专利名称：编码cea和cd40配体的dna疫苗及其使用方法
技术领域：
本发明涉及脱氧核糖核酸(DNA)疫苗。特别是涉及含有编码癌胚抗原(CEA)和CD40配体的多核苷酸构建体的DNA疫苗。
背景技术：
通过服用非常有限的预防性制剂，疫苗已用于对多种疾病提供长期的保护，所述的制剂可刺激机体免疫系统在病原物增殖和引起病理反应之前而破坏病原物。用疫苗来预防疾病和使用疫苗的各种方法已有描述(Bernard R.Glick and Jack J.Pasternak，MolecularBiotechnology，Principles and Applications of Recombinant DNA，Second Edition，ASM Press pp.253-276，1998)。
接种疫苗是诱导机体自身的免疫系统在感染物引起病理反应之前发现并破坏该感染物。典型的疫苗是活的，减毒的感染物(病毒或细菌)或已杀死的感染物。包括活的细菌或病毒的疫苗必须是非病原性的。典型的细菌或病毒培养物是通过物理或化学方式处理而减毒的。虽然这些感染物是非毒性的，但用所述疫苗对患者进行处理后，它们仍能引发免疫应答。
抗原，如特异性的大分子或感染物可引发免疫应答。这些抗原通常是蛋白质、多糖、脂类或糖脂，它们作为“外源物”而被B淋巴细胞和T淋巴细胞所识别。将这两种类型的淋巴细胞与一种抗原接触，可迅速引发细胞间的识别反应，结果在接触部位形成多个淋巴细胞克隆。B淋巴细胞产生浆细胞，后者又产生成为抗体(Ab)的蛋白，它可选择性地与感染物中存在的抗原结合，从而中和或灭活病原物(体液免疫)。在有些情况下，B细胞应答需要CD4辅助T细胞的辅助。
针对抗原应答而形成的特异性的T细胞克隆是一种细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，它能够与病原物和存在抗原的组织结合而除去病原物或组织(细胞介导或细胞免疫)。在有些情况下，抗原呈递细胞(APC)，如树突状细胞将通过内吞作用包裹病原物或其他外源细胞，该APC然后就从这些细胞中拥有了抗原，并将这些抗原以组织相容性分子肽复合体的形式呈递给CTL上的T细胞受体(TCR)，从而刺激免疫应答。
以形成特异性抗体为特征的体液免疫通常对急性细菌侵染和病毒的反复侵染有效，而细胞介导的免疫主要对病毒性侵染、慢性细胞内细菌侵染和真菌侵染有效。细胞免疫也可抗癌和排斥器官移植。
针对抗原侵染而产生的抗体在很长时间内在血液中都可以检测到，因而提供了一种在病原侵入前进行检测的可能性。在同一种病原再次侵入时，免疫系统可通过在该病原增殖和产生病理反应之前除去病原物而抑制其再侵染。
有时，与病原物具有相同抗原的非病原物也可以和病原物一样引发同样的免疫应答。在这种情况下，患者在没有受到先前的侵染的情况下也可以抵抗该病原物的再侵染。
但是，并不是所有的感染物都象疫苗形成所需那样能够培养和灭活。目前，重组DNA技术使得克服上述局限而寻找新的疫苗成为可能。可以将感染物改造为缺失病原基因，这样，就可以将活的、非毒性形式的微生物作为疫苗。也可以将相对非病原性的微生物，如大肠杆菌设计为具有病原载体的细胞表面抗原的微生物。将这样的转基因载体施用给患者，患者的免疫系统就会形成针对这种病原物的抗体。将一种病原物的抗原性蛋白进行遗传改造，使其在非病原物中表达，分离和纯化出的抗原性蛋白可作为“亚单位疫苗”。亚单位疫苗具有稳定、安全、化学结构确定的特点，但其成本较高。
近年来出现了产生疫苗的新方法，广义地称为遗传免疫。该方法是将编码病原物抗原的基因导入到要免疫的患者的细胞中。被处理的细胞经改造，可产生病原物的抗原性蛋白。体内产生的抗原就可以在宿主内引发所需的免疫应答。在基因疫苗中使用的遗传物质可以是DNA或RNA构建体。通常，将编码抗原的多核苷酸与其它启动子核苷酸序列结合以增强基因的插入、复制或表达。
编码抗原基因的DNA疫苗可通过各种表达系统导入到患者的宿主细胞中。这些表达系统包括原核、哺乳动物和酵母表达系统。例如，一种方法是用病毒性载体，如导入了新的遗传物质的疫苗病毒来接种宿主细胞。另一种方法是将遗传物质导入到载体中或作为“裸”多核苷酸(如纯化的DNA)直接导入到宿主细胞中。此外，DNA可稳定地转染到减毒的细菌，如鼠伤寒沙门氏杆菌中。如果患者用转化的沙门氏杆菌口服免疫，则细菌就转移到肠道集合淋巴结处(如次级淋巴组织)，然后刺激免疫应答。
DNA疫苗提供了对非传统的病原物所引起的疾病的免疫，如遗传疾病和癌症。对于遗传癌症疫苗，必须分离出针对肿瘤细胞特异类型的抗原，然后将其导入到疫苗中。
获得肿瘤特异性免疫应答的主要障碍之一是要克服外周T细胞抗肿瘤自身抗原的耐受性并诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，其可以有效地根除扩散肿瘤的转移和从而保持长期抗肿瘤再生的免疫记忆。人癌胚抗原(CEA)是癌胚膜糖蛋白，其为开发用于免疫治疗的DNA疫苗提供了一种相关的肿瘤自身抗原靶。Clarke等报道了用于研究以CEA为基础的疫苗的动物模型(Cancer Res.1998，581469)。该模型包括建立携带人CEA的基因组DNA转基因的小鼠系并以与人相似的组织特异性方式表达CEA。随着体内CEA转染的成纤维细胞的引发，在转基因小鼠中引发了抗CEA的CD8+T细胞，其对CD4+T细胞部分的CEA具有耐受性(Mizobata et al.Cancer Immunol.Immuother，2000，49285)。Tsang等研究了在人体中的情况(J.Nat’l CancerInst.1995，87982)，表明对CEA特异性的CD8+CTL并不是负选择的，与在转基因小鼠中获得的结果相似。
CD40配体(CD40L)的生物学作用，特别是它在T细胞活化的共同刺激过程中与抗原呈递细胞上表达的CD40之间的相互作用是现有技术中已知的。CD40是一种48kDa的糖蛋白，其在所有成熟的B细胞、多数成熟的B细胞癌和一些早期急性B细胞淋巴细胞性白血病的细胞表面表达，但不在浆细胞上表达(Clark，Tissue Antigens，1990，3533-36)。CD40L是35kDa II型膜蛋白，是肿瘤坏死因子(TNF)基因家族的成员，其在抗原识别的T细胞表面表达。TNF家族的成员当作为同型三聚体表达时其生物学活性最高。CD40L也不例外，通过将33个氨基酸的亮氨酸拉链部分和该配体整个胞外区域的N-末端融合这样的改变使CD40作为同型三聚体来表达。Gurunathan等报道了CD40LT DNA(J.Immunol.1998，1614563)。用编码高免疫遗传性的抗原β-半乳糖的DNA接种小鼠时可增强细胞的免疫应答，如诱导IFN-γ和细胞毒性T细胞的活性。
CD40L在诱导有效地抗肿瘤自身抗原的保护性免疫的T细胞的活化中起关键作用。一旦树突状细胞(DC)识别了MHC I类抗原多肽复合体并提呈给天然T细胞，第一抗原信号就可通过T细胞受体(TCR)进行传递，然后上调CD40L。在T细胞表面，CD40L然后通过CD40-CD40L之间的相互作用在DC上诱导共同刺激的活性。这样，这些APC表达共同刺激的分子B7.1(CD80)和B7.2(CD86)，它们通过与CD28之间的相互作用将第二共同刺激信号传递给T细胞，这是T细胞全面活化以同时产生前炎性细胞因子IFN-γ和IL12所必需的，进而行使效应分子的功能。
