治疗缺血性心脏病及充血性心衰竭的人类g蛋白偶联受体及其调节物的制作方法

专利名称：治疗缺血性心脏病及充血性心衰竭的人类g蛋白偶联受体及其调节物的制作方法
技术领域：
本发明涉及鉴别候选化合物是否为孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)调节物的方法。优选人类GPCR。在一些实施方案中，GPCR由心肌细胞内源表达。在一些实施方案中，GPCR与Gi偶联，且降低细胞内cAMP的浓度。在一些实施方案中，GPCR的过度表达会促进心肌细胞的存活。在一些实施方案中，GPCR的过度表达可挽救心肌细胞免于缺氧/复氧诱导的细胞凋亡。在一些实施方案方案中，具有充血性心衰竭的个体体内的GPCR被下调。本发明的激动剂可有效作为治疗缺血性心脏病，包含心肌梗塞、心肌梗塞后重造，以及充血性心衰竭的治疗剂。
背景技术：
A.缺血性心脏病及充血性心衰竭充血性心衰竭(CHF)影响约5百万美国人，且每年有50万个新病例被诊断出来。CHF的临床症状为心脏病使心脏输出量降低，静脉压升高，且伴随着分子异常进而导致心脏衰竭持续恶化以及未成熟心肌细胞(肌细胞)的死亡(源于；心衰竭病理生理学，分子生物，及临床管理(Heart FailurePathophysiology，Molecular Biology，andClinical Management)，Katz，AM，Lippincott Williams and Wilkins，2000)。由于成人心脏中已丧失的细胞无法更替，因此肌细胞(心肌细胞)死亡为心衰竭自然史中的关键因素。因为一旦出现心衰竭症状，5年存活率低于50％，所以任何未考虑加速心肌死亡的分子过程的心衰竭定义皆忽略了这种症状的主要临床特征。因此，许多研究小组近来的研究着重于调节心肌死亡与存活的分子机制及信号路径。细胞培养及小动物已经实验清楚的证实心肌细胞上的G蛋白偶联受体为心脏收缩功能的重要调节物，并且也参与心肌细胞死亡与存活的调节[参见，Adams及Brown的，Oncogene(2001)201626-1634]。然而，目前临床上并没有可用来抑制心肌细胞死亡或直接活化存活路径的药物。最近所公开的小鼠及大鼠的试验结果证实，存活路径的活化[Lee等人，Endocrinology(1999)1404831-40]或心肌细胞死亡路径的抑制剂[Laugwitz等人，Hum Gene Ther(2001)122051-63]可显著提高心脏功能及动物的存活率。因此其清楚显示，相似的治疗策略极可能用于治疗人类的心衰竭。
B.G蛋白偶联受体虽然人体内存在多种受体，但是最多且与治疗有关的受体就是以G偶联受体(GPCR)为代表。据估计存于人类基因组中的3万至4万个基因中，估计约有2％用来编码GPCRs。其内源性配体已被确定的受体，包含GPCRs被称为“已知”受体，然而其内源性配体尚未确定的受体，则被称为“孤儿”受体。
GPCRs是药品开发的重要领域100种已知GPCRs中约有20种，将近60％已开发成处方药剂。例如，在1999年，前100品牌的处方药剂中有下列药物与GPCRs有关(括号内表示该药剂主要治疗的疾病和/或失调症)Claritin(过敏) Prozac(忧郁) Vasotec(高血压)Paxil(忧郁)Zoloft(忧郁) Zyprexa(精神失常)Cozaar(高血压) Imitrex(偏头痛) Zantac(逆流症)Propulsid(逆流症) Risperdal(精神分裂症)Serevent(哮喘)Pepcid(逆流症) Gaster(溃疡) Atrovent(支气管痉挛)Effexor(忧郁) Depakote(癫痫) Cardura(前列腺增生)Allegra(过敏) Lupron(前列腺癌) Zoladex(前列腺癌)
Diprivan(麻木) BuSpar(焦虑) Ventolin(支气管痉挛)Hytrin(高血压) Wellbutrin(忧郁) Zyrtec(鼻炎)Plavix(心肌梗塞/中风) Toprol-XL(高血压)Tenormin(心绞痛)Xalatan(青光眼)Singulair(哮喘) Diovan(高血压)Harnal(前列腺增生)(Med Ad News 1999 Data)GPCRs共享一共同的结构基元，其具有7个介于22至24个疏水性氨基酸的序列，形成7个α螺旋，其中每一螺旋都跨膜(每一跨膜螺旋由编号定义，即跨膜螺旋-1(TM-1)，跨膜螺旋-2(TM-2)等)。跨膜螺旋由细胞膜外部或“胞外”侧上的跨膜螺旋-2与跨膜螺旋-3，跨膜螺旋-4与跨膜螺旋-5，以及跨膜螺旋-6与跨膜螺旋-7之间的氨基酸链连接[其分别称为“胞外”区域1、2和3(EC-1、EC-2与EC-3)]。跨膜螺旋由位于细胞膜内部或“胞内”侧的跨膜螺旋-1与跨膜螺旋-2，跨膜螺旋-3与跨膜螺旋-4，跨膜螺旋-5与跨膜螺旋-6之间的氨基酸链连接(其分别称为“胞内”区域1、2和3(IC-1、IC-2与IC-3))。受体的“羧基”(“C”)末端位于细胞内的胞内空间，而受体的“氨基”(“N”)末端位于细胞外的胞外空间。
一般而言，当配体与受体结合(一般称为受体的“活化”)时，受体的构造会改变，进而促进胞内区与胞内“G蛋白”间的偶联。已有报告GPCRs对G蛋白而言是“混杂的”，亦即GPCR可与一个以上的G蛋白相互作用。参见Kenakin，T.，43生命科学(Life Science)1095(1988)。虽然目前存在其它的G蛋白，Gq，Gs，Gi，Gz及Go是已经得到鉴定的G蛋白。配体活化的GPCR与G蛋白的偶联，启始一信号级联过程(即所谓的“信号传导“)。在正常情况下，信号传导最后将导致细胞活化或细胞抑制。虽然不希望被理论束缚，但是IC-3环与受体羧基末端被认为会与G蛋白相互作用。
