专利名称：治疗剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及对生物体内与胰岛素有关的疾病例如糖尿病、肥胖症等的治疗或预防有效的药物、食品、饮料或饲料。
背景技术：
胰岛素是哺乳动物正常的碳水化合物、蛋白质和脂肪代谢所必需的激素。I型糖尿病患者由于不能足够产生支持生命的激素——胰岛素，为了生存，需要由外部给予胰岛素。II型糖尿病患者因胰岛素产生量不足、胰岛素抗性等原因而导致血糖量异常，为了将该血糖量控制到适当的量，需要给予胰岛素、给予胰岛素分泌促进药物。但是，II型糖尿病患者中，对于因高胰岛素血症或胰岛素受体异常、胰岛素受体的下游信号异常等而引起的胰岛素抗性为主要病因的糖尿病患者来说，即使给予胰岛素或胰岛素分泌促进药物，也未必见疗效。
近年来，为了解决胰岛素的副作用和上述问题，进行了与胰岛素具有同样生理机能的物质(以下也可称为类胰岛素物质)的开发，证实了合成的苯醌衍生物是类胰岛素物质(例如参照国际公开第99/51225号公开小册子)、来自紫根的紫草素是类胰岛素物质(例如参照Kamei R.等七人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，2002年，Vol.292，642-651页)。这些类胰岛素物质显示与胰岛素同样的生理活性，不仅对I型糖尿病患者，对II型糖尿病患者、进一步对以胰岛素抗性为主要病因的II型糖尿病患者，有望改善其症状。
八丈芹(アシタバ)是伞形科的大型多年生草本植物，已知具有各种促进健康的效果。例如已知八丈芹所具有的生理活性有预防高血压的效果、抗菌作用、抗肿瘤作用、抑制胃酸分泌作用、抗癌效果、增强神经生长因子生成的效果、增强肝细胞生长因子生成的作用(例如参照国际公开第01/76614号公开小册子)，但是，对于抗糖尿病作用和抗肥胖作用等的类胰岛素作用则至今不为人所知。
芹菜(セロリ)是属于伞型科、已知具有各种生理作用的植物。芹菜的生理作用已知有抗凝血作用、抑癌作用等。但是对于抗糖尿病作用和抗肥胖作用等的类胰岛素作用则至今不为人所知。
欧芹是属于伞型科、已知具有各种生理作用的植物。欧芹的生理作用已知有改善贫血、预防食物中毒作用、止血作用、消除疲劳、发汗、利尿、保温效果等。但是对于抗糖尿病作用和抗肥胖作用等类胰岛素作用则至今不为人所知。
发明内容
本发明的目的在于开发来自天然物、可安全简便地摄取、适合作为食品材料、药物原料、来自具有类胰岛素作用的植物的处理物，并提供使用该处理物的药物、食品、饮料或饲料。
以下对本发明进行概述。本发明的第一发明涉及与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗药物或预防药物，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
本发明的第二发明涉及类胰岛素作用剂，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
本发明的第三发明涉及与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗用或预防用的食品、饮料或饲料，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
本发明的第四发明涉及细胞摄取葡萄糖的促进剂，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
本发明的第五发明涉及向脂肪细胞的分化诱导剂，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
本发明的第一至五发明中，伞形科植物例如有八丈芹、芹菜或欧芹。
附图简述
图1是表示由八丈芹根提取组分分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
图2是表示由八丈芹根提取组分分级的级分3、4分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
图3是表示八丈芹根提取组分促进葡萄糖摄入的作用的图。
图4是表示由八丈芹叶提取组分分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
图5是表示由芹菜叶提取组分分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
图6是表示芹菜叶提取组分促进葡萄糖摄入的作用的图。
图7是表示由欧芹提取组分分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
图8是表示欧芹提取组分促进葡萄糖摄入的作用的图。
图9是表示由八丈芹根提取组分分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
图10是表示八丈芹根提取组分促进葡萄糖摄入作用的图。
图11是表示八丈芹叶提取组分促进葡萄糖摄入作用的图。
图12是表示八丈芹根提取物分级级分促进葡萄糖摄入作用的图。
图13是表示松胞菌素B抑制八丈芹根乙醇提取组分促葡萄糖摄入的作用的图。
图14是表示八丈芹根乙醇提取组分和胰岛素促进葡萄糖摄入作用的协同效果的图。
图15是表示在由八丈芹根乙醇提取组分分化诱导的脂肪细胞中，通过胰岛素的刺激来促进葡萄糖摄入的作用的图。
图16是表示由八丈芹茎叶提取组分分化诱导的脂肪细胞中甘油三酯生物合成量的图。
实施发明的最佳方式本发明中，伞形科植物是属于被子植物类伞形科的植物，例如有八丈芹、水芹、鸭儿芹、独活、胡萝卜、芹菜、欧芹等。本发明中，可特别优选使用八丈芹、芹菜、欧芹。本发明中，可以将它们单独或将两种或以上混合使用。本发明中使用的伞形科植物并没有特别限定，可以使用果实、种子、种皮、花、叶、茎、根、根茎和/或将整株植物直接使用。
本发明中，作为有效成分使用的来自伞形科植物的处理物只要是具有类胰岛素作用即可，并没有特别限定，例如有提取物、粉碎物、榨汁液、破碎物、化学处理物、酶处理物，特别优选提取物、粉碎物和榨汁液。只要是可作为本发明的有效成分使用即可，并没有特别限定。各处理物可以单独或将两种或以上混合使用。
本发明中，类胰岛素作用是指显示与胰岛素同等的生理活性，对此并没有特别限定，例如有促进细胞摄入糖、氨基酸，合成糖原、蛋白质和抑制其分解等的代谢调节作用。作为本发明的有效成分，只要至少显示分化诱导为脂肪细胞作用或促进细胞摄入葡萄糖的作用即可。所述类胰岛素作用的有无，可按照后述实施例3或5的方法简便地测定。
本发明中，提取物是指用提取溶剂经过提取操作工序而得到的物质。提取可以按照公知的提取方法如下进行。例如将原料粉碎或切细，然后用溶剂分批式或连续式进行提取。对于获得提取物的提取溶剂并没有特别限定，可以是水，氯仿、乙醇、甲醇、异丙醇等醇类，丙酮、甲基乙基酮等酮类，乙酸甲酯、乙酸乙酯等亲水性或亲油性的溶剂，可以根据要求单独或作为适当的混合液使用。提取溶剂的量可以适当确定，通常相对于原料(固形分)，按照重量优选使用0.1-100倍量的提取溶剂。提取温度也可以根据目的适当确定，水提取的情况下，通常优选4-130℃，更优选25-100℃。另外，溶剂中含有乙醇时，优选4-60℃范围。提取时间也可以考虑提取效率来确定。通常优选适当选取原料、提取溶剂、设定提取温度，使提取时间为数秒-数日，更优选5分钟-24小时的范围。提取操作例如可以边搅拌边进行，或静置进行，还可以根据需要重复多次进行。通过上述操作，可得到来自伞形科植物的提取物(以下也可以称为本发明的提取物)。根据需要，可对提取物进行过滤、离心、浓缩、超滤、分子筛等处理，制备目标类胰岛素物质的浓缩的提取物。提取物、浓缩提取物的类胰岛素作用可按照后述实施例3或5的方法简便地测定。另外，按照公知的方法，将伞形科植物制成茶叶状，用该物质制备提取物(例如八丈芹茶)，如果该提取物也具有类胰岛素作用，则也可作为本发明的提取物使用。另外含有两种或以上这些提取物并使用。本发明中，可以含有两种或以上由不同的方法得到的提取物并使用。