增强DNA疫苗的有效性的方法是将编码DNA的质粒转化到非复制型的鼠伤寒沙门氏菌菌株中，然后将所述菌株制成口服疫苗。减毒的活细菌将DNA穿过胃肠道，然后穿过覆盖肠集合淋巴结处的M细胞，减毒的细菌从那里进入APC，如树突状细胞或巨噬细胞，在那里，它们由于突变，在吞噬细胞释放多拷贝的DNA而死亡。
减毒细菌被认为提供了一种“危险信号”，刺激了内在的免疫系统，产生了如IL12这样的前炎性细胞因子和介质，如一氧化氮，其增强了抗原提呈和提高了与根除肿瘤有关的TH1型细胞免疫应答。事实上，已报道减毒的鼠伤寒沙门氏菌是一种有效的自体口服DNA疫苗的载体，该疫苗可抗小鼠黑色素瘤(Xing et al.Proc.Nat Acad.Sci(USA)2000，975492)。已报道重组单核细胞增生杆菌疫苗可高效地介导对原发小鼠黑色素瘤的抑制和在肺中的转移(Pan et al.Cancer Res.1999，595254)。与多数其它的胞内细菌不同，单核细胞增生杆菌能产生很强的细胞免疫应答，原因在于它们通过破坏吞噬小体的膜而进入到细胞质中，因而允许分泌的任何蛋白靶向到感染细胞的MHC I和II类途径，进行抗原提呈。
Xiang等(Clin.Cancer Res.，2001，38586)报道了用CEA和KSA稳定转化的细胞对MC38小鼠结肠癌细胞的致死性攻击提供部分保护作用，其中KSA是人上皮细胞粘附分子。将CEA为基础的DNA疫苗经口服接种小鼠，其中所述的疫苗由鼠伤寒沙门氏菌所携带，该疫苗诱导MHC I类抗原特异性CD8+T细胞应答，结果抑制了皮下的肿瘤。但只在用CEA转化的部分实验小鼠中发生，特别是当一起给予重组抗体-IL2融合蛋白时，其中所述的重组抗体-IL2融合蛋白的作用是将IL2定位到肿瘤微环境中。
目前，急需能引发CD8+T细胞介导抗CEA自身抗原的抗肿瘤免疫应答的疫苗以提高抗结肠癌的效果。本发明即实现了该目的，提供了一种独一无二的，具有双重功能的编码CEA和CD40LT的DNA疫苗，该疫苗特别是当加入huKS1/4-IL2融合蛋白增强时，能激活DC和内在的T淋巴细胞。
发明概述本发明提供了一种能有效地抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞的疫苗。该疫苗包括编码CEA(DNA序列如SEQ ID NO1)的质粒DNA和编码CD40配体，如人CD40L的质粒DNA，其DNA序列见SEQ ID NO；2或其同型三聚体CD40LT。CEA和CD40L的DNA分别是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，它们可导入到相同的质粒或不同的质粒中。在一种疫苗中编码CEA和CD40配体的质粒DNA的组合可促进内在T细胞和抗原提呈细胞，如树突状细胞的活化，从而刺激两种不同的免疫应答系统。
本发明疫苗的质粒DNA能可操作地导入到有效的载体，如减毒细菌、非复制病毒或脂质体颗粒中。
本发明的方法一方面涉及将DNA疫苗以能有效引发抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞的免疫应答的量给予哺乳动物，如人，所述DNA疫苗包含编码CEA(SEQ ID NO1)的质粒DNA和编码CD40L(SEQ IDNO2)或其同型三聚体CD40LT的质粒DNA。
本发明另一方面涉及顺序地给予哺乳动物如人(a)一种DNA疫苗，其包括编码CEA(SEQ ID NO1)和CD40L(SEQ ID NO2)或其同型三聚体CD40LT的质粒DNA，所述疫苗的量足以有效地引发抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞，的免疫应答，和(b)一种重组抗体-IL2融合蛋白(huKS1/4-IL2)，其量足以有效地增强免疫应答。huKS1/4-IL2可增强用DNA疫苗治疗的哺乳动物的免疫应答，免疫系统可更有效地抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞。疫苗和融合蛋白可经口服或肠道外施用，优选疫苗经口服施用，融合蛋白经静脉施用。
本发明的疫苗通过引发抗CEA提呈细胞，包括结肠癌细胞的免疫应答可用于预防性的治疗癌症，如结肠癌。
附图简述附
图1显示对裂解的含有质粒CEA和质粒CD40LT的转化Cos-7细胞的Western blot分析，结果证明该细胞中具有CEA和CD40LT DNA；附图2显示用本发明的pCEA-CD40LT DNA接种的小鼠中肿瘤的生长受到抑制；附图3显示来自用本发明的DNA疫苗接种的小鼠的脾细胞杀死MC-38-CEA-KSA肿瘤细胞的能力；附图4显示用本发明的pCEA-CD40LT DNA疫苗接种的小鼠中T细胞活化分子的表达上调，当接种的小鼠进一步用huKS1/4-IL2融合蛋白治疗时，这种上调得到增强；附图5显示用本发明的pCEA-CD40LT DNA疫苗接种的小鼠当进一步用huKS1/4-IL2融合蛋白增强处理时，增强了共同刺激分子的表达；附图6显示用本发明的pCEA-CD40LT DNA疫苗接种的小鼠中诱导了前炎性细胞因子，当接种的小鼠进一步用huKS1/4-IL2融合蛋白增强处理时，这种诱导得到增强；附图7显示编码人CEA的基因的DNA序列，SEQ ID NO1；附图8显示编码人CD40配体的DNA序列，SEQ ID NO2；附图9显示编码小鼠CD40配体的DNA序列，SEQ ID ON3。
发明优选实施方案详述本发明提供了一种能有效地抗CEA提呈细胞，如某些癌细胞的DNA疫苗，所述疫苗包括编码CEA(SEQ ID NO1)的质粒DNA构建体和编码CD40配体(SEQ ID NO2)或其同型三聚体CD40LT的质粒DNA。CEA和CD40L的DNA分别是SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，它们可导入到相同的质粒或不同的质粒中。DNA质粒可导入到载体，如减毒细菌、非复制病毒或脂质体颗粒中。该DNA疫苗也可包括“裸”DNA。
本发明的DNA疫苗能刺激抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞的CTL的形成。由于CEA是结肠癌细胞的特异性标记，因此针对疫苗应答而产生的CTL基本上只对结肠癌组织有效。CD40配体能刺激树突状细胞，而树突状细胞是辅助产生细胞免疫应答的最有效的APC。包含DNA结合体的疫苗可直接或间接地通过树突状细胞间的相互作用提高内在T细胞的活化，其中所述DNA编码CEA和CD40配体，其DNA序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。这样的组合疫苗可同时刺激两种不同的免疫应答，因而提高治疗效果。
本发明中的术语“DNA”是指单数或复数形式的脱氧核糖核苷酸。术语“免疫”在这里是指抗毒性感染物的长期免疫保护。术语“免疫接种”是指预防性地接触非毒性的病原物抗原，从而使被治疗的患者产生对该病原物的免疫性。
本发明在疫苗中使用的DNA优选包括编码CEA(SEQ ID NO1)和/或CD40配体(SEQ ID NO2)的核苷酸序列，该序列可操作地与用于基因表达的调控元件相连。优选CD40配体是CD40LT。在疫苗中CEA和CD40配体DNA优选导入到同一个质粒中，在本发明中为pCEA-CD40LT(即质粒CEA-CD40LT)，其中CEA和CD40配体DNA序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。另一方面，疫苗也可以包含编码CEA(SEQ ID NO1)的质粒和另一个编码CD40L(SEQ ID NO2)的质粒DNA。