在生理条件下，GPCRs以介于两种不同构造“不活化”状态及“活化”状态的平衡形式存在于细胞膜中。不活化状态下的受体无法连接胞内信号传导路径激活导致生物反应的信号传导。将受体的构造改变为活化状态，可使其与传导路径连接(通过G蛋白)并产生生物反应。
受体可由配体或如药剂的化合物稳定在活化状态。近来发现，包含但不限于受体氨基酸序列的修饰可提供有别于配体或药物的手段来促进并稳定受体于活化状态。通过刺激配体与受体的结合效果，这些方法可有效地将受体稳定于活化状态。这种不依赖于配体的稳定方式被称作“组成型受体活化”。
发明概述本发明涉及孤儿GPCR，此处命名为RUP41。RUP41与GPR22(GenBankAccession No.U66581)有关。
RUP41由心肌细胞内源表达。人类RUP41的表达谱可由Affmetrix基因芯片进行确定并通过多组织点印迹及Northern印迹加以验证。由基因组DNA扩增的大鼠同源RUP41的部分编码序列已被鉴定并且公开。大鼠RUP41聚核苷酸序列的这个片段与所公开的小鼠RUP41聚核苷酸序列(XM_137998)具有97％的同一性。本发明公开的RUP41与Gi偶联，引起腺苷酸环化酶的抑制且抑制cAMP的产生。本发明进一步公开了在局部缺血及肥大性心脏的实验模型中，内源性RUP41含量的降低。本发明还公开了RUP41的过量表达可促进心肌细胞的存活。本发明公开的RUP41的特性显示RUP41的激动剂可用于治疗与心肌细胞凋亡有关的心脏病。
本发明的一部分为鉴定候选化合物是否为RUP41的调节物的方法。在其它一些实施方案中，本发明涉及调节RUP41活性的方法，包含RUP41与RUP41的调节物接触的步骤。在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。在一些实施方案中，调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触发生于体外。在一些实施方案中，RUP41调节物在确定调节物是否有效抑制心肌细胞凋亡的方法中，被导入心肌细胞凋亡的细胞培养模型中。在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。在一些实施方案中，调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触发生于体内。在一些实施方案中，RUP41调节物在确定上述调节物是否有效降低与上述缺血性心脏病及心衰竭相关的病理学特征的方法中被施用给小鼠及大鼠缺血性心脏病及心衰竭的手术模型。在其它实施方案中，RUP41调节物在确定上述调节物是否有利于心肌重建或功能的方法中被施用给心肌梗塞试验动物。在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。在一些实施方案中，调节物为激动剂。
RUP41的调节物可用作治疗缺血性心脏病，包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建，及充血性心衰竭的治疗剂。在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。在一些实施方案中，调节物为激动剂。
人RUP41第一对等位基因的聚核苷酸序列及编码的多肽序列提供于序列表中分别为SEQ ID NO1及SEQ ID NO2(SEQ ID NO2多肽编码区对应于SEQ ID NO1的核苷酸237至1538)。人RUP41多肽第二对等位基因的氨基酸序列(GenBankAccession No.AAB63815)，包含在SEQ ID NO2氨基酸425位半胱氨酸取代赖氨酸的单一取代，为SEQ ID NO3(对应的编码序列为GenBankAccession No.AC002381的79,559至80,860核苷酸)。小鼠RUP41的聚核苷酸序列及编码的多肽序列分别为SEQ ID NO4及SEQ ID NO5。包含部分大鼠RUP41编码序列的聚核苷酸序列公开为SEQ ID NO6。
在第一方面，本发明描述了一种鉴定候选化合物是否为RUP41GPCR的调节物的方法，上述受体包含选自下列的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体，其中受体偶联G蛋白，包含步骤如下(a’)将候选化合物与受体接触；(b’)确定受体功能是否被调控，其中受体功能的改变显示候选化合物为上述GPCR的调节物。
本发明也涉及鉴定候选化合物是否为保护心脏的调节物的方法，包含下列步骤(a)将候选化合物与GPCR接触，上述受体包含一种选自下列的多肽(i)SEQ ID NO2的多肽；(ii)SEQ ID NO3的多肽；以及(iii)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体，其中受体偶联G蛋白；以及(b)确定受体功能是否被调控；其中受体功能的改变表示候选化合物为保护心脏的调节物。
在一些实施方案中，上述受体包含选自SEQ ID NO2的氨基酸2至433及SEQ ID NO3的氨基酸2至433的多肽序列。
在一些实施方案中，RUP41 GPCR为内源性的。
RUP41 GPCR的等位基因变体也在本发明的范围中。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41多肽的哺乳动物直向同源物也在本发明的范围中。在一些实施方案中，上述哺乳动物同源基因包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，猪RUP41及非人类灵长动物RUP41。
与SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的变体多肽也在本发明的范围中。尤其是在一些实施方案中，利用局部比对基本查询工具(“BLAST”)评价多肽序列的同源性，上述BLAST在本领域是公知的的技术[参见，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公开在此处引入作为参考]。上述变体多肽可包含一个或多个氨基酸的缺失，插入，及取代。选自SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的组成性活化形式的变体多肽也在本发明的范围中。在一些实施方案中，上述RUP41多肽的组成性活化形式为SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的多肽，其中在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的312位的氨基酸苯丙氨酸被赖氨酸取代。
在一些实施方案中，上述RUP41 GPCR是重组体。
在一些实施方案中，上述RUP41 GPCR包括一个或者多个附加表位。在一些实施方案中，上述附加表位为血凝素(HA)附加表位。在一些实施方案中，上述附加表位为FLAG附加表位。在一些实施方案中，上述附加表位为V5附加表位。提供上述HA，FLAG或者V5附加表位的方法是本领域技术人员公知的(例如，Clontech，Palo Alto，CA和Invitrogen，Carlsbad，CA)。
在一些实施方案中，上述G蛋白调节细胞内cAMP的含量。在一些实施方案中，上述G蛋白为Gi。
在一些实施方案中，通过利用黑色素细胞分析进行上述测定。在一些实施方案中，色素聚集增加。在一些实施方案中，色素扩散减少。
在一些实施方案中，通过测定选自环AMP(cAMP)，环GMP(cGMP)，肌醇三磷酸(IP3)，二酰甘油(DAG)和Ca2+的第二信使的含量进行上述测定。在一些实施方案中，上述第二信使为cAMP。在一些实施方案中，cAMP的含量减少。在一些实施方案中，在用CART-TSH共转染的COS-7细胞中进行上述测定。
在一些实施方案中，用含有上述GPCR的膜进行上述测定。在一些实施方案中，上述膜通过用Brinkman PolytronTM匀浆化处理细胞进行制备。在一些实施方案中，上述膜制备物通过用上述组织匀浆器(polytron)每次10-20秒匀浆化3次进行制备。
在一些实施方案中，通过测定由减少细胞内cAMP的含量介导的活性进行上述测定。在一些实施方案中，上述活性是促进细胞存活。在一些实施方案中，上述细胞是新生大鼠心室肌细胞(NRVM)。在一些实施方案中，上述活性是从低氧/复氧诱导的细胞凋亡拯救细胞。在一些实施方案中上述细胞为NRVM。
在一些实施方案中，上述G蛋白是嵌合Gq(del)Giα亚基并且通过测定IP3或者Ca2+进行上述测定。
在一些实施方案中，通过测定与包含上述GPCR的膜结合的GTPγS进行上述测定。在另外一些实施方案中，上述GTPγS用[35S]标记。
在一些实施方案中，在GPCR的已知配体存在的条件下进行上述接触。在一些实施方案中，上述已知配体是GPCR的激动剂。
在一些实施方案中，上述方法还包括将由候选化合物对受体的调节与由受体与受体的已知调节物接触对受体的第二种调节相比较。
第二方面，本发明描述了RUP41 GPCR的调节物或者根据本发明的第一方面的方法鉴定的保护心脏的调节物。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM，及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物是抗体或者包含至少一个结构域的其衍生物。
在第三方面，本发明描述了调节RUP41 GPCR活性的方法，上述受体包括选自下列的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体，其中受体偶联G蛋白，包含将受体与本发明第二方面的调节物接触的步骤。
在一些实施方案中，上述受体包含选自SEQ ID NO2的2-433位氨基酸以及SEQ ID NO3的2-433位氨基酸的上述多肽片段。
RUP41 GPCR的等位基因变体也在本发明的范围内。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41多肽的哺乳动物直向同源物也在本发明的范围中。在一些实施方案中，上述哺乳动物直向同源物包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，猪RUP41及非人类灵长动物RUP41。
与SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的变体多肽也在本发明的范围中。尤其是在一些实施方案中，利用局部比对基本查询工具(“BLAST”)评价多肽序列的同源性，上述BLAST在本领域是公知的的技术[参见，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公开在此处全部引入作为参考]。上述变体多肽可包含一个或多个氨基酸的缺失，插入，及取代。SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的组成性活化形式的变体多肽也在本发明的范围中。在一些实施方案中，上述RUP41多肽的组成性活化形式为SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的多肽，其中在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的312位氨基酸的苯丙氨酸被赖氨酸取代。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触包含将调节物施用于包含受体的膜。