本发明中，用公知的方法分级来自伞形科植物的提取物而得到的组分、或通过多次重复分级操作而得到的级分也包括在本发明的提取物中。上述分级方法有提取、分级沉淀、柱层析、薄层色谱等。以类胰岛素作用为指标，通过对所得组分进一步纯化，可以分离出类胰岛素物质。
除来自伞形科植物的提取物之外的来自伞形科植物的处理物的制备方法例如有将植物干燥、粉碎，可得到粉末状的来自伞形科植物的粉碎物。优选通过冷冻干燥进行干燥。另外也可以通过冷冻粉碎获得粉碎物。
来自伞形科植物的榨汁液的制备方法只要是公知的植物榨汁方法即可，并没有特别限定，例如可以使用螺旋式、齿轮式、转刀式等压榨机或果汁机来榨汁。作为前处理，可以切细或破碎，用上述果汁机用布等压榨，获得榨汁液。
破碎物是指将伞形科植物破碎的物质，通常比粉碎物的组织片要大，例如可使用破碎机来制备。化学处理物并没有特别限定，例如指将伞形科植物进行酸处理、碱处理、氧化处理、还原处理等而得到的物质，例如可将伞形科植物浸泡于含有盐酸、硫酸、硝酸、柠檬酸、乙酸等无机酸或有机酸，或者氢氧化钠、氢氧化钾、氨等无机碱或有机碱的水溶液中来制备。化学处理物包括来自经过了上述化学处理的植物体的全部物质。酶处理物是指例如经果胶醇、纤维素酶、木聚糖酶、淀粉酶、甘露聚糖酶、葡糖苷酶等处理的酶处理物，微生物处理的酶促反应产物(例如发酵产物)，例如可通过使上述酶在适当的缓冲液中与伞形科植物作用来制备。酶处理物包括来自经上述酶处理的植物体的全部物质。并且，作为来自伞形科植物的处理物，还包括将伞形科植物的茎切断，由其断面得到的汁液。
本发明中，对于来自伞形科植物的处理物的形状，只要具有类胰岛素作用即可，并没有特别限定，可以是粉末状、固态状、液状的任意形状。另外也可以将该物质用公知的方法制粒，以得到的粒状固态物质作为本发明的来自伞形科植物的处理物使用。制粒方法并没有特别限定，例如有转动制粒、搅拌制粒、流化床制粒、气流制粒、挤压制粒、压制制粒、碎解制粒、喷射制粒或喷雾制粒等。将粉末状的该来自伞形科植物的处理物溶解于液体例如水、醇等，制成液状，这也可作为本发明的来自伞形科植物的处理物使用。
本发明中，例如可以将有效成分本身作为本说明书中的与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗用或预防用的食品、饮料或饲料等使用。使用有效成分本身的方式例如可将上述提取物或粉碎物等制成片剂的形式。片剂的制造可以按照公知的压片方法进行。
本发明中还提供高浓度或高纯度含有来自伞形科植物的处理物的食品、饮料或饲料，这是指与以往的食品、饮料或饲料相比，本发明的食品、饮料或饲料中高浓度和/或高纯度含有类胰岛素物质。如下所述，所述食品、饮料或饲料通过在以往的食品等中含有本发明的有效成分来制造。
本发明中，将来自伞形科植物的处理物称为本发明的有效成分，也可以将含有本发明的有效成分的、与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗药物或预防药物称为本发明的治疗药物或预防药物。
如后面所述，本发明的有效成分中未见毒性。另外也不用担心产生副作用。因此，可安全且恰当地进行疾病的治疗或预防。因此含有该有效成分构成的本发明的治疗药物、预防药物、食品、饮料或饲料对于与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗或预防有效。
本发明中，与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病是具有选自血液中胰岛素水平变化、胰岛素或胰岛素受体的活性水平变化、胰岛素受体的下游信号异常、以及它们的组合的因素为特征的疾病，例如有糖尿病、肥胖症、动脉硬化、可卡因戒断症状、充血性心力衰竭、心血管痉挛、脑血管痉挛、嗜铬细胞瘤、神经节成神经细胞瘤、慢性进行性舞蹈病、高脂血症、高胰岛素血症。糖尿病有I型糖尿病、II型糖尿病任意形式。II型糖尿病也包括即使给予胰岛素或促胰岛素分泌药物也不见治疗效果的以胰岛素抗性为主要病因的疾病。
已知胰岛素促进诱导前脂肪细胞向脂肪细胞分化，还已知成熟的脂肪细胞会摄入葡萄糖，在细胞内蓄积甘油三酯(Rubin C.S.等、J.Biol.Chem.，Vol.253，No.20，7570-7578页(1978年))。即，利用该方法，给予受试物质以取代胰岛素，通过测定向脂肪细胞的分化、细胞中甘油三酯的生物合成量，可以测定受试物质的类胰岛素作用.
已知胰岛素具有促进葡萄糖摄入的作用，已知在成熟的脂肪细胞中，通过胰岛素的作用，会促进葡萄糖向细胞内的摄入(Rubin C.S.等、J.Biol.Chem.，Vol.253，No.20，7579-7583页(1978年))。即，利用该方法，给予受试物质以取代胰岛素，通过测定成熟脂肪细胞内葡萄糖的摄入量，可以测定受试物质的类胰岛素作用。
本发明的治疗药物或预防药物例如有将本发明的上述有效成分与公知的药用载体组合制成的制剂。
本发明的治疗药物或预防药物的制造通常通过将上述有效成分与药学上可接受的液状或固体状载体混合而进行，可以根据需要加入溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、稳定剂、赋型剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂等，制成片剂、颗粒剂、散剂、粉末剂、胶囊剂等固体制剂，通常的溶液剂、混悬剂、乳剂等液体制剂。另外也可以制成在使用前添加适当的载体而形成液状的干燥品、以及其他的外用制剂。
药用载体可根据治疗药物或预防药物的给药形式和剂型选择。制成含有固体组合物的口服制剂时，可以制成片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂等，例如可利用淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖、羧甲基纤维素、玉米淀粉、无机盐等。另外，制备口服制剂时，还可以混合粘合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、助流剂、矫味剂、着色剂、芳香料等。例如制成片剂或丸剂时，可以根据需要用蔗糖、明胶、羟丙基纤维素等糖衣或者胃溶性或肠溶性物质的薄膜包衣。制成含有液体组合物的口服制剂时，可以制成药理学上可接受的乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂等，例如可以利用精制水、乙醇等作为载体。另外还可以根据需要添加润湿剂、助悬剂等的助剂、甜味剂、香味剂、防腐剂等。
另一方面，制成非口服制剂时，可以按照常规方法，将本发明的上述有效成分溶解或悬浮于作为稀释剂的注射用蒸馏水、生理盐水、葡萄糖水溶液、注射用植物油、芝麻油、花生油、大豆油、玉米油、丙二醇、聚乙二醇等中，根据需要，通过加入杀菌剂、稳定剂、等渗剂、止痛剂等来制备。另外，也可以制备固体组合物，在使用前溶解于无菌水或无菌注射用溶剂中使用。
外用制剂包括经皮给药或经粘膜(口腔、鼻腔)给药用的固体、半固体状或液状制剂。也包括栓剂等。例如可制成乳剂、洗剂等的乳剂，外用酊剂、经粘膜给药的溶液剂等液体状制剂，油性软膏、亲水性软膏等软膏剂，膜剂、经皮贴片、糊剂等经皮给药或粘膜给药用的贴剂等。
以上各种制剂可分别利用公知的药用载体等，按照常规方法适当地制备。所述制剂中的有效成分的含量要考虑到给药形式、给药方法等，优选只要是在后述的给药量范围内可给予该有效成分的量，则并没有特别限定。
本发明的治疗药物或预防药物按照与制剂形式相适应的适当的给药途径给药。给药方法并没有特别限定，可以内服、外用和注射。注射剂例如可以静脉、肌内、皮下、皮内等给药；作为外用剂，例如栓剂，则可通过与栓剂相适应的给药方法给药。