当导入到细胞中，DNA分子在细胞中可作为功能性的染色体外分子和/或整合到细胞染色体DNA中。DNA可以质粒形式导入到细胞中，其作为独立的遗传物质。另一方面，可整合到染色体中的线性DNA也可导入到细胞中。将DNA导入细胞时，可加入促进DNA向染色体中整合的试剂，而这是现有技术中已知的技术。疫苗中也可以包含能促进整合的DNA序列。在减毒活微生物或重组微生物载体型的疫苗中，编码CEA和CD40配体的DNA(其DNA序列分别为SEQ ID NO1和SEQ IDNO2)可保留部分遗传物质，其中所述的微生物可以在患者体内存活。
优选使用的DNA疫苗包括核酸表达所必须的调控元件。这些调控元件包括启动子、起始密码子、终止密码子和多聚腺苷酸信号。此外，编码免疫原性靶蛋白的序列的表达通常还要求有增强子存在。如现有技术中所述，这些调控元件可操作地与编码目的蛋白的序列相连接。调控元件优选地选自那些在其被施用的物种中是可操作的。
起始密码子和终止密码子优选是本发明的编码CEA和CD40配体蛋白的基因疫苗中的核苷酸序列的一部分。起始密码子和终止密码子必须与编码序列读码框一致。
本发明的疫苗中所包括的启动子和多聚腺苷酸信号优选在被免疫的患者细胞中是有功能的。
本发明的疫苗中所使用的启动子，特别是在生产用于人的基因疫苗时，包括但并不局限于猿病毒40(SV40)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人免疫缺陷病毒(如HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、莫洛尼氏病毒启动子、巨细胞病毒(CMV)，如CMV立即早期启动子、爱泼斯坦巴尔病毒(EBV)病毒启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子和来自人基因的启动子，如人肌动蛋白、人肌浆球蛋白、人血色素、人肌酸和人metalothionein。其它有用的启动子包括组织特异性启动子，如控制肿瘤内皮的启动子和肿瘤选择性启动子，如CEA启动子，以及治疗应答性启动子，如早期生长应答启动子。
本发明的疫苗中所使用的多聚腺苷酸信号，特别是在生产用于人的基因疫苗时，包括但并不局限于SV40多聚腺苷酸信号和LTR多聚腺苷酸信号。
除了DNA表达所需的调控元件外，还包括DNA分子中的其它序列，如增强子。增强子包括上面描述的启动子。优选的增强子/启动子例如包括人肌动蛋白、人肌浆球蛋白、人血色素、人肌酸和病毒增强子，如来自CMV、RSV和EBV病毒的增强子。
如果出于任何原因想要破坏接收基因构建体的细胞，则可在疫苗中加入其它元件用作靶标来破坏细胞。如可在疫苗中加入可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因。将药物更昔洛韦(gancyclovir)给予接受免疫的患者，则可以选择性地杀死产生tk的任何细胞。在Weiner等的美国专利No.5,817,637中描述了引入遗传物质来选择性地破坏细胞的方法。
调控元件和密码子通常是与种属相关的，为了最大量地生产蛋白，调控元件和密码子优选在被免疫的种属中是有效的。制备出在目的种属中有功能的DNA构建体是本领域技术人员的常规技术。
本发明的疫苗中的DNA构建体可以是“裸”DNA(参见Restifo etal.Gene Therapy 7，89-92，2000及其引用文献)。另一方面，DNA也可以整合到载体或转化载体中。可使用的传递载体包括生物能分解的微胶囊、免疫刺激复合体(ISCOMs)或脂质体、和经遗传改造的减毒的活载体，如病毒或细菌。
适宜的减毒的活细菌载体/转化载体包括鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、单核细胞增生杆菌、志贺氏菌、芽孢杆菌、乳杆菌、卡介苗、大肠杆菌、霍乱弧菌、弯曲菌或本领域已知的任何细菌载体。优选的细菌传递载体包括减毒的鼠伤寒沙门氏菌和减毒的单核细胞增生杆菌，最优选是减毒的鼠伤寒沙门氏菌。用外源DNA构建体转化活细菌载体的方法是现有技术中已知的(Joseph Sambrook and David W.Russell，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，3rd Ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，2001)。
优选的减毒病毒载体包括疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。用外源DNA构建体转化病毒载体的方法是现有技术中已知的(见上述Sambrook and Russell)。
脂质体载体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性的物质所形成的膜部分和内部的水相部分。在本发明中，脂质体的水相部分包含有要转移到靶细胞中的多核苷酸。通常，优选脂质体形成物质具有一个阳离子基团，如四元铵基团，和一个或多个亲脂性基团，如饱和的或非饱和的，具有大约6-30个碳原子的烷基。公开号为No.0187702的欧洲专利描述了这样的物质，美国专利No.6,228,844及其相关的引用文献进行了进一步的讨论。文献中还描述了许多其它的脂质体形成阳离子脂质化合物(见L.Stamatatos，et al.，Biochemistry273917-3925，1988；H.Eibl，et al.，Biophysical Chemistry10261-271，1979)。另一方面，也使用了微球体，如聚交酯-coglycolide生物可分解微球体。为将核酸转移到组织中而进行的核酸包装或与脂质体或微球体的复合是本领域技术人员所熟知的技术。
本发明的疫苗也可以与促进剂联合施用，所述的促进剂提高治疗细胞对疫苗中遗传物质的吸收。优选DNA与选自下组的促进剂配伍或联合施用，包括苯甲酸酯、苯胺、脒、urethans和那些可作为局部麻药的盐酸盐，如Williams等的美国专利No.6,248,565中所公开的内容，这些内容在这里作为参考文献而引用。
本发明方法的一方面，DNA疫苗可以在接种疫苗的患者体内长期提供抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞的保护作用。在方法的一个优选实施方案中，将包含可操作地编码CEA和CD40配体(其DNA序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)的质粒DNA(即pCEA-CD40LT)的DNA疫苗给予需要抗CEA提呈细胞保护的哺乳动物，所述疫苗的量足以引发抗CEA提呈细胞的免疫应答。
本发明的另一优选的方法涉及用本发明的pCEA-CD40LT疫苗接种哺乳动物抑制了肿瘤的生长。在方法的一个优选实施方案中，将包含可操作地编码CEA和CD40配体(其DNA序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2)的质粒DNA构建体的疫苗给予患有包含CEA提呈细胞的生长肿瘤的哺乳动物，所述疫苗的量足以引发有效的免疫应答。接种后，通过免疫哺乳动物抗肿瘤细胞而导致肿瘤的生长被抑制，减少了新的肿瘤的形成。
