专利名称：一种多靶点抑制肿瘤生长的新基因工程药的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用真核和原核细胞表达的血管基膜衍生多功能肽及/或血管基膜衍生多功能肽融合蛋白，作为一种新抗肿瘤基因工程药。
背景技术：
胶原IV是血管基底膜的主要大分子，能促进细胞的粘附，迁移，分化和生长。组成胶原IV的核苷酸编码六条不同的α链，即α1～α6，胶原IV的每条α链由三个部分组成N-端的7 S区域，中间的三股螺旋区域，C-端的非胶原区域1(NC1)。肿瘤抑素(Tumstatin)由胶原IVα3链的中间三股螺旋区域C-端12氨基酸和非胶原区域1(NC1)共244氨基酸组成。它的两个功能区域(74～98氨基酸)和(197～215氨基酸)功能多肽分别具有抑制血管内皮细胞增殖、诱导内皮细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖的活性，然而，197～215氨基酸功能肽作为Tumstatin整体的一部分时，没有直接抑制肿瘤细胞增殖的功能。这是受空间结构影响，tumstatin(197～215氨基酸)活性区域受体结合部位被掩盖，阻碍了与受体的结合，影响了功能的发挥。
实体瘤的生长和转移取决于肿瘤细胞和血管内皮细胞这两类细胞的数量，两者相互依存。任何一种细胞群的增减必然导致另一类细胞的相应增减。因此，抑制任何一类细胞的药物都具有肿瘤治疗作用。前者是以抑制肿瘤细胞增殖为靶的肿瘤化学治疗，后者是肿瘤血管生成抑制剂(如Endostatin，Tumstatin等)为主的抗肿瘤血管生成疗法。
血管生成抑制剂与现今常用化疗药物比较有如下优点(1)血管生成抑制剂直接作用于血管内皮细胞能很快聚集于血管内皮细胞增殖速度快的肿瘤部位，而化疗药经组织扩散时受组织坏死、纤维化、组织内高压的影响，常在组织内达不到有效浓度；(2)肿瘤血管内皮细胞除了增殖速度大大快于正常血管内皮细胞外，其余的类似于正常组织，基因型稳定，不易产生耐药性，肿瘤细胞基因型不稳定，易产生耐药性；(3)原发肿瘤和继发肿瘤的血管内皮相同，抗血管生成疗法的效果相似，而原发灶和继发灶中的肿瘤细胞的生物学特性差异较大，化疗反应各异；(4)肿瘤血管内皮细胞较正常组织血管内皮细胞增殖的速度快几十倍，血管生成抑制剂对快速增埴的肿瘤血管内皮细胞有选择性的作用，对正常组织血管内皮细胞作用小，而化疗药对正常细胞毒副作用较大。但血管生成抑制剂无法根治实体瘤(小的实体瘤能无血管生存)，必须长期应用，一旦停药，肿瘤可能会继续生长。因此，有机综合抗肿瘤血管生成疗法和抑制肿瘤细胞增殖策略将有助于提高实体瘤临床治疗效果，是肿瘤防治药物研究的发展趋势。
本发明血管基膜衍生多功能肽及/或血管基膜衍生多功能肽融合蛋白是一种多靶点抑制肿瘤生长新基因工程新药，血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP-GST 10mg/kg，6mg/kg，2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌皮下接种原发瘤具有显著抑制作用(瘤重抑制率分别为95.5％，80.4％，60.05％)。血管基膜衍生多功能肽(VBMDMP-GST 10mg/kg，6mg/kg，2mg/kg)对小鼠Lewis肺癌自发性肺转移具有显著抑制作用(自发性肺转移瘤结节抑制率分别为94.8％，86.4％，73.9％)。
发明内容
本发明的目的在于利用IgG3上游铰链柔性接头连接，使肿瘤抑素(Tumstatin)两个功能区的空间结构自然伸展，达到抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞的双重功能，获得一种新抗肿瘤基因工程药，即血管基膜衍生多功能肽(vascular basement membrane～derived multifunctional peptide，VBMDMP)。
本发明的技术解决方案1.构建VBMDMP克隆载体用DNA合成仪人工合成VBMDMP DNA全序列，序列如下cgggatccacaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgaaatgattattcatacBamHI Tumstatin 74～98aa对应序列tggctgaccccacttggtgacacaactcacacatccggatgcaactactattcaaattcctacagtttctggctggctIgG3上游绞链区序列 Tumstat in 197～215aa对应序列tcattaaacccagaaagaaagcttcccHindIIIBamHI和HindIII双酶切该序列和pUC19质粒，T4DNA酶16□连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细菌，氨苄青霉素(Amp)筛选阳性克隆，小量提取质粒，酶切、测序鉴定。