在一些实施方案中，上述接触包含将调节物施用于包含受体的细胞或者组织。
在一些实施方案中，上述接触包含将调节物施用于包含受体的个体。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
在一些实施方案中，上述方法被用于鉴定调节物是否具有预防或治疗心血管失调的疗效，上述心血管失调包含(a)心脏输出减少；以及(b)静脉压增加；包含下列步骤(a’)将调节物施用于心肌细胞凋亡的细胞培养模型中；以及(b’)确定上述凋亡是否被抑制，其中上述确定通过选自如下的测定进行(i)测量细胞数目；(ii)测量DNA片段；以及(iii)测量核染色体凝聚；其中对抑制凋亡的确定显示调节物具有上述疗效。
在一些实施方案中，利用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染色剂进行核染色体凝聚的测量。
在一些实施方案中，上述方法被用来鉴定调节物是否具有预防或治疗缺血性心脏病的疗效，上述缺血性心脏病包含(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含如下步骤(a’)将上述调节物施用于心肌细胞凋亡的细胞培养模型中；以及(b’)确定上述凋亡是否被抑制，其中上述确定通过如下测定进行(i)测量细胞数目；(ii)测量DNA分裂；以及(iii)测量核染色体凝聚。
在一些实施方案中，用DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)染料测量核染色体凝聚。
在一些实施方案中，上述方法被用来鉴定调节物是否具有预防或治疗心血管失调的疗效，上述心血管失调包含(a)心脏输出减少；以及(b)静脉压增加；包含如下步骤(a’)将调节物施用于或者不施用于心血管失调的小鼠或大鼠模型；以及(b’)确定施用调节物是否具有下列效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)减少心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
在一些实施方案中，上述方法被用来鉴定调节物是否具有预防或治疗缺血性心脏病的疗效，上述缺血性心脏病包含(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含如下步骤
(a’)将调节物施用或者不施用于缺血性心脏病的小鼠或大鼠模型；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)减少心肌细胞凋亡。
其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
在一些实施方案中，上述个体需要预防或治疗心血管失调，上述心血管失调选自(a)心脏输出减少；以及(b)静脉压增加。
在一些实施方案中，上述个体需要预防或治疗缺血性心脏病，选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些实施方案中，上述个体需要改变心血管功能，选自(a)减小心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室体积；以及(d)减少心肌细胞凋亡。
在一些实施方案中，上述个体为遗传倾向有心血管失调的小鼠或大鼠，上述心血管失调选自(a)心脏输出降低；以及(b)静脉压增加；
在一些实施方案中，上述方法被用来鉴定调节物是否具有预防或治疗心血管失调的疗效，上述心血管失调包含(a)降低心脏输出；以及(b)增加静脉压；包含如下步骤(a’)将调节物施用或者不施用于遗传倾向有心血管失调的小鼠或大鼠模型；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)降低心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
在一些实施方案中，上述个体为遗传倾向有缺血性心脏病的小鼠或大鼠，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些实施方案中，上述方法被用来鉴定调节物是否具有预防或治疗缺血性心脏病的疗效，上述缺血性心脏病包含(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含如下步骤(a’)将调节物施用或者不施用于遗传倾向有缺血性心脏病的上述小鼠或大鼠；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；
(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)降低心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
第四方面，本发明描述了需要改变心血管功能的个体体内改变上述功能的方法，包含将第二方面上述的治疗有效量调节物与RUP41GPCR接触，上述受体包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因变体。