本发明另一方面涉及顺序地给予哺乳动物(a)一种DNA疫苗，包括编码CEA的质粒DNA和编码CD40配体的质粒DNA，其DNA序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，所述疫苗的量能有效地引发抗CEA提呈细胞，如结肠癌细胞的免疫应答，和(b)一种重组人源化KS-1/4抗体-IL2融合蛋白(huKS-1/4-IL2)，其量能有效地增强免疫应答。Gillies等(J.Immunol.，1998，1606195-6203)详细地描述了HuKS-1/4-IL2，相关的公开内容在这里作为参考而引用。
IL2是激活的T细胞产生的一种复合的细胞因子，它可以刺激B细胞和T细胞的生长。T细胞中IL2的激活也可以刺激在T细胞表面产生CD40配体(Chapter 7 of Charles A.Janeway，Jr.and PaulTravers，Immmunobiology The Immune System in Health andDisease，Second Edition，Garland Publishing Co.，New York，1996)。通过huKS-1/4-IL2融合蛋白定位到肿瘤微环境中的IL2的作用是提高抗肿瘤的T细胞应答，这种作用是通过CTL的活化过程中的第二共同刺激信号或通过进一步激活活化前DC表达IL2受体来实现的。huKS-1/4-IL2融合蛋白可以增强用DNA疫苗治疗的哺乳动物中的免疫应答，使得免疫系统更有效地抗CEA提呈细胞，从而增强了疫苗的效果。
另一方面，本发明的疫苗优选经肠道施用，如口服施用，或经非肠道施用，如静脉注射。优选疫苗经肌肉、鼻内、腹膜内、皮下、皮内、局部或口服施用。更优选将疫苗导入到减毒的细菌传递载体中，经口服施用。优选，疫苗和药学上可接受的载体一起提供，药学上可接受的载体包括生理盐溶液、葡萄糖溶液等，如本领域所公知。
患有上皮癌，如结肠癌、胰腺癌、肺癌和乳腺癌的患者可用本发明的疫苗免疫而受益。
本发明的疫苗优选与药学上可接受的载体或赋形剂，如水、盐、葡萄糖、甘油、乙醇等及其组合配伍。该疫苗也可以含有助剂，如保湿剂、乳化剂、缓冲液等。
本发明的疫苗优选以药学上可接受载体中的溶液或悬浊液形式、经口服给予哺乳动物，如人，其中DNA的浓度为约10-100微克/毫升。疫苗的使用剂量因患者不同而不同，也因患者免疫系统能表达疫苗中含有的核酸的能力而异。适宜的使用剂量也可部分地根据医务人员的判断或疫苗的服用要求而定。
本发明的另一方面涉及包含本发明疫苗的试剂盒，其中所述疫苗包装在适宜的无菌容器，包括安瓿、瓶或小瓶中，其剂量为多剂量或单位剂量。装入疫苗的容器最好密封。优选，将疫苗包装在附有标签的容器中，标签标注上疫苗的鉴定信息、附有政府部门，如美国食品和药品管理局所出具的注意事项，表明该疫苗得到了相关法律的许可、及剂量信息等。标签上还应注明该疫苗是用于治疗疾病，需经专业人员施用给患者。该试剂盒还应包含有关疫苗的服用、用法说明、适应症及必须的警告等信息。
本发明的试剂盒也可含有重组抗体融合蛋白huKS-1/4-IL2，所述的huKS-1/4-IL2包装在适宜的无菌容器，包括安瓿、瓶或小瓶中，其剂量为多剂量或单位剂量。优选，将融合蛋白包装在附有标签的容器中，标签标注上疫苗的鉴定信息、附有政府部门，如美国食品和药品管理局所出具的注意事项，表明该融合蛋白得到了相关法律的许可、及剂量信息等。标签上还应注明该融合蛋白是用于治疗疾病，需经专业人员施用给患者。该试剂盒还应包含有关融合蛋白的服用、用法说明、适应症及必须的警告等信息。
本发明编码CD40配体的质粒DNA优选编码CD40配体三聚体(CD40LT)。优选编码CEA和CD40LT的质粒DNA整合到减毒细菌传递载体中。优选减毒的细菌传递载体是减毒鼠伤寒沙门氏菌和减毒的单核细胞增生杆菌，最优选是减毒的鼠伤寒沙门氏菌。本发明的疫苗包含编码CD40LT的核酸和编码CEA的DNA组合，这种组合的疫苗可同时刺激两种不同的免疫系统(即细胞免疫和体液免疫)。
癌胚抗原家族的一些成员的核酸序列是现有技术中已知的。Schrewe等公开了编码人CEA基因的核苷酸序列(EMBL database ofthe Eruopean Bioinformatics Institute，Wellcome Trust GenomeCampus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK(EMBL accession numberis EMBLHSCEA01))，上述公开内容在这里作为参考而引用(图7，SEQ ID NO1)。
人CD40配体(CD40L)是一种154个氨基酸的蛋白，其在体液免疫的调控中起核心作用。Grammar等报道了编码人CD40L(也可称为CD154)的DNA序列(EMBL database of the Eruopean BioinformaticsInstitute，Wellcome Trust Genome Campus，Hinxton，CambridgeCB10 1SD，UK(EMBL accession number is EMBLHACD40L))，上述公开内容在这里作为参考而引用(图8，SEQ ID NO2)。Marra等报道了编码小鼠CD40L的DNA序列(EMBL database of theEruopean Bioinformatics Institute，Wellcome Trust GenomeCampus，Hinxton，Cambridge CB10 1SD，UK(EMBL accession numberis EMBLAI385482))，上述公开内容在这里作为参考而引用(图9，SEQ ID NO3)。
由于遗传密码的简并性，其它编码与CEA和/或CD40L配体基本上相同或功能相同的氨基酸序列的DNA序列也可用于本发明。其中包括那些能与CEA和/或CD40L配体序列杂交的DNA序列。
根据本发明，所述的DNA序列还包括其不同核苷酸残基的缺失、取代或替换而形成的序列，该序列编码的基因产物与其具有相同功能或是其功能等价物。基因产物本身也可能含有在CEA和/或CD40配体序列内发生的氨基酸残基的缺失、取代或替换，但这种变化是“沉默的”，因而其产物是CEA和/或CD40配体蛋白的功能等价物。这些氨基酸残基的替换是根据残基之间具有相同的极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两性来确定的。如，带有负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带有正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；不带电荷的极性氨基酸具有相似的疏水性，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸。
CD40配体“功能等价物”在这里是指与CD40或其片段结合的配体，它们不必与其对应的天然CD40配体具有相同的结合亲合力。同样，CEA功能等价物在这里是指与抗人CEA的抗血清相结合的蛋白质，它们不必与其对应的天然人CEA具有相同的结合亲合力。