2.构建VBMDMP表达载体用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切VBMDMP/pUC19质粒，重新设计PCR引物，5’端含EcoRI，3’端含SalI酶切位点F1GCGAATTCACAATGCCATTCTTATTCTG(EcoRI)F2GCGTCGACTCTTTCTGGGTTTAATGAAG(SalI)PCR扩增目的片段VBMDMP，然后EcoRI和Sal双酶切表达载体pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，回收酶切后的pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，T4DNA连接酶连接过夜，转化感受态Ecoli JM109，Amp筛选阳性克隆。挑取阳性克隆于含Amp 100mg.L-1的LB培养基中37℃过夜培养，小量提取质粒，酶切、普通PCR初步鉴定、经上海生工公司测序鉴定3.VBMDMP的原核表达和纯化取鉴定后的单克隆菌落于5ml LB培养基，37℃过夜培养，以1∶100接种于新鲜培养基250r/min振摇3h，加入IPTG0.1mmol.L-1.M诱导3～7h，取1ml菌液，12000g×5min离心收集菌体。用PBS洗涤1次，加入等体积的蛋白质上样缓冲液，沸水浴中5min后上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，电泳缓冲液采用Tris-甘氨酸系统。重组菌株菌液100ml诱导4h后，培养液5000g×10min收集菌体，悬浮于1ml预冷的PBS(150mmol.L-1NaCl，16mmol.L-1Na2HPO4，4mmol.L-1NaH2PO4，pH7.4)中，冰上超声破碎细胞10×30s然后加入预冷的Triton X-100至终浓度1％，4℃温和搅拌30min，离心12000g×5min，收集破碎的上清液过Glutathione Sepharose 4B层析柱；PBS，pH7.3充分洗脱，然后用5～10倍柱床体积的还原型谷胱甘肽洗脱(20mmol.L-1)，浓缩收集成分即为纯化的ST-VBMDMP。蛋白质含量测定参照Bradford方法，以BSA为标准。本发明的目的在于利用IgG3上游铰链柔性接头连接，使肿瘤抑素(Tumstatin)两个功能区的空间结构自然伸展，达到抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞的双重功能，获得一种新抗肿瘤基因工程药，即血管基膜衍生多功能肽(vascular basementmembrane～derived multifunctional peptide，VBMDMP)。
血管基膜衍生多功能肽由55个氨基酸组成，其氨基酸序列如下Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Ser-Gly-Cys-Asn-Tyr-Tyr-Ser-Asn-Ser-Tyr-Ser-Phe-Trp-Leu-Ala-Ser-Leu-Asn-Pro-Glu-Arg该肽的分子量为6.38kDa，等电点为4.395。
本发明通过用原核或真核细胞表达血管基膜衍生多功能肽及/或血管基膜衍生多功能肽融合蛋白。体内外药效学实验证实血管基膜衍生多功能肽是一种全新的同时具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖两种不同抗肿瘤特性的新基因工程药物。
下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
图1是本发明专利的VBMDMP/pUC19酶切分析图。
图2是本发明专利的VBMDMP/pGEX-4T-1的测序报告。
图3是本发明专利的纯化GST-VBMDMP融合蛋白的SDS-PAGE分析。
图1图标M为DNA标准；图标1、图标2为VBMDMP/PUC19用BamHI和HindIII酶切可见清晰180bp条带，认为获得重组目的基因；图标3为PUC19用BamHI和HindIII酶切对照无180bp条带。
图2测序图示插入序列与VBMDMP序列完全相符。
图3图标M为蛋白质分子量标准；图标1为IPTG诱导3小时的PGEX-4T-1/JM109菌液的电泳图谱；图标2为纯化的GST蛋白(26KD)；图标3为IPTG诱导3小时的VBMDMP/PGEX-4T-1/JM109菌液电泳图谱；图标4为为纯化的vbmdmp-GST蛋白(32KD)。
具体实施例方式
下面结合实施方式对本发明作进一步详细的说明。
1.VBMDMP克隆载体的构建 用DNA合成仪人工合成VBMDMP DNA全序列如下cgggatccacaatgccattcttattctgcaatgtcaatgatgtatgtaattttgcatctcgaaatgattattcatacBamHI Tumstatin 74～98aa对应序列tggctgaccccacttggtgacacaactcacacatccggatgcaactactattcaaattcctacagtttctggctggctIgG3上游绞链区序列 Tumstatin 197～215aa对应序列tcattaaacccagaaagaaagcttcccHindIII
JM109感受态细菌，氨苄青霉素(Amp)筛选阳性克隆，获得重组质粒VBMDMP/pUC19。
小量提取质粒，BamHI和HindIII双酶切该重组质粒，1％琼脂糖电泳，出现了质粒条带和180bp条带(图1)。初步认为获得了重组子。对该重组子进行序列测定，结果表明，插入序列与人工合成VBMDMP DNA序列完全一致。