在一些实施方案中，上述心肌功能的改变选自(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室体积；以及(d)减少心肌细胞凋亡；在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触通过口服施用上述调节物进行。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第五方面，本发明描述了需要预防或者治疗心血管失调的个体预防或者治疗心血管失调的方法，包含将第二方面上述的治疗有效量调节物与RUP41GPCR接触，上述受体包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因变体。
在一些实施方案中，上述心血管失调选自(a)心脏输出降低；以及(b)静脉压增加。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触通过口服施用上述调节物进行。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第六方面，本发明描述了需要预防或者治疗缺血性心脏病的个体预防或者治疗缺血性心脏病的方法，包含将第二方面上述的治疗有效量调节物与RUP41GPCR接触，上述受体包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；
(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因变体。
在一些实施方案中，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触通过口服施用上述调节物进行。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第七方面，本发明描述了制备组合物的方法，包含鉴定RUP41GPCR的调节物，然后将载体与调节物混合，其中调节物可由第一方面的方法鉴定。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，可由第一方面的方法鉴定的上述调节物由第一方面的方法鉴定。
在一些实施方案中，上述调节物为第二方面的调节物。
第八方面，本发明描述了一种药学及生理学用的组合物，主要由第二方面的调节物组成或者包括第二方面的调节物。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
第九方面，本发明描述了一种改变心血管功能的方法，包含给需要上述改变心血管功能的个体提供或者施用第八方面的上述药学或者生理学可接受的组合物，上述心血管功能的改变选自(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室体积；以及(d)减少心肌细胞凋亡。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第十方面，本发明描述了一种治疗心血管失调的方法，包含给需要上述治疗的个体提供或者施用第八方面的上述药学或者生理学可接受的组合物，上述心血管失调选自(a)心脏输出降低；以及(b)静脉压增加。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第十一方面，本发明描述了一种治疗缺血性心脏病的方法，包含给需要上述治疗的个体提供或者施用第八方面的上述药学或者生理学可接受的组合物，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第十二方面，本发明描述了利用第二方面的调节物制备用于治疗个体心血管失调的药物的方法。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触通过口服施用上述调节物进行。
在一些实施方案中，上述心血管失调选自(a)心脏输出降低；以及(b)静脉压增加。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第十三方面，本发明描述了利用第二方面的调节物制备用于治疗个体缺血性心脏病的药物的方法。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，上述调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
在一些实施方案中，上述接触通过口服施用上述调节物进行。
在一些实施方案中，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人类灵长动物或人。最好是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第十四方面，本发明描述了制备基因敲除小鼠的方法，其中上述基因敲除小鼠有患心血管失调的倾向，上述心血管失调选自(a)降低心脏输出；以及(b)增加静脉压；包含基因敲除编码SEQ ID NO5多肽的基因的步骤。
在一些实施方案中，上述基因敲除为心肌选择性的。
第十五方面，本发明描述了制备基因敲除小鼠的方法，其中上述基因敲除小鼠有患缺血性心脏病的倾向，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；及(c)充血性心衰竭；包含基因敲除编码SEQ ID NO5多肽的基因的步骤。
在一些实施方案中，上述基因敲除为心肌选择性的。
第十六方面，本发明描述了第十四或者第十五方面的基因敲除小鼠。
第十七方面，本发明描述了利用第十六方面的基因敲除小鼠鉴定候选化合物是否具有预防或治疗心血管失调的疗效，上述心血管失调包含(a)降低心脏输出；以及(b)增加静脉压；包含如下步骤(a’)将化合物施用或者不施用小鼠；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)减少心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