本发明中的癌胚抗原(CEA)包括在人体中发现的天然抗原和其相应的功能等价物；而“CD40配体”包括在哺乳动物中发现的天然配体的单聚体、二聚体和三聚体及其相应的功能等价物。优选，CEA和/或CD40配体DNA的功能等价物与前面提到的编码CEA和/或CD40配体的DNA具有至少80％的同源性。
出于各种目的，可对本发明的DNA序列进行工程比，改变CEA和/或CD40配体的编码序列，包括但不限于改变基因产物的加工和表达。例如，可采用本领域常规的突变技术，如点突变来插入新的限制性位点等。
下面的实施例用于说明本发明的目的，而无任何限制意义。
材料和方法试剂T-STIM培养基补充物来自BD Biosciences，Bedford，MA。异硫氰酸荧光素(FITC)和R-藻红蛋白(R-Phycoerythrin，PE)来自BD Pharmingen，LaJolla CA.。FITC标记的抗体和PE标记的抗体根据厂家的说明来制备。所有的抗体均获自BD Biosciences，Bedford，MA。HuKS-1/4-IL2根据Gillies的描述来制备(J.Immunol.，1998，1606195-6203)，相关的公开内容在这里作为参考而引用。
CEA转基因小鼠用包含完整人CEA基因组区(SEQ ID NO1)的32.6Kb的AtaII片段和分离自基因组粘粒克隆的侧翼序列转化得到C57/B1/6J CEA转基因小鼠。根据Clarke等的方法建立小鼠细胞系[C57/BL/6J-TgN(CEA Ge)18FJP](Cancer Res.1998，581469)，相关的公开内容在这里作为参考而引用。在Scripps Research Institute饲养场饲养CEA转基因小鼠。使用的小鼠是6-8周龄。所有的动物实验均根据国立卫生研究院制定的实验动物饲养和使用指南来进行。
肿瘤细胞系和细菌菌株用CEA(C15-4.3克隆)上皮细胞粘连分子Ep-CAM/KSA(Gilles et al.J.Immunol.，1998，1606195)稳定转染化学诱导的小鼠结肠腺癌细胞系MC38。减毒的鼠伤寒沙门氏菌AroA-Strain SL7207由B.A.D.Stocker博士(Stanford University，Stanford，CA)友情馈赠。化学感受态的大肠杆菌购自Invitrogen(Carlsbad，CA)，在LB培养液或琼脂平板(VWR)上37℃下常规培养，需要时，如本领域已知，加入75μg/ml的氨苄青霉素。
表达质粒的构建为将CD40LT和CEA分子分别定位到DC或T细胞中，构建了几种不同类型的质粒表达载体。用pcDNA3.1/zeo(+)(Invitrogen)构建了用于免疫的质粒。Xiang等公开了用于导入到内质网(ER)上的pER-CEA对照质粒和导入到细胞表面的pW-CEA质粒(Clin.Cancer Res.，2001，38565)，相关的公开内容在这里作为参考而引用。编码CD40LT基因的质粒(pCD40LT)包含一段改进的33个氨基酸的亮氨酸拉链基序以有利于形成三聚体CD40L，该三聚体CD40L与IL7引导序列的C-末端融合以引导蛋白在细胞表面表达或诱导蛋白向细胞外分泌(Fanslow et al.Semin.Immunol.，1994，6267)，相关的公开内容在这里作为参考而引用。导入一段可用特定单克隆抗体检测的短抗原序列，Flag，可有助于通过Western blot检测CD40LT。pCEA-CD40LT质粒包含与小鼠CD40L的C-末端融合的完整的CEA胞外区，因而可产生双重功能的嵌合构建体。
口服免疫，肿瘤细胞攻击和抗体IL2融合蛋白的增强将CEA转基因的C57/BL/6J小鼠分成7个实验组(n＝8)。用每100μl PBS中含1×108个转化的、减毒的鼠伤寒沙门氏菌经口服免疫小鼠，两周间隔免疫三次，其中所述的鼠伤寒沙门氏菌含有空载体(pcDNA3.1)、单个表达载体pER-CEA(对照疫苗)、pW-CEA(对照疫苗)、pCD40LT(对照疫苗)、pCEA-CD40LT(本发明疫苗)或随后用huKS1/4-IL2增强的本发明的疫苗。其它的对照实验包括口服PBS、不用DNA疫苗免疫的重组抗体融合蛋白huKS1/4-IL2增强和只用照射过的MC38细胞接种的一组小鼠。最后一次免疫2周后，在所有小鼠的右侧腹部用2.5×105个致死剂量的MC38-CEA-KSA细胞皮下进行攻击。在肿瘤明显之前每天检察小鼠，之后每隔一天用微测径器按照两维测量肿瘤的大小。
Gillies等描述了huKS1/4-IL2融合蛋白的构建(J.Immunol.，1998，1606195-6203)，相关的公开内容在这里作为参考而引用。如上所述用转化的、减毒的鼠伤寒沙门氏菌经口服免疫CEA转基因的C57BL/6J小鼠，从肿瘤攻击后1天开始给予上述转基因小鼠5μghuKS1/4-IL2融合蛋白增强，连续给5天。
细胞毒性分析根据Xiang等(Cancer Res.，1997，574948)的方法用标准的51Cr释放分析来检测细胞毒性，相关的公开内容在这里作为参考而引用。肿瘤攻击后1周，从CEA转基因小鼠中分离的脾细胞在37℃下，在完全T-STIM培养基(Beckton Dickinson，Bedford，MA)中培养3天。用0.5mCi的51Cr标记的MC38-CEA-KSA靶细胞(3×106)在37℃下，在各种效应分子∶靶细胞(E∶T)比例下与效应分子细胞一起培养4小时。
转染及蛋白表达的免疫印迹分析根据厂家的说明(Invitrogen)用脂转染胺试剂(Lipofectamine)瞬时转染COS-7细胞，以每个孔中2.5×105个细胞的量在6孔培养皿中培养COS-7细胞，24小时后，在无血清的培养基中加入1μgDNA和5μl脂转染胺试剂。用等量的蛋白(15μl/泳道)进行免疫印迹，在还原和非还原条件下用SDS-PAGE进行分离，其中包括对照裂解物，并如以前描述的那样(Xiang，et al.CancerRes.，1997，574948)将其电印迹到硝酸纤维素膜上。用小鼠抗人CEAmAb(ICN，Aurora，OH)或抗-FLAG M2 mAb(Sigma，St.Louis，MO)染色后加入抗-小鼠IgG-HRP，用ECL Western blot检测试剂(AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)和XOMAT-5膜(Eastman KodakCompany，Rochester，NY)对印迹进行显影。
流式细胞仪分析通过用Becton Dickinson FACScan进行双色流式细胞仪分析来确定T细胞的活化标记和CDIIc及MHCII类抗原阳性的DC上共刺激分子的表达。对新分离自成功免疫接种小鼠的脾细胞进行染色来确定T细胞的活化，其中所述的染色是用抗-CD8FITC(53-6.7)与PE-偶联的抗-CD25(H129.19)、LFA-1(2D7)、CD28(37.51)和CD69(H1.2F3)的组合。然后加入用FITC-标记的抗-CD11c(HL-3)，与PE-偶联的抗-B7.1(16-10A1)，B7.2(GL1)或ICAM-1，和生物素化的抗-IAb(KH74)抗体的组合，进而通过链霉亲和素别藻蓝蛋白来测量共同刺激分子在APC上的活化。所有的细胞流式试验是在存在0.1μg/ml碘化丙锭以去除死亡细胞的情况下进行的。所有的试剂均获自BDPharmingen(LaJolla，CA)。
