已知多态性位点上存在的无定相的5’至3’核苷酸对序列。
亚基因型单个个体的一对同源染色体上一个座位中的一个已知多态性位点亚组上存在的无定相的5’至3’核苷酸序列。
基因分型确定个体基因型的过程。
单元型单个个体的一条染色体上一个座位中的一个或多个多态性位点上存在的5’至3’核苷酸序列。这里使用的单元型包括如下所述的全单元型和/或亚单元型。
全单元型单个个体的一条染色体上一个座位中的所有已知多态性位点上存在的5’至3’核苷酸序列。
亚单元型单个个体的一条染色体上一个座位中的一个已知多态性位点亚组上存在的5’至3’核苷酸序列。
单元型对单个个体的一个座位中发现的两个单元型。
单元型分型确定个体的一个或多个单元型的过程，包括使用家族谱系，分子技术和/或统计学推论。
单元型数据关于一个特定基因的一个或多个下列情况的信息群体中每个个体的单元型对列表；群体中不同单元型的列表；这个或其它群体中每个单元型的频率；和一个或多个单元型和性状之间的任何已知关系。
同种型一种特定形式的基因、mRNA、cDNA或由此编码的蛋白，其以特定序列和/或结构与其它形式相区别。
同源基因群体中发现的一个基因的同种型中的一种。一个同源基因含有该基因的该特定同种型中存在的所有多态性。
分离的当应用于生物学分子如RNA、DNA、寡核苷酸或蛋白时，分离的是指该分子基本上不含其它生物学分子如核酸、蛋白、脂类、碳水化合物或其它物质如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”不旨在指完全缺乏这些物质或缺乏水、缓冲液或盐，但条件是它们存在的量不实质上干扰本发明的方法。
连锁描述由于基因在相同染色体上的位置而将一起被遗传的趋势；由座位之间的重组百分比测定。
连锁不平衡描述遗传标记的一些组合在群体中的发生频率比由它们的间隔距离所预期的频率高或低的情况。它意味着一组标记协同遗传。它可以由该区域中降低的重组或建立者效应——其中自一个标记被导入群体，还没有足够时间达到平衡——而引起。
座位与基因或身体或表型特征相对应的染色体或DNA分子上的位置。
天然存在该术语用于指它所应用的对象，如天然存在的多核苷酸或多肽，可从自然的来源分离且尚未被人有意改变。
核苷酸对个体染色体的两个拷贝上的多态性位点上存在的核苷酸。
定相的(Phased)当应用于一个座位中两个或两个以上多态性位点的核苷酸对的序列时，它是指该座点的单一拷贝上的那些多态性位点上存在的核苷酸组合是已知的。
多态性位点(PS)座位中的位置，在此位置群体中存在至少两个可替换的序列，它的最大频率是至多99％的频率。
多态性变体由于基因中多态性的存在，具有与参考序列不同的核苷酸或氨基酸序列的基因、mRNA、cDNA、多肽或肽。
多态性在个体的多态性位点上观察到的序列变异。多态性包括核苷酸置换、插入、缺失和微卫星，并且可以但不是必须引起基因表达或蛋白功能的可检测差异。
多态性数据关于一个特定基因的一个或多个下列情况的信息多态性位点的位置；那些位点的序列变异；一个或多个群体中多态性的频率；所确定的基因的不同基因型和/或单元型；一个或多个群体中这些基因型和/或单元型中的一个或多个的频率；性状和基因的基因型或单元型之间的任何已知关系。
多态性数据库以系统的或有系统的方式排列的多态性数据集合，其能够通过电子或其它方法逐个获取。
多核苷酸由单链RNA或DNA组成，或由互补的双链DNA组成的核酸分子。
群体组具有共同特征，如地理种群来源、医学疾病、对治疗的反应等......的个体组。
参考群体预测可以代表群体组的1个或多个特征的受试者或个体的组。典型地，参考群体代表群体中至少85％，优选至少90％，更优选至少95％和甚至更优选至少99％确定水平的遗传变异。
单核苷酸多态性(SNP)典型地，单一多态性位点上观察到的特定核苷酸对。在很少情况下，可以发现三或四个核苷酸。
受试者待确定基因型或单元型或对治疗的反应或疾病状况的人类个体。
治疗从内部或外部给予受试者的刺激。
无定相的(Unphased)当应用于一个座位中两个或两个以上多态性位点的核苷酸对的序列时，它是指该座位的单一拷贝上的那些多态性位点上存在的核苷酸组合是未知的。
DPP4抑制剂-这里使用的术语DPP4抑制剂是指能够抑制DPP4酶(DPP-IV；二肽基肽酶IV；EC 3.4.14.5)的催化作用的化合物，DPP4酶是等同于ADA复合蛋白2和T细胞活化抗原CD26的丝氨酸外肽酶。
引用的参考文献这里引用的所有参考文献的全部内容为所有目的并入这里作为参考，如同每个出版物或专利或专利申请的全部内容被专门地单独指出为所有目的并入作为参考一样。这里的参考文献的讨论仅意欲概括它们的作者的主张，而不承认任何参考文献都构成现有技术。申请人保留挑战所引用参考文献的准确性和中肯性的权利。
此外，这里引用的所有GenBank登记号，Unigene Cluster号和蛋白登记号的全部内容为所有目的并入这里作为参考，程度如同为了所有目的将每个编号的全部内容专门单独指出并入作为参考一样。
本发明不限于本申请中描述的具体实施方案，具体实施方案旨在单独举例阐述本发明的单个方面。如对本领域技术人员很明显的，可以在不背离本发明精神和范围的情况下，对本发明作出很多修改和变形。除了这里列举的那些外，根据前面的说明书和所附附图，本发明范围内的功能等同方法和装置对本领域技术人员来说很明显。这些修改和变形意欲包括在所附权利要求的范围内。本发明仅由所附权利要求，连同这些权利要求有权要求的等同物的全部范围来限定。