第十八方面，本发明描述了利用第十六方面的基因敲除小鼠鉴定候选化合物是否具有预防或者治疗缺血性心脏病的疗效，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
包含如下步骤(a’)将化合物施用或者不施用于小鼠；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及
(iv)降低心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。第十九方面，本发明描述了制备基因敲除大鼠的方法，其中上述基因敲除大鼠倾向有心脏失调，选自(a)降低心脏输出；以及(b)增加静脉压；包含基因敲除在高度严格条件下与SEQ ID NO6的多核苷酸杂交的基因的步骤。
在一些实施方案中，上述基因敲除为心肌选择性的。
第二十方面，本发明描述了制备基因敲除大鼠的方法，其中上述基因敲除大鼠有患缺血性心脏病的倾向，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；及(c)充血性心衰竭；包含基因敲除在高度严格条件下与SEQ ID NO6的多核苷酸杂交的基因的步骤。
在一些实施方案中，上述基因敲除为心肌选择性的。
第二十一方面，本发明描述了第十九或者第二十方面的基因敲除大鼠。
第二十二方面，本发明描述了利用第二十一方面的基因敲除大鼠鉴定候选化合物是否具有预防或治疗心血管失调的疗效，上述心血管失调包含(a)降低心脏输出；以及(b)增加静脉压；包含如下步骤
(a’)将化合物施用或者不施用于大鼠；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)减少心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
第二十三方面，本发明描述了利用第二十一方面的基因敲除大鼠鉴定候选化合物是否具有预防或者治疗缺血性心脏病的疗效，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
包含如下步骤(a’)将化合物施用或者不施用于大鼠；以及(b’)确定施用调节物是否具有选自如下的效果(i)降低心脏肥大；(ii)增加心脏射血量；(iii)降低心室体积；以及(iv)降低心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示上述调节物具有上述疗效。
第二十四方面，本发明描述了分离的大鼠RUP41多核苷酸，选自(a)包含紧邻跨越SEQ ID NO6的至少75核苷酸的多核苷酸；(b)包含紧邻跨越SEQ ID NO6的至少150核苷酸的多核苷酸；(c)包含紧邻跨越SEQ ID NO6的至少250核苷酸的多核苷酸；(d)包含紧邻跨越SEQ ID NO6的至少350核苷酸的多核苷酸；及
(e)包含紧邻跨越SEQ ID NO6的至少500核苷酸的多核苷酸；在一些实施方案中，紧邻跨越不包含SEQ ID NO6的第514位核苷酸。
在一些实施方案中，上述分离的大鼠RUP41多核苷酸包含，编码与人类SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的RUP41 GPCR直向同源的内源性大鼠RUP41 GPCR的核苷酸序列，主要由其组成，或者由其组成。
与上述(a)到(e)任一项的RUP41多核苷酸具有至少60％，70％，80％，85％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的变体多核苷酸也在本发明的范围内。在一些实施方案中，利用局部比对基本查询工具(“BLAST”)评价多核苷酸序列的同源性，上述BLAST在本领域是公知的的技术[参见，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J Mol Biol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公开在此处全部引入作为参考]。上述变体多核苷酸可包含一个或多个核苷酸的缺失，插入，及取代。一个进一步的实施方案中，本发明描述了上述分离的多核苷酸的互补多核苷酸。
第二十五方面，发明描述了一种重组载体，上述载体包含第二十四方面的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，上述重组载体为表达载体。在一些实施方案中，上述表达载体是真核表达载体。适合的表达载体对于本领域技术人员而言是很显而易见的。
在一些实施方案中，上述重组载体被用于瞬间或者稳定转染的方法中。在一些实施方案中，上述重组载体被用于感染方法中。
在一些实施方案中，上述重组载体是用于使RUP41基因失活方法中的靶载体。
在一些实施方案中，上述重组载体是被分离的载体。
第二十六方面，发明描述了包含第二十五方面的重组载体的原核或者真核宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为原核的，且用上述重组载体稳定转化。在一些实施方案中，宿主细胞为真核的，且用上述重组载体瞬间转化。在其它一些实施方案中，上述宿主细胞为真核的，且用上述重组载体稳定转移。
在一些实施方案中，宿主细胞为真核细胞，优选为哺乳动物细胞，且更优选地选自293，293T，CHO及COS-7细胞。在一些实施方案中，宿主细胞为真核细胞，更优选地为黑色素细胞。其它适合的宿主细胞对本领域技术人员而言是显而易见的。