细胞因子诱导分析用2.5×105个致死剂量的MC38-CEA-KSA细胞皮下进行攻击后1周，从所有的实验组小鼠中收获脾细胞。在Ficoll-Hypaque(BioWhittaker，Walkersville，MD)上分离淋巴细胞，并在含有1×105个照射的(15,000rad)MC38-CEA-KSA细胞的完全T细胞培养基上培养24小时。收集上清液，使用前在-70℃下保藏。用固相夹心ELISA(R&D Systems，Minneapolis，MN)采用市售的细胞因子检测试剂盒检测细胞因子IFN-γ或IL12。
实施例1 CEA和CD40LT的蛋白表达通过转染COS-7细胞对质粒pCD40LT，pCEA-CD40LT和pW-CEA的蛋白表达进行分析。Western blot分析表明，所有的构建体均产生期望分子量大小(分别为35kDa，215kDa和180kDa)的蛋白，正如在还原条件下对来自转染细胞的裂解物的SDS/PAGE分析所显示的结果一样(图1A和1B)。编码pCD40LT的质粒在细胞裂解物中表达的蛋白质在非还原条件下呈现单聚体、二聚体和三聚体型的CD40L(图1B)。在还原条件下，在转染细胞的上清液也检测到了CD40L蛋白(图1A)。
实施例2 编码CD40LT和CEA分子的双功能疫苗诱导肿瘤保护性免疫包括几个对照的多个实验表明双重DNA疫苗(pCEA-CD40LT)将CD40LT和CEA分别定位到DC和T细胞上，其结果如图2所示。图2中的实线表示每只小鼠中的肿瘤生长。对转CEA基因C57B1/6J小鼠在皮下注射2.5×105个照射(15,000rad)的MC38小鼠结肠癌细胞后的0和7天进行免疫接种。两周后，用致死剂量的MC38-CEA-KSA细胞皮下攻击这些对照，在所有小鼠中肿瘤发展迅速的结果表明，MC38-CEA-KSA细胞本身不具有免疫原性(图2A)。其它3个关键的对照实验也证实了这一点，即用带有空载体、特有地定位到ER的pER-CEA质粒或pCD40LT构建体的减毒鼠伤寒沙门氏菌以剂量1×108个口服免疫接种小鼠(n＝6)，两周间隔，免疫3次，所有的实验均未能引发抗致死性皮下肿瘤细胞攻击的保护性免疫应答，而均呈现快速和均匀的肿瘤生长(图2B、2C和2D)。相反，用同样的接种程序，但用含有pW-CEA载体的DNA疫苗接种的一组小鼠中，肿瘤的体积明显减小，8只小鼠中有3只完全未受到肿瘤细胞的攻击(图2F)。在用本发明的pCEA-CD40LT疫苗接种的小鼠中，8只中有4只完全未受到肿瘤细胞的攻击，其它的小鼠与对照相比，也表现出肿瘤生长的明显抑制(P＜0.001)(图2G)。
实施例3 通过增强和抗体-IL2融合蛋白，接种效果得到扩大。
用少量非治疗量的huKS1/4-IL2融合蛋白应用到肿瘤微环境中，明显地提高了本发明DNA疫苗的效果。事实上，用与上面描述的pCEA-CD40LT疫苗组相同的程序接种CEA-转基因小鼠，然后在肿瘤细胞连续攻击1天后静脉注射5μg huKS1/4-IL2，持续5天，结果表明，8/8只实验动物均未受到肿瘤细胞的攻击(图2H)。一个重要的对照实验表明，在对天然小鼠进行肿瘤攻击之前不用本发明的DNA疫苗进行免疫接种，注射5×5μg的huKS1/4-IL2融合蛋白本身对肿瘤的生长基本上无影响(图2E)。IL2融合蛋白的增强作用是特异性的，因为在M38结肠癌细胞中不表达的抗神经节苷脂GD2的非特异性的融合蛋白hu14.18-IL2的增强作用是无效的。
实施例4 本发明的pCEA-CD40LT双功能疫苗提高抗原特异性CTL应答本发明的pCEA-CD40LT疫苗在有或没有huKS1/4-IL2融合蛋白增强时均能诱导很强的细胞毒性CD8+T细胞启动，如用每种质粒免疫CEA-转基因小鼠的结果一样(图3)。在图3中，(□)表示未处理的带有肿瘤的小鼠；(◇)表示只用融合蛋白处理的小鼠；(○)表示用质粒pER-CEA免疫的小鼠；(△)表示用pCEA-CD40LT免疫的小鼠；( )表示用pW-CEA免疫的小鼠；(◆)表示用pCEA-CD40LT免疫的小鼠；()表示用pCEA-CD40LT和huKS1/4-IL2免疫的小鼠。用pCEA-CD40LT疫苗接种，用抗体-IL2融合蛋白增强的小鼠中的CTL是最有效的，与来自用同样的疫苗免疫而不用融合蛋白增强的小鼠的CTL细胞相比，其细胞溶解由45％上升到70％(图3A)。相反，来自对照动物的脾细胞只呈现出不显眼的细胞溶解。肿瘤细胞的溶解是特异性的，因为用缺乏CEA表达的非特异性的B16黑色素瘤细胞作为靶细胞时完全没有出现细胞溶解。图3B的结果清晰地表明，由来自免疫的小鼠的脾细胞所引发的抗MC38-CEA-KSA肿瘤细胞的细胞溶解性应答是MHC I类抗原限制的，因为在有50μg/ml抗H2-Kb/H2-Db的抗体的情况下，MHC I类抗原能完全抑制细胞毒性。由于存在非特异性抗-H-2Kb和H-2Db抗体时并不抑制细胞溶解，因而这种抑制作用是特异性的。
实施例5 抗体-IL2融合蛋白增强本发明的双功能DNA疫苗上调CTL活性标记的作用在激活的T辅助细胞上的CD40LT与DC上的CD40之间的相互作用对于获得抗原特异性的T细胞应答是非常关键的。双功能DNA疫苗增强T细胞依赖性免疫应答的能力与提高T细胞活化标记的表达之间具有相关性。这一点通过以下分子表达的提高可以看出CD25，高亲和性IL2受体α链、CD69，早期T细胞活化抗原、淋巴细胞功能相关抗原，LFA-1，其对T细胞和DC之间通过胞间细胞粘连分子ICAM-1的相互作用的引发是很重要的(图4)。关键的是，这些上调的T细胞活化标记也包括CD28，它属于在T细胞上表达的Ig超家族中的成员，CD28是DC上的共刺激的B7.1和B7.2分子的受体。CD28与DC的连接又反过来刺激天然T细胞的生长(图4)。另人吃惊的是，肿瘤细胞攻击24小时后用huKS1/4-IL2融合蛋白增强进一步使这些标记的表达提高了20％-35％。
实施例6 用pCEA-CD40LT疫苗免疫接种，用抗体IL2融合蛋白增强提高了共同刺激分子的表达T细胞活化依赖于DC上的共同刺激分子B7.1和B7.2的表达提高，以达到与T细胞上表达的CD28之间的最适结合。与T细胞整合蛋白LFA-1结合的ICAM-1的上调也是同样重要的。来自CEA-转基因小鼠的脾细胞的流式细胞仪分析清楚地表明这种上调是非常有效的，因为与对照相比，B7.1、B7.2和ICAM-1的表达上调了1到2倍(图5)，其中所述的小鼠用本发明的DNA疫苗免疫后，用抗体-IL2融合蛋白进行增强。用抗体-IL2融合蛋白增强使得共同刺激分子和粘连分子的表达提高了20％-40％(图5)。这些结果表明，用pCEA-CD40LT接种诱导和增强了共同刺激分子在CD11c+和MHC II类抗原-阳性DC上的表达，显示这些APC对肿瘤特异性抗原的加工和提呈的能力明显地得到了提高。
实施例7 用pCEA-CD40LT接种提高了细胞因子的产生，后者进一步得到抗体-IL-2融合蛋白的增强。