本发明的治疗药物或预防药物的给药量根据该制剂形式、给药方法、使用目的和该治疗药物或预防药物的给药对象患者的年龄、体重、症状而适当设定，并不是一成不变的。通常按照制剂中含有的上述有效成分计算给药量，优选人(例如成人)每天为0.1μg-1g/kg。当然给药量根据各种条件而变化，因此，有比上述给药量少即足够的情形，也有需要超出上述范围的情形。可以在需要的给药量范围内，一天内单次给药，或分多次给药。另外，本发明的治疗药物或预防药物除了直接口服给药之外，还可以添加到任意的饮料食品中进行日常摄取。如实施例20所记载，本发明的有效成分和与本发明的有效成分具有同等作用的物质例如胰岛素联合使用，有望得到它们的协同效果。
本发明还可提供含有上述有效成分的类胰岛素作用剂。该类胰岛素作用剂可以是上述有效成分本身，也可以是含有上述有效成分的组合物。该类胰岛素作用剂例如可以将上述有效成分与可与该有效成分相同用途使用的其它成分(例如胰岛素等)等混合，按照上述治疗药物或预防药物的制备方法制成通常使用的药剂的形式。该类胰岛素作用剂中上述有效成分的含量要考虑该类胰岛素作用剂的给予方法、使用目的等，只要是可得到表达本发明所需效果的量即可，并没有特别限定。有效成分的含量例如是0.01-100重量％。该类胰岛素作用剂的用量只要是可得到表达本发明所需的效果的量即可，并没有特别限定。给予生物体使用时，特别优选以可在上述治疗药物或预防药物中的有效成分给药量的范围内给予有效成分的量使用。类胰岛素作用剂对于与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病有效。另外该类胰岛素作用剂可用于制造这些疾病的治疗或预防用食品、饮料或饲料。这些食品、饮料或饲料可以按照上述与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗用或预防用的食品、饮料或饲料的标准使用。该类胰岛素作用剂还对于与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的药物筛选有用。并且该类胰岛素作用剂对于胰岛素与细胞的作用机理的研究、该细胞的物理变化相关的机能研究有用。
通过将本发明的类胰岛素作用剂给予人，有望降低血液中胰岛素水平。即，可以使用本发明的类胰岛素作用剂作为在治疗或预防中需要降低胰岛素水平的疾病的治疗或预防药物。对于该疾病并没有特别限定，例如有高胰岛素血症、阿尔茨海默氏病等。另外，有报告指出经由胰岛素受体的刺激与寿命延长效果有密切关系(Science，vol.299，572-574页(2003年)；Nature，vol.424，277-284页(2003年))，因此可以将本发明的类胰岛素作用剂作为抗老化剂使用。
如后面所述，本发明的有效成分未见毒性。也不用担心副作用。因此，可以安全且适当地表达类胰岛素作用。因此，含有该有效成分的本发明的药物、食品、饮料或饲料对于与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗或预防有效。
本发明还提供含有、添加和/或稀释上述有效成分而成的与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗用或预防用的食品、饮料或饲料。本发明的食品、饮料或饲料通过其类胰岛素作用，对于与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的症状改善、预防极为有效。并且，本发明的食品或饮料是具有降低血糖值的作用的降血糖用食品或饮料，对于需要注意血糖值或体内脂肪的人是有效的功能性食品或饮料。
本说明书中，“含有”是指食品、饮料或饲料中含有本发明所使用的有效成分的形式；“添加”是指向食品、饮料或饲料原料中加入本发明所使用的有效成分的形式；“稀释”是指向本发明所使用的有效成分中加入食品、饮料或饲料的原料的形式。
本发明的食品、饮料或饲料的制造方法并没有特别限定，例如混合、调制、加工等可按照通常的食品、饮料或饲料进行，通过这些制造方法制造，所得食品、饮料或饲料只要含有具类胰岛素作用的本发明的上述有效成分即可。
本发明的食品或饮料并没有特别限定，例如有含有本发明的上述有效成分的谷物加工制品(例如小麦粉加工制品、淀粉类加工制品、预混加工制品、面类、通心粉类、面包类、豆馅包类、荞麦面类、麦麸、米粉、粉丝、包装糯米糕点等)、油脂加工制品(例如塑性油脂、炸油、色拉油、蛋黄酱、调味酱等)、大豆加工制品(例如豆腐类、豆酱、纳豆等)、食用肉类加工制品(例如火腿、腊肉、压制火腿、红肠等)、水产制品(例如冷冻碎鱼肉、鱼糕、圆筒状鱼糕、鱼糕片、炸胡萝卜鱼肉片、氽鱼丸、筋、鱼肉火腿、肠、鲣鱼刨花、鱼卵加工制品、水产罐头、甜烹海味等)、乳制品(例如原料乳、奶油、酸乳酪、黄油、干酪、练乳、奶粉、冰激凌等)、蔬菜·果实加工制品(例如糊类、果酱类、成菜类、果实饮料、蔬菜饮料、混合饮料等)、糕点类(例如巧克力、饼干类、糕点面包类、蛋糕、糯米糕点(日本式)、糯米饼干类等)、酒精类(例如日本酒、中国酒、葡萄酒、威士忌、烧酒、伏特加、白兰地、杜松子酒、朗姆酒、啤酒、清凉酒精饮料、果酒、利口酒等)、嗜好饮料(例如绿茶、红茶、乌龙茶、咖啡、清凉饮料、乳酸饮料等)、调料(例如酱油、酱汁、醋、甜料酒等)、罐装·瓶装·袋装食品(例如牛肉饭、盖浇饭、红豆饭、咖哩、其它各种加工食品等)、半干燥或浓缩食品(例如肝酱、其它调味酱、荞面·面条汁、浓缩汤类等)、干燥食品(例如快餐面类、快餐咖哩、速溶咖啡、果汁粉、汤粉末、快餐酱汤、加工食品、加工饮料、加工汤等)、冷冻食品(例如鸡素烧、蒸鸡蛋羹、烤鳗鱼、汉堡牛排、烧麦、饺子、各种浓肉汤、果汁鸡尾酒等)、固态食品、液体食品(例如汤等)、香辛料类等农产·林产加工制品、畜产加工制品、水产加工制品等。
本发明的食品或饮料含有、添加和/或稀释一种或多种上述有效成分，其含量只要是与表达类胰岛素作用所必需的量相当即可，对于其形状并没有特别限定，也包括可口服摄取的片状、颗粒状、胶囊状等形状。
本发明的饮料可以将本发明的有效成分与伞形科以外的植物例如蔬菜或果实等的榨汁液混合、或与伞形科植物同时榨汁，制成健康饮料。例如将八丈芹的榨汁液用水稀释，与胡萝卜、小松菜、芜菁、青梗菜、西红柿、柑桔、柠檬、葡萄柚、奇异果、菠菜、小萝卜、白萝卜、白菜、卷心菜、做沙拉的生菜、生菜、韭菜、秋葵、菜椒、黄瓜、菜豆、毛豆、豌豆、玉米、蒜、芝麻菜、枇杷、桔子、甘夏橘等的榨汁液，牛乳，豆乳等混合，制成具有类胰岛素作用的健康饮料。
本发明的食品或饮料中的上述有效成分的含量并没有特别限定，可从其感官和活性表达的角度考虑适当选择，例如每100重量％的食品优选0.00001重量％或以上，更优选0.0001-10重量％，进一步优选0.0006-6重量％；每100重量％的饮料优选0.00001重量％或以上，更优选0.0001-10重量％，进一步优选0.0006-6重量％。对于本发明的食品或饮料中含有的有效成分，例如人(例如成人)每天可以摄取0.001mg-10g/kg，优选0.1mg-1g/kg。
如上所述，当将有效成分以片剂的形式作为食品等提供时，有效成分的含量例如为0.01-100重量％。而直接将榨汁液作为饮料时，本发明的有效成分的含量例如为0.01-100重量％。
本发明还提供含有、添加和/或稀释上述有效成分而得到的具有类胰岛素作用的生物用饲料，并且作为一个实施方案，提供生物的饲养方法，其特征在于给予生物上述有效成分。作为本发明的饲料的另一个实施方案，还提供生物饲养剂，其特征在于该生物饲养剂中含有上述有效成分。
这些发明中，生物是指例如养殖动物、动物宠物等，养殖动物例如有家畜、实验动物、家禽、鱼类、甲壳类或贝类。饲料例如有维持和/或改善身体状况的饲料。生物饲养剂例如有浸渍剂、饲料添加剂、饮料添加剂。
根据这些发明，在适用该发明的以上例举的生物中，通过本发明所使用的上述有效成分的类胰岛素作用，有望表达出与本发明的上述治疗药物或预防药物同样的效果。即，上述饲料等具有治疗或预防该生物的与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的效果。