在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物胚胎干细胞，或胚胎干细胞细胞，且上述重组载体被用于使RUP41基因失活的方法中。在一些实施方案中，宿主细胞为哺乳动物胚胎体细胞，且上述重组载体被用于使RUP41基因失活的方法中。
其它实施方案包含一种原核或真核宿主细胞与第二十四观点多肽再结合。
在一些实施方案中，重组载体为被分离的。
第二十七方面，本发明描述了包含组成性活性G蛋白偶联受体和G蛋白的GPCR融合蛋白构建物，上述受体包含选自如下的RUP40多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；
或其片段或者变体。
在一些实施方案中，上述受体包含选自SEQ ID NO2的氨基酸2至433及SEQ ID NO3的氨基酸2至433的多肽序列。
RUP41 GPCR的等位基因变体也在本发明的范围内。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41多肽的哺乳直向同源物也在本发明考虑的范围内。在一些实施方案中，上述哺乳动物直向同源物包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，猪RUP41及非人类灵长类动物RUP41。
与SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的变体多肽也在本发明考虑的范围内。尤其是在一些实施方案中，利用局部比对基本查询工具(“BLAST”)评价多肽序列的同源性，上述BLAST在本领域是公知的技术[参见，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公开在此处全部引入作为参考]。上述变体多肽可包含一个或多个氨基酸的缺失，插入，及取代。SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的组成性活化形式的变体多肽也在本发明考虑的范围内。第二十八方面，本发明描述了鉴定候选化合物是否为RUP 41 GPCR配体的方法，上述受体包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或者变体，包含如下步骤(a’)在上述候选化合物存在或不存在下将上述受体与任选标记的已知接触；(b’)确定已知上述已知配体与受体间的复合物；以及(c’)确定在候选化合物存在的条件下上述复合物是否比不存在候选化合物的条件下形成的少；其中确定显示候选化合物为上述受体的配体。
在一些实施方案中，上述受体包含选自SEQ ID NO2的氨基酸2至433及SEQ ID NO3的氨基酸2至433的上述多肽片段。
RUP41 GPCR的等位基因变体也在本发明考虑的范围中。
SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41多肽的哺乳动物直向同源物也在本发明考虑的范围内。在一些实施方案中，上述哺乳动物直向同源物包含小鼠RUP41，大鼠RUP41，猪RUP41及非人类灵长类动物RUP41。
与SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽具有至少90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％同一性的变体多肽也在本发明考虑的范围内。尤其是在一些实施方案中，利用局部比对基本查询工具(“BLAST”)评价多肽序列的同源性，上述BLAST在本领域是公知的技术[参见，如Karlin及Altschul，Proc Natl Acad Sci USA(1990)872264-8；Altschul等人，J MolBiol(1990)215403-410；Altschul等人，Nature Genetics(1993)3266-272；及Altschul等人，Nucleic Acids Res(1997)253389-3402；其公开在此处全部引入作为参考]。上述变体多肽可包含一个或多个氨基酸的缺失，插入，及取代。SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，或SEQ ID NO5的RUP41多肽的组成性活化形式的变体多肽也在本发明考虑的范围内。在一些实施方案中，RUP41多肽的组成性活化形式为SEQ ID NO2或SEQ IDNO3的多肽，其中在SEQ ID NO2或SEQ ID NO3氨基酸312位的苯丙氨酸被赖氨酸取代。
在一些实施方案中，受体的上述已知配体为第二方面的调节物。
在一些实施方案中，上述已知的配体包含选自如下的标记(a)放射性同位素；(b)酶；以及(c)萤光物质。
在一些优选的实施方案中，上述标记为放射性同位素。在一些实施方案中，上述放射性同位素为3H。
第二十九方面，本发明描述了放射显影的方法，包含给需要上述放射显影的个体提供或施用放射性标记的化合物，其中上述化合物选自第二方面的调节物以及第二十八方面的配体。
在一些实施方案中，上述个体为哺乳类动物。在一些实施方案中，上述哺乳动物为马，牛，羊，猪，猫，狗，兔子，小鼠，大鼠，非人灵长类动物或人。更优选是小鼠，大鼠或人。最优选是人。
第三十方面，本发明描述了人类RUP41 GPCR的非人类转基因哺乳动物。在一些实施方案中，上述非人类哺乳动物为小鼠，大鼠或猪。
在一些实施方案中，上述人类RUP41 GPCR包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的多肽，其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被赖氨酸取代；(c)SEQ ID NO3的多肽；以及(d)SEQ ID NO3的多肽，其中在SEQ ID NO3的312位上的苯丙氨酸被赖氨酸取代。