在有经照射的(15,000rad)MC38-CEA-KSA肿瘤细胞存在的情况下，将脾细胞培养24小时，然后通过固相夹心ELISA检测各种脾细胞制备物培养上清中的前炎性细胞因子IFN-γ和IL2，结果表明pCEA-CD40LT疫苗提高了前炎性细胞因子IFN-γ和IL2从T细胞的释放。而来自用MC38-CEA-KSA细胞攻击后经PBS处理的转CEA基因小鼠的脾细胞上清液中只检测到少量的IFN-γ和IL12。但如果用pCEA-CD40LT疫苗接种，则IFN-γ和IL12的产生分别比用pCD40LT或pW-CEA单独接种的小鼠中所检测到的量提高了75％和50％(图6)。用huKS1/4-IL2融合蛋白增强后，IFN-γ的产生进一步提高了25％，而IL12的量与对照相比提高了3倍，与接种后不用huKS1/4-IL2融合蛋白增强时的量提高了100％(图6)。这些结果表明，用本发明的疫苗免疫，同时用抗体-IL2融合蛋白增强明显提高了次级淋巴组织中的T细胞活化。
讨论产生人肿瘤自身抗原CEA的转CEA基因小鼠是研究和评估人抗肿瘤治疗剂的非常有用的模型生物。在转CEA基因小鼠中，口服本发明的双功能DNA疫苗显著地破坏了辅助T细胞对CEA的耐受性。在一项预防性的试验中，在100％试验小鼠中发生了对小鼠结肠癌细胞致死性攻击的CD8+T细胞介导的排斥。在以前的报道中，用CEA为基础的DNA疫苗在转CEA基因小鼠中获得的肿瘤保护性免疫从没有在所有的试验动物中完全有效。而用本发明的疫苗治疗的转CEA基因小鼠成功地获得了肿瘤保护性免疫，特别是与重组抗体融合蛋白huKS1/4-IL2结合使用时。
本发明的疫苗上调了几种受体/配体对的表达，已知这些受体/配体对可通过与DC的相互作用有效地活化T细胞，其中DC可以MHC多肽复合体提呈受体/配体对。本发明的疫苗上调了CD40/CD40LT、LFA-1/ICAM-1、CD28/B7.1和B7.2及CD25/IL2，提高了前炎性细胞因子IFN-γ和IL12的分泌。T细胞整合蛋白LFA-1和ICAM-1的表达的上调明显地活化了T细胞和CD11c+树突状细胞，已知T细胞整合蛋白LFA-1和ICAM-1在淋巴细胞与APC的结合中起增效作用。
天然(naive)T细胞与APC的瞬时结合为这些细胞从每一个APC表面的大量MHC分子中选择特异多肽提供了时间。通过这种方式，天然T细胞提高了识别其特定MHC多肽配体的机会，然后信号通过TCR，诱导LFA-1的构象变化。后者反过来显著地增强了LFA-1对ICAM-1的亲和力，稳定了抗原特异性T细胞和APC之间的结合。
用本发明的疫苗接种，肿瘤细胞进行攻击后，CD28在T细胞上的表达和共同刺激分子B7.1和B7.2在DC上的表达明显提高，这是因为它提供了天然T细胞活化所需的两个信号。一个信号显示MHC多肽复合物与TCR结合后，抗原识别被传递到T细胞上，而另一个信号，即CD28与B7.1和B7.2相连，启动了T细胞的应答和装配效应分子T细胞的产生。CD25、高亲和力IL2受体α链和CD69及早期T细胞活化抗原的表达的显著提高清楚地表明了次级淋巴组织中T细胞的活化。
由本发明的双功能DNA疫苗诱导的前炎性细胞因子IFN-γ和IL12的显著提高表明第三种信号可能直接作用在T细胞上。据报道，这种“危险信号”是TH1分化所必需的，导致T细胞的克隆扩大。事实上，只要需要T细胞辅助产生抗肿瘤自身抗原，如CEA的有效的CD8+T细胞应答，则必须在DC与抗原特异性CD8+T细胞相遇之前，激活DC。这种作用是由APC表面的CD40与在激活的CD4+T细胞上表达的CD40L之间的连接来介导的。
由本发明的DNA疫苗所表达的CD40LT可作为激活的CD4+T细胞的代用品，可导致DC的成熟，正如其对B7.1和B7.2共同刺激分子的上调所显示的结果一样。口服本发明的双功能DNA疫苗可诱导抗人CEA肿瘤自身抗原的高效的肿瘤保护性免疫，其中所述的DNA疫苗包含编码CEA和CD40配体的基因。
在不偏离本发明范围的情况下，根据上面所描述的优选实施例进行多种变化和改变是显而易见的。应当理解，本发明的范围并不限于上述的优选实施例，当然，所有这样的变化和改变都在本发明权利要求书保护的范围内。
序列表<110>The Scripps Research InstituteRong XiangRalph A.Reisfeld<120>编码CEA和CD40配体的DNA疫苗及其使用方法<130>TSRI-830.0<160>3<170>FastSEQ Windows 4.0版<210>1<211>3281<212>DNA<213>人<400>1gagctcctca cacggactct gtcagctcct ccctgcagcc tatcggccgc ccacctgagg 60cttgtcggcc gcccacttga ggcctgtcgg ctgccctctg caggcagctc ctgtccccta 120caccccctcc ttccccgggc tcagctgaaa gggcgtctcc cagggcagct ccctgtgatc 180tccaggacag ctcagtctct cacaggctcc gacgccccct atgctgtcac ctcacagccc 240tgtcattacc attaactcct cagtcccatg aagttcactg agcgcctgtc tcccggttac 300aggaaaactc tgtgacaggg accacgtctg tcctgctctc tgtggaatcc cagggcccag 360ccagtgcctg acacggaaca gatgctccat aaatactggt taaatgtgtg ggagatctct 420aaaaagaaac atatcacctc cgtgtggccc ccagcagtca gagtctgttc catgtggaca 480caggggcact ggcaccagca tgggaggagg ccagcaagtg cccgcggctg ccccaggaat 540gaggcctcaa cccccagagc ttcagaaggg aggacagagg cctgcaggga atagatcctc 600cggcctgacc ctgcagccta atcctgagtt cagggtcagc tcacaccacg tcgaccctgg 660tcagcatccc tagggcagtt ccagacaagg ccggaggtct cctcttgccc tccagggggt 720gacattgcac acagacatca ctcaggaaac ggattcccct ggacaggaac ctggctttgc 780taaggaagtg gaggtggagc ctggtttcca tcccttgctc caacagaccc ttctgatctc 840tcccacatac ctgctctgtt cctttctggg tcctctgagg acctgttctg ccaggggtcc 900ctgtgcaact ccagactccc tcctggtacc accatgggga aggtggggtg atcacaggac 960agtcagcctc gcagagacag agaccaccca ggactgtcag ggagaacatg gacaggccct 1020gagccgcagc tcagccaaca gacacggaga gggagggtcc ccctggagcc ttccccaagg 1080acagcagagc ccagagtcac ccacctccct ccaccacagt cctctctttc caggacacac 1140aagacacctc cccctccaca tgcaggatct ggggactcct gagacctctg ggcctgggtc 1200tccatccctg ggtcagtggc ggggttggtg gtactggaga cagagggctg gtccctcccc 1260agccaccacc cagtgagcct ttttctagcc cccagagcca cctctgtcac cttcctgttg 1320