通常，对每1kg对象生物的体重、每天优选给予0.01-2000mg本发明所使用的上述有效成分。关于给予，例如可通过将该有效成分添加并混合到供给对象生物的人工混合饲料的原料中，或与人工混合饲料的粉末原料混合后再添加并混合到其他原料中来进行。对于上述有效成分在饲料中的含量并没有特别限定，可根据目的适当设定，优选0.001-15重量％的比例。
本发明的饲料的制造方法并没有特别限定，其混合可按照通常的饲料进行，只要所制造的饲料中含有具有类胰岛素作用的本发明的上述有效成分即可。
可适用本发明的生物并没有特别限定，广泛适用于养殖动物中的马、牛、猪、羊、山羊、骆驼、驼羊等家畜；小鼠、大鼠、豚鼠、兔等实验动物；鸡、鸭、火鸡、鸵鸟等家禽；以及作为动物宠物的狗、猫等。
通过摄取含有具有类胰岛素作用的本发明中使用的上述有效成分的饲料，或将对象生物浸泡于含有具有类胰岛素作用的本发明中使用的上述有效成分的液体中，可以良好地维持或改善家畜、实验动物、家禽、动物宠物等的身体状况。这些例子也包括在本发明的饲养方法中。
本发明也可以提供含有上述有效成分的细胞摄入葡萄糖的促进剂。该葡萄糖摄入促进剂可以是上述有效成分本身，也可以是含有上述有效成分的组合物。该葡萄糖摄入促进剂例如可以将上述有效成分与可与该有效成分同样用途使用的其它成分(例如胰岛素等)等混合，按照上述治疗药物或预防药物的制造方法制成通常使用的试剂的形式。该葡萄糖摄入促进剂中上述有效成分的含量要考虑到该葡萄糖摄入促进剂的给予方法、使用目的等，只要是可表达本发明所希望的效果的量即可，并没有特别限定。有效成分的含量例如是0.01-100重量％。另外，该葡萄糖摄入促进剂的使用量只要是可表达本发明所希望的效果的量即可，对此并没有特别限定。当给予生物体使用时，特别优选以可在上述治疗药物或预防药物中的有效成分给药量的范围内给予有效成分的量使用。该葡萄糖摄入促进剂对于在治疗或预防中需要促进细胞摄入葡萄糖作用的疾病的治疗或预防有效。关于该疾病，除了上述与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病之外，例如还有心脏疾病，特别是心肌梗塞、缺血后的心脏损伤等。另外，由于该葡萄糖摄入促进剂促进细胞摄入葡萄糖，因此，通过在肌细胞中发挥该作用，可以产生增强肌肉的作用、消除疲劳的作用。该葡萄糖摄入促进剂可用于上述疾病的治疗用或预防用食品、饮料或饲料的制造。这些食品、饮料或饲料可以作为上述的与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗用或预防用的食品、饮料或饲料使用。该葡萄糖摄入促进剂对于在上述治疗或预防中需要细胞摄入葡萄糖促进作用的疾病的药物筛选有用。并且该葡萄糖摄入促进剂对于细胞摄入葡萄糖的作用机理研究、该细胞的物理变化等的机能研究也有用。
本发明也可提供含有上述有效成分的向脂肪细胞的分化诱导剂。关于可由该分化诱导剂分化诱导为脂肪细胞的前脂肪细胞，只要是可分化为脂肪细胞的细胞即可，并没有特别限定，例如除前脂肪细胞外，还有成纤维细胞、间充质类干细胞等。该分化诱导剂可以是上述有效成分本身，也可以是含有上述有效成分的组合物。该分化诱导剂例如可以将上述有效成分与可与该有效成分同样用途使用的其它成分(例如胰岛素等)等混合，按照上述治疗药物或预防药物的制造方法制成通常使用的药剂的形式。该分化诱导剂中上述有效成分的含量要考虑该分化诱导剂的给予方法、使用目的等，只要是可表达本发明所希望的效果的量即可，并没有特别限定。有效成分的含量例如是0.01-100重量％。另外，该分化诱导剂的使用量只要是可表达本发明所希望的效果的量即可，对此并没有特别限定。当给予生物体使用时，特别优选以可在上述治疗药物或预防药物中的有效成分给药量的范围内给予有效成分的量使用。该分化诱导剂对于在治疗或预防中需要分化诱导为脂肪细胞作用的疾病的治疗或预防有效。关于该疾病，除了上述与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病之外，例如还可以是痛风、脂肪肝、胆囊结石、月经不调、不孕症等。该分化诱导剂可用于上述疾病的治疗用或预防用食品、饮料或饲料的制造。这些食品、饮料或饲料可以作为上述与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗用或预防用的食品、饮料或饲料使用。该分化诱导剂对于在上述治疗或预防中需要分化诱导为脂肪细胞作用的疾病的药物筛选有用。并且该分化诱导剂对于分化诱导为脂肪细胞作用的机理研究及其该物理变化等的机能研究也有用。
对于本发明中使用的上述有效成分，即使给予对于起作用表达来说的有效量，也未见毒性。例如口服给予时，将八丈芹、芹菜或欧芹的乙醇提取物分别以1g/kg单次给予小鼠，也未见死亡例。上述有效成分在口服给予大鼠时，即使口服单次给予1g/kg，也未见死亡例。
实施例以下例举实施例更具体地说明本发明，但本发明并不受这些描述的任何限定。如无特别说明，实施例中的％全部表示容量％。
实施例1八丈芹根提取组分的制备(1)将八丈芹(Angelica Keiskei)根部冷冻干燥，向10g细粉碎物中加入100mL氯仿，在室温下提取30分钟。抽滤后，对残余物重复同样的操作。将这些氯仿提取液合并，用旋转蒸发器减压浓缩，然后将干燥固化物溶解于2.5mL二甲基亚砜中，制成八丈芹根的氯仿提取组分。
(2)向实施例1-(1)的氯仿提取后残余物中加入100mL乙醇，在室温下提取30分钟。抽滤后，对残余物重复同样的操作。合并乙醇提取液，用旋转蒸发器减压浓缩，然后将干燥固化物溶解于2.5mL二甲基亚砜中，制备成八丈芹根的乙醇提取组分。
实施例2八丈芹根提取组分的分级向5.8kg八丈芹根部干燥粉末中加入24升乙酸乙酯，在室温下提取3小时，吸滤后将乙酸乙酯提取液与残余物分离。将得到的200mL乙酸乙酯提取液用旋转蒸发器减压浓缩，然后溶解于氯仿，用硅胶层析进行分级。以下表示分级条件。硅胶使用BW-300SP(Fuji-Silysia化学公司制100mL)。以氯仿(500mL)、氯仿∶甲醇(容量比、以下也同样)＝100∶1(300mL)、乙酸乙酯(200mL)的顺序进行洗脱。洗脱液依次分级为级分1(280mL)、级分2(200mL)、级分3(280mL)、级分4(240mL)，回收，分别减压浓缩、干燥固化，然后溶解于2mL乙醇中，得到硅胶柱分级级分1-4。
实施例3八丈芹根提取组分对分化诱导为脂肪细胞(1)分化诱导为脂肪细胞分化诱导为脂肪细胞是将前述Rubin C.S.等人的方法部分改进而进行的。在含有200μM抗坏血酸的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)的Dulbecco氏改良eagle氏培养基(SIGMA-ALDRICH公司，D6046)(以下称为A-D-MEM培养基)中以4×103个/mL悬浮前脂肪细胞株3T3-L1(ATCC CCL-92.1)，在12孔微量滴定板的孔内各加入2mL，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养7天。在第2、4天用相同的培养基进行培养基更换。第7天，更换为含有0.25μM地塞米松的A-D-MEM培养基，然后添加实施例1-(1)中制备的八丈芹根的氯仿提取组分或实施例1-(2)中制备的八丈芹根的乙醇提取组分，使终浓度为0.1％。将添加4μL 5mg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)水溶液的组作为阳性对照，将添加水的组作为阴性对照。添加各成分后，在45小时时，更换为A-D-MEM培养基，分别向各孔中加入4μL八丈芹根的氯仿提取组分或八丈芹根的乙醇提取组分、作为阳性对照添加2μL 5mg/mL胰岛素水溶液、作为阴性对照添加水，再培养7天。在第2、4天更换培养基，此时，分别向各孔中加入了4μL八丈芹根的氯仿提取组分或八丈芹根的乙醇提取组分、作为阳性对照添加了2μL5mg/mL胰岛素水溶液、作为阴性对照添加了水。