VBMDMP DNA序列如下2.VBMDMP表达载体的构建用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切VBMDMP/pUC19质粒，重新设计引物，5’端含EcoRI，3’端含SalI酶切位点F1GCGAATTCACAATGCCATTCTTATTCTG(EcoRI)F2GCGTCGACTCTTTCTGGGTTTAATGAAG(SalI)PCR(PCR缓冲液10×5μl；Taq酶0.5μl；dNTP 2μl；F1，F2 0.25μl；模板1μl，94℃2min；94℃45s；56℃45s72℃1min；72℃5min，从第2步至第4步延伸35个循环)扩增目的片段，用PCR产物回收试剂盒回收目的片段VBMDMP，EcoRI和Sal双酶切pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，回收酶切后的pGEX-4T-1和目的片段VBMDMP，T4DNA连接酶连接过夜，转化感受态E coli JM109，Amp筛选阳性克隆。挑取阳性克隆于含Amp 100mg.L-1的LB培养基中37℃过夜培养，获得表达载体质粒VBMDMP/pGEX-4T-1。
用EcoRI和SalI双酶切提取的质粒VBMDMP/pGEX-4T-1，可切出质粒大片段条带和180bp左右片段，表明扩增的VBMDMP片段已插入载体质粒中。测序分析表明与VBMDMP序列相符(图2)。
3.VBMDMP的纯化 取鉴定后的单克隆菌落于5ml LB培养基，37℃过夜培养，以1∶100接种于新鲜培养基250r/min振摇3h，加入IPTG0.1mmol.L-1.M诱导3～7h，取1ml菌液，12000g×5min离心收集菌体。用PBS洗涤1次，加入等体积的蛋白质上样缓冲液，沸水浴中5min后上样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，浓缩胶浓度为5％，分离胶浓度为12％，电泳缓冲液采用Tris-甘氨酸系统。重组菌株菌液100ml诱导4h后，培养液5000g×10min收集菌体，悬浮于1ml预冷的PBS(150mmol.L-1NaCl，16mmol.L-1Na2HPO4，4mmol.L-1NaH2PO4，pH7.4)中，冰上超声破碎细胞10×30s然后加入预冷的Triton X-100至终浓度1％，4℃温和搅拌30min，离心12000g×5min，收集破碎的上清液过Glutathione Sepharose 4B层析柱；PBS，pH7.3充分洗脱，然后用5～10倍柱床体积的还原型谷胱甘肽洗脱(20mmol.L-1)，浓缩收集成分即为纯化的GST-VBMDMP。蛋白质含量测定参照Bradford方法，以BSA为标准。
对照JM109组(转化有载体质粒pGEX-4T-1)可诱导26kD的特异蛋白(GST片段)，转化有重组质粒VBMDMP/pGEX-4T-1的JM109经IPTG诱导后，在33kD左右出现一条新的蛋白带，与预期的分子量大小相吻合，而在26KD处的蛋白带消失了，说明插入的外源基因已经成功地在大肠杆菌中表达，并与GST形成了融合蛋白。可溶性成分直接用Glutathione Sepharose 4B层析柱纯化表达产物上清液，得到高纯度的GST-VBMDMP融合蛋白(如图3所示)。GST-VBMDMP占大肠杆菌表达产物的18.5％，纯化效率为90％。
权利要求
1.一种多靶点抑制肿瘤生长的新基因工程药，其特征在于它是用原核或真核细胞表达的由人IgG3上游铰链区序列(该序列由11个氨基酸组成，柔性好，不影响连接肽段的空间构象)连接Tumstatin的N-端74～98氨基酸功能肽(25个氨基酸性)和Tumstatin197～215氨基酸功能肽(19个氨基酸)组成的55个氨基酸的肽，命名为血管基膜衍生多功能肽。其氨基酸序列如下Thr-Met-Pro-Phe-Leu-Phe-Cys-Asn-Val-Asn-Asp-Val-Cys-Asn-Phe-Ala-Ser-Arg-Asn-Asp-Tyr-Ser-Tyr-Trp-Leu-Thr-Pro-Leu-Cys-Asp-Thr-Thr-His-Thr-Ser-Gly-Cys-Asn-Tyr-Tyr-Ser-Asn-Ser-Tyr-Ser-Phe-Trp-Leu-Ala-Ser-Leu-Asn-Pro-Glu-Arg该肽的分子量为6.38kDa，等电点为4.395。该肽具有抑制血管内皮细胞增殖和抑制肿瘤细胞增殖的两种不同抗肿瘤特性。
2.按权利要求1所述的血管基膜衍生多功能肽与GST、6×His Tag、β-半乳糖苷酸，trpE，硫氧还蛋白(Trx)等用原核或真核细胞表达的融合蛋白作为抗肿瘤药物应用。
全文摘要
本发明涉及一种新多肽，即血管基膜衍生多功能肽。其氨基酸序列如下Thr－Met－Pro－Phe－Leu－Phe－Cys－Asn－Val－Asn－Asp－Val－Cys－Asn－Phe－Ala－Ser－Arg－Asn－Asp－Tyr－Ser－Tyr－Trp－Leu－Thr－Pro－Leu－Cys－Asp－Thr－Thr－His－Thr－Ser－Gly－Cys－Asn－Tyr－Tyr－Ser－Asn－Ser－Tyr－Ser－Phe－Trp－Leu－Ala－Ser－Leu－Asn－Pro－Glu－Arg。该肽的分子量6.38kDa等电点4.395。及该肽序列与GST、6×His Tag、β－半乳糖苷酸，trpE，硫氧还蛋白(Trx)等构成的融合蛋白作为抗肿瘤药物应用。
文档编号A61K38/16GK1594580SQ03159649
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月11日 优先权日2003年9月11日
发明者曹建国 申请人:曹建国