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权利要求
1.一种能有效地引发抗癌胚抗原(CEA)提呈细胞免疫应答的DNA疫苗，其包括(a)可操作地编码CEA的质粒DNA；和(b)可操作地编码CD40配体的质粒DNA；及药学上可接受的载体。
2.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA均整合到同一质粒中。
3.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA各自整合到不同质粒中。
4.根据权利要求1的DNA疫苗，其中两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的细菌传递载体中。
5.根据权利要求4的DNA疫苗，其中所述的细菌传递载体是选自减毒的鼠伤寒沙门氏菌和减毒的单核细胞增生杆菌的细菌。
6.根据权利要求1的DNA疫苗，其中两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的病毒载体中。
7.根据权利要求6的DNA疫苗，其中所述的病毒载体选自以下病毒的减毒形式疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。
8.根据权利要求1的DNA疫苗，其中两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的鼠伤寒沙门氏菌传递载体中。
9.根据权利要求1的DNA疫苗，其中所述的CD40配体是CD40LT。
10.一种免疫哺乳动物抗癌胚抗原(CEA)提呈癌细胞的方法，其包括给予哺乳动物有效免疫应答引发量的DNA疫苗，所述DNA疫苗包括可操作地编码CEA的质粒DNA和可操作地编码CD40配体的质粒DNA，所述的DNA疫苗的量足以引发抗CEA提呈细胞的免疫应答。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的哺乳动物是人类。
12.根据权利要求10的方法，其中所述的两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的细菌传递载体中。
13.根据权利要求12的方法，其中所述的细菌传递载体是选自减毒的鼠伤寒沙门氏菌和减毒的单核细胞增生杆菌的细菌。
14.根据权利要求10的方法，其中两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的病毒传递载体中。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的病毒传递载体选自以下病毒的减毒形式疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。
16.根据权利要求10的方法，其中所述的CD40配体是CD40LT。
17.根据权利要求10的方法，其中所述的癌胚抗原提呈细胞是结肠癌细胞。
18.根据权利要求10的方法，其中所述疫苗经口服施用。
19.根据权利要求10的方法，其中所述可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA均整合到同一质粒中。
20.根据权利要求10的方法，其中所述可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA各自整合到不同质粒中。
21.一种免疫哺乳动物抗癌胚抗原(CEA)提呈癌细胞的方法，其包括下列步骤(a)给予哺乳动物有效免疫应答引发量的DNA疫苗，所述DNA疫苗包括可操作地编码CEA的质粒DNA和可操作地编码CD40配体的质粒DNA；和(b)给予哺乳动物在药学上可接受的载体中的免疫应答增强量的重组抗体融合蛋白huKS1/4-IL2。
22.根据权利要求21的方法，其中所述的哺乳动物是人类。
23.根据权利要求21的方法，其中所述的两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的细菌传递载体中。
24.根据权利要求23的方法，其中所述的细菌传递载体是选自减毒的鼠伤寒沙门氏菌和减毒的单核细胞增生杆菌的细菌。
25.根据权利要求21的方法，其中两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的病毒传递载体中。
26.根据权利要求25的方法，其中所述的病毒传递载体选自以下病毒的减毒形式疱疹病毒、腺病毒、牛痘病毒和禽痘病毒。
27.根据权利要求21的方法，其中所述的CD40配体是CD40LT。
28.根据权利要求21的方法，其中所述的癌胚抗原提呈细胞是结肠癌细胞。
29.根据权利要求21的方法，其中所述疫苗经口服施用。
30.根据权利要求21的方法，其中所述重组抗体融合蛋白huKS1/4-IL2经静脉施用。
31.根据权利要求21的方法，其中所述可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA均整合到同一质粒中。
32.根据权利要求21的方法，其中所述可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA各自整合到不同的质粒中。
33.一种试剂盒，其包括包装在密封、无菌容器中的权利要求1的疫苗，所述容器上粘贴有标签，标签上印有疫苗鉴定材料和将所述疫苗单独给予患者的有用信息。
34.根据权利要求33的试剂盒，其中所述的CD40配体是CD40LT，和两种质粒DNA均可操作地整合到减毒的鼠伤寒沙门氏菌传递载体中。
35.根据权利要求33的试剂盒，其进一步包括包装在密封、无菌容器中的重组抗体融合蛋白huKS1/4-IL2和药学上可接受的载体，所述容器上粘贴有标签，标签上印有融合蛋白鉴定材料和将所述融合蛋白单独给予患者的有用信息。
全文摘要
本发明涉及一种可有效引发抗癌胚抗原(CEA)提呈细胞的免疫应答的DNA疫苗，所述疫苗包括可操作地编码CEA的DNA和可操作地编码CD40配体的DNA，序列分别为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或其同型三聚体。该DNA疫苗可整合到传递载体，如减毒活细菌或病毒，或脂质体载体中。优选该DNA疫苗经口服施用给哺乳动物(如人)以引发抗CEA提呈细胞(如结肠癌细胞)的免疫应答。本发明的方法优选包括用重组抗体融合蛋白huKS1/4－IL2处理哺乳动物以增强疫苗的免疫应答的有效性的步骤。
文档编号A61K38/00GK1650015SQ03809976
公开日2005年8月3日 申请日期2003年2月28日 优先权日2002年3月2日
发明者R·向, R·A·赖斯费尔德 申请人:斯克里普斯研究学院