(2)甘油三酯生物合成量的测定测定细胞中甘油三酯的生物合成量作为分化诱导为成熟脂肪细胞的指标或作为对类胰岛素作用的评价。培养结束后，去掉培养基，用磷酸缓冲盐溶液洗涤细胞2次，加入1mL己烷∶异丙醇＝3∶2的溶剂，在室温下放置30分钟，然后回收上清。将该操作再次重复，将得到的2mL上清浓缩干燥固化。将沉淀溶解于100μL异丙醇中，然后用甘油三酯G-测定仪(和光纯药公司制、型号276-69801)测定10μL溶液中含有的甘油三酯的量。全部测定2次。
结果可见与添加水的组比较，八丈芹根的氯仿提取组分或八丈芹根的乙醇提取组分添加组与胰岛素添加组同样，诱导了甘油三酯的生物合成。即表明八丈芹根的氯仿提取组分或八丈芹根的乙醇提取组分有分化诱导为脂肪细胞的作用。这在图1中表示。图1的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例4八丈芹根提取物分级级分的向脂肪细胞的分化诱导作用按照实施例3的方法测定由实施例2制备的八丈芹根提取组分的各级分的向脂肪细胞的分化诱导活性。分别添加4μL 2.875mg/mL硅胶柱分级级分3或10.825mg/mL硅胶柱分级级分4作为样品。以添加4μL 5mg/mL胰岛素水溶液的组作为阳性对照，以添加水的组作为阴性对照。之后与实施例3的方法同样地进行培养基和样品的更换，添加样品7天后测定细胞中的甘油三酯的量。
结果可见与添加水的组比较，硅胶柱分级级分3和硅胶柱分级级分4添加组与胰岛素添加组同样，诱导了甘油三酯的生物合成。即表明硅胶柱分级级分3和硅胶柱分级级分4添加组有分化诱导为脂肪细胞的作用。这在图2中表示。图2的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例5八丈芹根提取组分对葡萄糖摄入的促进作用(1)成熟脂肪细胞的制备分化诱导为成熟脂肪细胞是将前述Rubin C.S.等人的方法部分改进而进行的。在含有200μM抗坏血酸的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)Dulbecco氏改良eagle氏培养基(SIGMA-ALDRICH公司制，D6046)中以4×103个/mL悬浮3T3-L1细胞(ATCC CCL-92.1)，在12孔微量滴定板的孔内各加入2mL，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养7天。第7天，更换为2mL含有200μM抗坏血酸、0.25μM地塞米松和10μg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)、0.5mM 3-异丁基1-甲基黄嘌呤(nacalai-tesque公司制、19624-44)的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)的Dulbecco氏改良eagle氏培养基。45小时后，更换为2mL含有200μM抗坏血酸和5μg/mL胰岛素的含10％胎牛血清(ギブコ公司制)Dulbecco氏改良eagle氏培养基，2天后、4天后更换同样的培养基，培养7天，制备成熟脂肪细胞。
(2)测定对成熟脂肪细胞摄入葡萄糖的促进作用测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为对葡萄糖摄入促进作用的评价或作为对类胰岛素作用的评价。
培养结束后，去掉培养基，用含有0.1w/v％牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司制，A8022)的Dulbecco氏改良eagle氏培养基洗涤细胞2次，然后分别向各孔中添加1mL含有八丈芹根的氯仿提取组分的二甲基亚砜溶液或八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液的相同培养基，使终浓度分别为0.025％、0.008％，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养过夜。以未添加样品的组作为阴性对照。培养过夜后，用赫佩斯缓冲盐溶液(140mM NaCl、5mM KCl、2.5mMMgSO4、1mM CaCl2、20mM赫佩斯-Na(pH7.4))洗涤细胞2次，在各孔中分别添加0.9mL含有八丈芹根的氯仿提取组分的二甲基亚砜溶液或八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液的相同缓冲液，使浓度分别为0.025％、0.008％，37℃培养75分钟。此时，在经过45分钟时，在未添加样品的孔中添加胰岛素，使终浓度为1μg/mL，以该组作为阳性对照。之后，加入100μL含有0.5μCi/mL 2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖(Perkin Elmer公司制、NET549A)、1mM 2-脱氧葡萄糖(nacalai-tesque公司制、10722-11)的赫佩斯盐缓冲液，再在37℃培养10分钟。培养结束后，去掉上清，用冷却至4℃的磷酸缓冲液洗涤细胞3次，然后加入0.5mL含有1％Nonidet P-40的磷酸盐缓冲液，溶解细胞，使摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖溶出。用25μL上清，以Aquasol-2(PerkinElmer公司制、6NE9529)作为闪烁液，通过液体闪烁计数器LS 6500(Beckman Coulter公司制)测定放射活性。
结果可见，与阴性对照相比较，各浓度的八丈芹根的氯仿提取组分或八丈芹根的乙醇提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明八丈芹根的氯仿提取组分或八丈芹根的乙醇提取组分的组具有促进葡萄糖摄入的活性。这在图3表示。图3中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例6八丈芹叶提取组分的制备向各2g八丈芹叶干燥粉末中加入40mL蒸馏水、乙醇或乙酸乙酯，提取30分钟，离心分离提取液和残余物。接着对残余物用30mL各溶剂重复2次提取操作。水提在60℃进行，乙醇提取、乙酸乙酯提取在室温下进行。收集所得提取液，用旋转蒸发器浓缩。最终，将水提取液溶解于10mL蒸馏水，得到八丈芹叶的水提取组分。将乙醇提取液溶解于8mL二甲基亚砜，得到八丈芹叶的乙醇提取组分。将乙酸乙酯提取液溶解于5mL二甲基亚砜，得到八丈芹叶的乙酸乙酯提取组分。
实施例7八丈芹叶提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用按照实施例3的方法测定由实施例6制备的八丈芹叶的水提取组分和八丈芹叶的乙醇提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用(类胰岛素活性)。
即，向各孔中添加八丈芹叶的水提取组分水溶液，使终浓度分别为0.4％、0.2％、0.1％，或向各孔中添加八丈芹叶的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度为0.066％、0.022％，以这些组作为样品。以添加4μL 5mg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)水溶液的组作为阳性对照，以添加二甲基亚砜的组作为阴性对照。之后与实施例3的方法同样地进行培养基和样品的更换，添加样品7天后，测定细胞中的甘油三酯的量。