序列表<110>诺瓦提斯公司<120>基于TCF1基因多态性治疗糖尿病和相关病症的方法<130>4-32215/PROV/USN<160>4<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>300<212>DNA<213>人(Homo sapien)<400>1ggcccagctg attccctccc cttccactcc aggcctggcc tccacgcagg cacagagtgt 60gccggtcatc aacagcatgg gcagcagcct gaccaccctg cagcccgtcc agttctccca120gccgctgcac ccctcctacc agcagccgct catgccacct gtgcagagcc atgtgaccca180gaaccccttc atggccacca tggctcagct gcagagcccc cacggtgagc accctgtgcc240ccacacagca ggagatgatg atagaggttg gctgtcaatg gatgcagggg aaaggggtgc300<210>2<211>26<212>DNA<213>人<400>2ctgagccatg gtggccatga agggga 26<210>3<211>26<212>DNA<213>人<400>3cgcgccgagg ttctgggtca catggc26
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权利要求
1.一种确定患有以血糖控制受损为特征的紊乱的个体对血糖控制剂或疗法的反应性的方法，包括(a)确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，和(b)如果两对都是GC或如果一对是AT而一对是GC，则将该个体分配到良好反应组，如果两对都是AT，则分配到低反应组。
2.权利要求1的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂。
3.权利要求1的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)。
4.权利要求1的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈。
5.权利要求1的方法，其中血糖控制剂或疗法选自式I或式II的化合物。
6.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是2型糖尿病。
7.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是1型糖尿病。
8.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是葡萄糖耐量受损。
9.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是空腹葡萄糖受损。
10.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是X综合征。
11.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是妊娠糖尿病。
12.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是葡萄糖代谢受损(IGM)。
13.权利要求1，2，3，4或5的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是对DPP4抑制剂有反应的紊乱。
14.一种患有以血糖控制受损为特征的紊乱的个体的治疗方法，包括(a)确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，(b)如果两个核苷酸对都是CG或如果一对是AT而一对是CG，则用血糖控制剂或疗法治疗该个体，而如果两个核苷酸对都是AT，则用替代疗法治疗该个体。
15.权利要求14的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂。
16.权利要求14的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)。
17.权利要求14的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈。
18.权利要求14的方法，其中血糖控制剂选自式I或式II的化合物。
19.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是2型糖尿病。
20.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是1型糖尿病。
21.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是葡萄糖耐量受损。
22.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是空腹葡萄糖受损。
23.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是X综合征。
24.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是妊娠糖尿病。
25.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是葡萄糖代谢受损(IGM)。
26.权利要求14，15，16，17或18的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是对DPP4抑制剂有反应的紊乱。
27.一种鉴定性状和TCF1基因的至少一个基因型或单元型之间的相关性的方法，包括比较显示该性状的群体中所述基因型或单元型的频率和参考群体中所述基因型或单元型的频率，其中基因型或单元型包括位于多态性位点483A＞G的核苷酸对或核苷酸，其中性状群体的基因型或单元型频率高于参考群体的，表明该性状与该基因型或单元型相关。
28.权利要求26的方法，其中性状是对靶向TCF1或DPP4的药物的临床反应。
29.一种治疗患有以血糖控制受损为特征的紊乱的个体的方法，包括(a)确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G处的核苷酸对的身份，其中，(b)如果两个核苷酸对都是CG或如果一对是AT而一对是CG，则用低剂量血糖控制剂治疗该个体，而如果核苷酸对都是AT，则用高剂量血糖控制剂治疗该个体。