结果可见，各浓度的八丈芹叶的水提取组分和八丈芹叶的乙醇提取组分添加组诱导了甘油三酯的生物合成。即表明八丈芹叶的水提取组分和八丈芹叶的乙醇提取组分有分化诱导为成熟脂肪细胞的作用。这在图4中表示。图4的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例8芹菜叶提取组分的制备向各2g芹菜叶干燥粉末中加入40mL蒸馏水、乙醇或乙酸乙酯，提取30分钟，离心分离提取液和残余物。接着对残余物用30mL各溶剂重复2次提取操作。水提在60℃进行，乙醇提取、乙酸乙酯提取在室温下进行。收集所得提取液，用旋转蒸发器浓缩。最终，将水提取液溶解于10mL蒸馏水，得到芹菜叶的水提取组分。将乙醇提取液溶解于5mL二甲基亚砜，得到芹菜叶的乙醇提取组分。将乙酸乙酯提取液溶解于5mL二甲基亚砜，得到芹菜叶的乙酸乙酯提取组分。
实施例9芹菜叶提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用按照实施例3的方法测定由实施例8制备的芹菜叶的水提取组分、芹菜叶的乙醇提取组分和芹菜叶的乙酸乙酯提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用(类胰岛素活性)。
即，向各孔中添加芹菜叶的水提取组分水溶液，使终浓度为0.1％；向各孔中添加芹菜叶的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液或芹菜叶的乙酸乙酯提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度分别为0.2％、0.066％、0.022％，以这些组作为样品。以添加4μL 5mg/mL胰岛素(TAKARABIO公司制)水溶液的组作为阳性对照，以添加二甲基亚砜的组作为阴性对照。之后与实施例3的方法同样地进行培养基和样品的更换，添加样品7天后，测定细胞中的甘油三酯的量。
结果可见，各浓度的芹菜叶的水提取组分、芹菜叶的乙醇提取组分和芹菜叶的乙酸乙酯提取组分添加组诱导了甘油三酯的生物合成。即表明芹菜叶的水提取组分、芹菜叶的乙醇提取组分和芹菜叶的乙酸乙酯提取组分有分化诱导为成熟脂肪细胞的作用。这在图5中表示。图5的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例10芹菜叶提取组分对葡萄糖摄入的促进作用按照实施例5记载的方法测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为由实施例8制备的芹菜叶的乙醇提取组分对葡萄糖摄入的促进作用的评价，或作为对类胰岛素作用的评价。
即，向各孔中添加芹菜叶的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液或芹菜叶的乙酸乙酯提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度分别为0.2％、0.066％，以这些组作为样品。以未添加样品的组作为阴性对照，以添加终浓度为1μg/mL的胰岛素的组作为阳性对照。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照比较，备浓度的芹菜叶的乙醇提取组分和芹菜叶的乙酸乙酯提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明芹菜叶的乙醇提取组分和芹菜叶的乙酸乙酯提取组分具有促进葡萄糖摄入的活性。这在图6表示。图6中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例11欧芹提取组分的制备向各2g欧芹干燥粉末中加入40mL蒸馏水、乙醇或乙酸乙酯，提取30分钟，离心分离提取液和残余物。接着对残余物用30mL各溶剂重复2次提取操作。水提在60℃进行，乙醇提取、乙酸乙酯提取在室温下进行。收集所得提取液，用旋转蒸发器浓缩。最终，将水提取液溶解于10mL蒸馏水，得到欧芹的水提取组分。将乙醇提取液溶解于5mL二甲基亚砜，得到欧芹的乙醇提取组分。将乙酸乙酯提取液溶解于5mL二甲基亚砜，得到欧芹的乙酸乙酯提取组分。
实施例12欧芹提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用按照实施例3的方法测定由实施例11制备的欧芹的水提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用(类胰岛素活性)。
即，向各孔中添加欧芹的水提取组分水溶液，使终浓度分别为0.4％、0.2％、0.1％，以这些组作为样品。以添加4μL 5mg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)水溶液的组作为阳性对照，以添加二甲基亚砜的组作为阴性对照。之后与实施例3的方法同样地进行培养基和样品的更换，添加样品7天后，测定细胞中的甘油三酯的量。
结果可见，各浓度的欧芹的水提取组分添加组诱导了甘油三酯的生物合成。即表明欧芹的水提取组分有分化诱导为成熟脂肪细胞的作用。这在图7中表示。图7的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例13欧芹提取组分对葡萄糖摄入的促进作用按照实施例5的方法测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为由实施例11制备的欧芹的乙醇提取组分和欧芹的乙酸乙酯提取组分促进葡萄糖摄入的作用的评价，或作为对类胰岛素作用的评价。
即，向各孔中添加欧芹的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液或欧芹的乙酸乙酯提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度分别为0.2％、0.066％，以这些组作为样品。以未添加样品的组作为阴性对照，以添加终浓度为1μg/mL的胰岛素的组作为阳性对照。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照比较，各浓度的欧芹的乙醇提取组分和欧芹的乙酸乙酯提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明欧芹的乙醇提取组分和欧芹的乙酸乙酯提取组分具有促进葡萄糖摄入的活性。其在图8表示。图8中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例14八丈芹根的乙醇提取组分和乙酸乙酯提取组分的制备向各2g八丈芹根干燥粉末中加入40mL乙醇或乙酸乙酯，在室温下提取30分钟，离心分离提取液和残余物。接着对残余物用30mL各溶剂重复2次提取操作。收集所得提取液，用旋转蒸发器浓缩。最终，将乙醇提取液溶解于1mL二甲基亚砜，得到八丈芹根的乙醇提取组分。将乙酸乙酯提取液溶解于1mL二甲基亚砜，得到八丈芹根的乙酸乙酯提取组分。
实施例15八丈芹根的乙醇提取组分和乙酸乙酯提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用按照实施例3的方法测定由实施例14制备的八丈芹根的乙醇提取组分和八丈芹根的乙酸乙酯提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用(类胰岛素活性)。
即，向各孔中添加八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液或八丈芹根的乙酸乙酯提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度分别为0.05、0.025％，以这些组作为样品。以添加4μL 5mg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)水溶液的组作为阳性对照，以添加二甲基亚砜的组作为阴性对照。之后与实施例3的方法同样地进行培养基和样品的更换，添加样品7天后，测定细胞中的甘油三酯的量。
结果可见，各浓度的八丈芹根的乙醇提取组分或八丈芹根的乙酸乙酯提取组分添加组诱导了甘油三酯的生物合成。即表明八丈芹根的乙醇提取组分和八丈芹根的乙酸乙酯提取组分有分化诱导为成熟脂肪细胞的作用。这在图9中表示。图9的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例16八丈芹根的乙醇提取组分和乙酸乙酯提取组分对葡萄糖摄入的促进作用按照实施例5的方法测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为由实施例14制备的八丈芹根的乙醇提取组分和八丈芹根的乙酸乙酯提取组分对葡萄糖摄入的促进作用的评价，或作为对类胰岛素作用的评价。
即，向各孔中添加八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液或八丈芹根的乙酸乙酯提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度分别为0.1％、0.05％，以这些组作为样品。以未添加样品的组作为阴性对照，以添加终浓度为1μg/mL的胰岛素的组作为阳性对照。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照比较，各浓度的八丈芹根的乙醇提取组分和八丈芹根的乙酸乙酯提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明八丈芹根的乙醇提取组分和八丈芹根的乙酸乙酯提取组分具有促进葡萄糖摄入的活性。其在图10表示。图10中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例17八丈芹叶提取组分对葡萄糖摄入的促进作用按照实施例5的方法测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为由实施例6制备的八丈芹叶的乙醇提取组分和八丈芹叶的乙酸乙酯提取组分对葡萄糖摄入的促进作用的评价，或作为对类胰岛素作用的评价。
即，向各孔中添加八丈芹叶的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液或八丈芹叶的乙酸乙酯提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度分别为0.2％、0.1％，以这些组作为样品。以未添加样品的组作为阴性对照，以添加终浓度为1μg/mL的胰岛素的组作为阳性对照。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照比较，各浓度的八丈芹叶的乙醇提取组分和八丈芹叶的乙酸乙酯提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明八丈芹叶的乙醇提取组分和八丈芹叶的乙酸乙酯提取组分具有促进葡萄糖摄入的活性。其在图11表示。图11中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例18八丈芹根提取物分级级分对葡萄糖摄入的促进作用按照实施例5的方法测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为由实施例2制备的八丈芹根提取组分的各级分对葡萄糖摄入的促进作用的评价，或作为对类胰岛素作用的评价。
即，使用终浓度为0.03mg/mL的硅胶柱分级级分1、终浓度为0.013mg/mL的硅胶柱分级级分2、终浓度为0.0077mg/mL的硅胶柱分级级分3或终浓度为0.0096mg/mL的硅胶柱分级级分4作为样品。以未添加样品的组作为阴性对照，以添加终浓度为1μg/mL的胰岛素的组作为阳性对照。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照比较，八丈芹根提取组分的各级分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明八丈芹根提取组分的硅胶柱分级级分1、2、3、4均具有促进葡萄糖摄入的活性。其在图12表示。图12中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例19松胞菌素B抑制八丈芹根乙醇提取组分对葡萄糖摄入的促进作用对于葡萄糖转运蛋白抑制剂——松胞菌素B是否抑制实施例16所示的八丈芹根乙醇提取组分对葡萄糖摄入的促进作用进行试验，按照实施例5的方法，对于当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入时的松胞菌素B的影响进行试验。
即，以添加了终浓度为0.1％的八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液的组作为样品。以未添加样品的组作为阴性对照，以添加终浓度为1μg/mL的胰岛素的组作为阳性对照。在各组中，在与设定胰岛素添加组相同的时期设定终浓度40μM的松胞菌素B(nacalai-tesque公司制、10435-81)的添加组。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照比较，八丈芹根的乙醇提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入，但各组因添加松胞菌素B而使2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入几乎完全受到抑制。即表明八丈芹根的乙醇提取组分促进葡萄糖摄入的活性与胰岛素同样，是经由葡萄糖转运蛋白的。这在图13表示。图13中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例20八丈芹根的乙醇提取组分和胰岛素对葡萄糖摄入的协同促进作用按照实施例5的方法的一部分，测定当样品刺激成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量，以此作为由实施例14制备的八丈芹根的乙醇提取组分和低浓度胰岛素对葡萄糖摄入的协同促进作用的评价。
成熟脂肪细胞的制备按照实施例5-(1)的方法进行。
培养结束后，去掉培养基，用含有0.1％(w/v)牛血清白蛋白(SIGMA-ALDRICH公司制，A8022)的Dulbecco氏改良eagle氏培养基洗涤细胞2次，然后添加1mL终浓度0.02％的含有八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液的相同培养基，在5％二氧化碳存在下，在37℃培养过夜。以不含八丈芹根的乙醇提取组分的组作为阴性对照。培养过夜后，用赫佩斯缓冲盐溶液(140mM NaCl、5mM KCl、2.5mM MgSO4、1mM CaCl2、20mM赫佩斯-Na(pH7.4))洗涤细胞2次，添加0.9mL含有八丈芹根的乙醇提取组分的相同缓冲液，使终浓度分别为0.02％，37℃培养45分钟。接着，添加胰岛素，使终浓度为0.001μg/mL，再培养30分钟。此时，在未添加八丈芹根的乙醇提取组分的孔中添加胰岛素，使终浓度为0.001μg/mL，以此作为对照。另外，以未添加样品的组作为阴性对照。之后，与实施例5-(2)的方法同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，与阴性对照相比较，八丈芹根的乙醇提取组分添加组与胰岛素添加组同样，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入，但同时添加了胰岛素的组比胰岛素单独添加组和八丈芹根的乙醇提取组分单独添加组更促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明通过在八丈芹根的乙醇提取组分中同时添加胰岛素，具有协同增大促进葡萄糖摄入活性的作用。这在图14表示。图14中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例21在由八丈芹根提取组分分化诱导的脂肪细胞中，胰岛素刺激对葡萄糖摄入的促进在获得实施例14制备的八丈芹根的乙醇提取组分所分化诱导的脂肪细胞后，验证胰岛素的刺激是否会促进该细胞对葡萄糖的摄入。