30.权利要求29的方法，其中血糖控制剂是二肽基肽酶4(DPP4)抑制剂。
31.权利要求29的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予2-吡咯烷甲腈，1-[[[2-[(5-氰基-2-吡啶基)氨基]乙基]氨基]乙酰基]-，(2S)。
32.权利要求29的方法，其中血糖控制剂或疗法包括给予1-[(3-羟基-金刚烷-1-基氨基)-乙酰基]-吡咯烷-2(S)-甲腈。
33.权利要求29的方法，其中血糖控制剂或疗法选自式I或式II的化合物。
34.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是2型糖尿病。
35.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是1型糖尿病。
36.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是葡萄糖耐量受损。
37.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是空腹葡萄糖受损。
38.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是X综合征。
39.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是妊娠糖尿病。
40.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是葡萄糖代谢受损(IGM)。
41.权利要求29，30，31，32或33的方法，其中以血糖控制受损为特征的紊乱是对DPP4抑制剂有反应的紊乱。
42.一种治疗患有以血糖控制受损为特征的紊乱的患者的方法，包括(a)给患者和患者家庭提供遗传咨询，(b)确定该患者TCF1基因在多态性位点483A＞G的基因型，(c)基于基因型确定结果，确定所述患者的适当疗法。
43.一种优化血糖控制剂的临床试验设计的方法，包括(a)确定考虑包括在临床试验中的个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G的核苷酸对的身份，其中，(b)如果两个核苷酸对都是CG，或如果一对是AT而一对是CG，那么该个体包括在临床试验中，如果核苷酸对都是AT，则不包括该个体。
44.一种鉴定患有以血糖控制受损为特征的个体将受益于药物A还是B的方法，包括(a)确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G的核苷酸对的身份，其中，(b)如果两个核苷酸对都是CG，或如果一对是AT而一对是CG，那么该个体将受益于血糖控制剂或疗法，如果核苷酸对都是AT，该个体将受益于替代性血糖控制疗法。
45.一种用于确定哪些患有以血糖控制受损为特征的紊乱的个体可以用血糖控制剂治疗而具有降低的副作用的方法，包括确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在多态性位点483A＞G的核苷酸对的身份，其中，如果两个核苷酸对都是CG，或如果一对是AT而一对是CG，那么可以用较低剂量血糖控制剂治疗该个体并伴随较少的副作用，而如果核苷酸对都是AT，则必须用较高剂量血糖控制剂治疗该个体且因此副作用较大。
46.一种确定患有以血糖控制受损为特征的紊乱的个体对血糖控制剂或疗法治疗的反应性的方法，包括(a)确定个体中存在的TCF1基因的两个拷贝在与TCF1 483A＞G多态性位点连锁不平衡的TCF1基因区域中的多态性位点处的核苷酸对的身份，和(b)如果与多态性位点483A＞G连锁不平衡的TCF1基因区域中的多态性位点处的核苷酸对指示，在TCF1多态性位点483A＞G处两个核苷酸对都是GC或一对是AT而一对是GC，则将该个体分配到良好反应组，而如果所述核苷酸对指示在TCF1483A＞G位点处两对核苷酸都是AT，则将该个体分配到低反应组。
47.一种鉴定患者TCF1多态性位点483A＞G的多态性模式的试剂盒，所述试剂盒包括用于确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具。
48.根据权利要求47的试剂盒，其还包括DNA样品收集工具。
49.根据权利要求47或48的试剂盒，其中用于确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具包括至少一个TCF1基因分型寡核苷酸。
50.根据权利要求47至49之任一的试剂盒，其中用于确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具包括两个TCF1基因分型寡核苷酸。
51.根据权利要求47至50之任一的试剂盒，其中用于确定TCF1多态性位点483A＞G的遗传多态性模式的工具包括至少一个含有至少一个TCF1基因分型寡核苷酸的TCF1基因分型引物组合物。
52.根据权利要求51的试剂盒，其中TCF1基因分型引物组合物包括至少两组等位基因特异性引物对。
53.根据权利要求50至52之任一的试剂盒，其中两个TCF1基因分型寡核苷酸包装在分开的容器中。
54.根据权利要求1，14，29，43，44或46之任一的方法，其中确定步骤(a)还包括使用根据权利要求47-53之任一的试剂盒。
55.根据权利要求1-46之任一的方法，其中所述方法离体实施。
全文摘要
本发明涉及应用TCF1基因的483 A＞G单核苷酸多态性和血糖控制紊乱，特别是糖尿病和葡萄糖代谢受损患者对血糖控制剂如DPPIV抑制剂的临床反应之间的新的相关性。本发明提供了对患者进行分类以进行治疗和/或优化临床研究的方法和基于此相关性治疗患者的方法。
文档编号A61K31/4439GK1604968SQ02825179
公开日2005年4月6日 申请日期2002年10月30日 优先权日2001年10月31日
发明者T·E·休斯, C·N·拉韦丹, M·H·波利梅罗普罗斯 申请人:诺瓦提斯公司