即，以添加了八丈芹根的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液的组为样品，其终浓度为0.05％。以添加4μL 5mg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)水溶液的组作为阳性对照。之后，与添加地塞米松相同的时期添加终浓度0.5mM的3-异丁基1-甲基黄嘌呤，除此之外，按照实施例3的方法，进行培养基和样品的更换，得到由八丈芹根的乙醇提取组分或胰岛素分化诱导的成熟脂肪细胞。
接着，按照实施例5的方法，测定当胰岛素刺激所得成熟脂肪细胞时细胞内2-脱氧葡萄糖的摄入量。
即，在各成熟脂肪细胞中，设定未添加胰岛素组或终浓度为1μg/mL的胰岛素添加组。之后同样地测定摄入到细胞中的2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量。
结果可见，由八丈芹根的乙醇提取组分分化诱导的成熟脂肪细胞与由胰岛素分化诱导的成熟脂肪细胞同样，通过胰岛素的刺激，促进了2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的摄入。即表明在由八丈芹根的乙醇提取组分分化诱导的成熟脂肪细胞中，胰岛素刺激可以促进葡萄糖的摄入。这在图15表示。图15中，横轴表示各样品，纵轴表示2-脱氧-[1，2-3H(N)]-葡萄糖的量(dpm)。
实施例22八丈芹茎叶提取组分的制备向2g八丈芹茎叶的干燥粉末中加入40mL乙醇，在室温下提取30分钟，离心分离提取液和残余物。接着对残余物用30mL相同的溶剂重复2次提取操作。收集所得提取液，用旋转蒸发器浓缩。最终，溶解于1mL二甲基亚砜中，得到八丈芹茎叶的乙醇提取组分。
实施例23八丈芹茎叶提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用按照实施例3的方法测定由实施例22制备的八丈芹茎叶的乙醇提取组分的向脂肪细胞的分化诱导作用(类胰岛素活性)。
即，向各孔中添加八丈芹茎叶的乙醇提取组分的二甲基亚砜溶液，使终浓度为0.2、0.066、0.022％，以这些组作为样品。以添加4μL5mg/mL胰岛素(TAKARA BIO公司制)水溶液的组作为阳性对照，以添加二甲基亚砜的组作为阴性对照。之后与实施例3的方法同样地进行培养基和样品的更换，添加样品7天后，测定细胞中的甘油三酯的生物合成量。
结果可见，各浓度的八丈芹茎叶的乙醇提取组分添加组诱导了甘油三酯的生物合成。即表明，八丈芹茎叶的乙醇提取组分有分化诱导为成熟脂肪细胞的作用。这在图16中表示。图16的横轴表示各样品，纵轴表示甘油三酯的生物合成量(μg/mL)。
实施例24八丈芹根部的乙醇提取组分的制备向200g八丈芹根部的干燥粉末中加入1升乙醇，在室温下提取30分钟，抽滤，然后分离为乙醇提取液和残余物。接着对残余物用1升相同的溶剂重复1次提取操作。收集所得提取液，用旋转蒸发器浓缩。将所得浓缩物溶解于100mL橄榄油中，制成八丈芹根部的乙醇提取组分。
实施例25来自八丈芹黄色汁液的样品的制备切割八丈芹茎部，由切割断面收集黄色汁液。将所得汁液过滤，然后冷冻干燥，得到2g干燥粉末。向其中加入橄榄油，使其为10mL，制成来自八丈芹黄色汁液的样品。
实施例26来自八丈芹的处理物对糖尿病改善的效果用II型糖尿病模型小鼠，对实施例24所得八丈芹根部的乙醇提取组分和实施例25所得来自八丈芹黄色汁液的样品的病状改善效果进行研究。将雌性11周龄的KK-Ay小鼠(日本CLEA公司制)以5只为一组进行试验。将悬浮、溶解于橄榄油中的各种样品以5mL/kg每天一次连续强制口服给予。同样地，将橄榄油以5mL/kg给予对照组。给予开始前和给予第7天，由小鼠尾静脉采血，通过简易血糖测定系统アキユチェクコンパクト(Roche Diagnostics公司制)测定血糖值。表明通过给予八丈芹根部的乙醇提取组分和来自八丈芹黄色汁液的样品，血糖值显著降低。另外。实验期间，体重和常规症状未见变化。
产业实用性本发明提供与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗或预防用的药物、食品、饮料或饲料，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。该药物作为糖尿病或肥胖症等与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗药物或预防药物有效。另外，该食品或饮料通过作为日常饮料食品摄取，可改善与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病等症状等。因此，含有来自伞形科植物的处理物的功能性饮料食品通过其类胰岛素作用，对维持生物体的内稳态有用。本发明还提供含有来自伞形科植物的处理物的类胰岛素作用剂，该类胰岛素作用剂对于胰岛素的功能研究、与胰岛素相关的疾病的药物筛选有用。本发明也提供含有来自伞形科植物的处理物的细胞摄入葡萄糖促进剂，该葡萄糖摄入促进剂对于在治疗或预防中需要促进细胞摄入葡萄糖作用的疾病的治疗或预防，该疾病的治疗或预防用食品、饮料或饲料的制造，需要促进葡萄糖摄入作用的疾病药物的筛选有用。本发明也提供含有来自伞形科植物的处理物的向脂肪细胞的分化诱导剂，该分化诱导剂对于在治疗或预防中需要分化诱导为脂肪细胞作用的疾病的治疗或预防，该疾病的治疗或预防用食品、饮料或饲料的制造，需要该分化诱导作用的疾病药物的筛选有用。
权利要求
1.与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗药物或预防药物，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
2.权利要求1的治疗药物或预防药物，其中伞形科植物是八丈芹、芹菜或欧芹。
3.类胰岛素作用剂，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
4.权利要求3的类胰岛素作用剂，其中伞形科植物是八丈芹、芹菜或欧芹。
5.与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗或预防用的食品、饮料或饲料，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
6.权利要求5的食品、饮料或饲料，其中伞形科植物是八丈芹、芹菜或欧芹。
7.细胞摄入葡萄糖促进剂，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
8.权利要求7的葡萄糖摄入促进剂，其中伞形科植物是八丈芹、芹菜或欧芹。
9.向脂肪细胞的分化诱导剂，其特征在于含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分。
10.权利要求9的分化诱导剂，其中伞形科植物是八丈芹、芹菜或欧芹。
全文摘要
本发明涉及含有来自伞形科植物的处理物作为有效成分的与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗药物或预防药物、类胰岛素作用剂、与胰岛素水平或胰岛素应答异常有关的疾病的治疗或预防用的食品、饮料或饲料、细胞摄入葡萄糖促进剂、以及向脂肪细胞的分化诱导剂。
文档编号A61K36/232GK1674926SQ0381950
公开日2005年9月28日 申请日期2003年8月6日 优先权日2002年8月9日
发明者榎龙嗣, 小川衣子, 大野木宏, 杉山胜美, 村木信子, 佐川裕章, 加藤郁之进 申请人:宝生物工程株式会社