RUP41 GPCR的等位基因变体也在本发明考虑的范围内。
在一些实施方案中，上述人类RUP41的转基因表达是心肌细胞选择性的。
第三十一方面，本发明使用第三十方面的转基因非人类哺乳动物鉴定本发明的化合物是否具有保护心脏的疗效。
在一些实施方案中，上述非人类哺乳动物为小鼠，大鼠或猪。
上述化合物可通过下述方法评价保护心脏的疗效将上述化合物施用于上述转基因非人类哺乳动物并确定上述施用是否引起实施例18的体内大鼠模型或者其小鼠或者猪类似物的体内模型相对于只施用介质的上述转基因非人类哺乳动物IS/AAR的降低。
在一些实施方案中，上述化合物可以通过将上述化合物施用于上述转基因非人类哺乳动物并且确定上述施用是否引起下述效果评价保护心脏的疗效(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室体积；以及(d)减少心肌细胞凋亡；其中上述效果的确定显示化合物具有上述疗效。
在一些实施方案中，本发明的上述化合物为第二方面的调节物。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，上述调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。在一些实施方案中，本发明的上述化合物是第三十方面的配体。
第三十二方面，本发明描述了制备RUP41 GPCR的调节物的方法，包含如下步骤(a)鉴定权利要求1或2的方法的上述调节物；以及(b)合成(a)中鉴定的调节物。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，上述调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
第三十三方面，本发明描述了用于改变心血管功能的第二方面的调节物。
在一些实施方案中，心血管功能的上述改变选自(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室体积；以及(d)减少心肌细胞凋亡。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，上述调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
第三十四方面，本发明描述了第二方面的调节物用于预防或治疗心血管失调。
在一些实施方案中，上述心血管失调选自(a)降低心脏输出；以及(b)增加静脉压。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，上述调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
第三十五方面，本发明描述了第二方面的调节物用于预防或治疗缺血性心脏病。
在一些实施方案中，上述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
在一些实施方案中，上述调节物选自激动剂，部分激动剂，反激动剂及拮抗剂。
在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至100μM之间值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，10μM，20μM，30μM，40μM，50μM，60μM，70μM，80μM，90μM，及100μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM至10μM之间值的SEQID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。在一些实施方案中，上述调节物具有小于1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM及10μM值的SEQ ID NO2或SEQ ID NO3的人类RUP41 GPCR上的EC50或IC50。
在一些实施方案中，上述调节物降低了细胞内cAMP的含量。
在一些实施方案中，上述调节物为选择性的。
在一些实施方案中，上述调节物是口服可生物利用的。
在一些实施方案中，上述调节物为激动剂。
申请人保留排除本发明任一实施方案的任一一种或者多种候选化合物的权利。申请人也保留排除本发明任一实施方案的任一一种或者多种调节物的权利。申请人还保留排除本发明任一实施方案的任一多核苷酸或者多肽的权利。申请人另外保留排除本发明任一实施方案的任一缺血性心脏病或任一心血管失调或心肌细胞凋亡失调的权利。


图1仅为说明性而非限制性的，图1显示了针对“靶受体”的候选化合物的初级扫描结果，所述“靶受体”为内源性组成性活化Gs偶联的GPCR的Gsα融合蛋白。“化合物A”的结果提供于A2道。“化合物B”的结果提供于G9道。
2A至C图.A.使用常规高密度寡核苷酸微阵列在人组织样品上进行微阵列分析，所述常规高密度寡核苷酸微阵列包含监控RUP41基因表达水平的探针。柱状图显示了二次测量的每一个组织图谱中RUP41的相对表达水平(平均差分)及标准误差。每一组织名以垂直文字排列的方式显示在每个柱上。
柱状图的检查显示人大脑和心脏中RUP41的表达。
B.人类多组织点印迹显示在成人及胎儿心脏组织中RUP41 mRNA的高水平表达。RUP41 mRNA表达也可以在不同局部大脑组织中检测出。
C.人类多组织Northern印迹显示在心脏及大脑中RUP41 mRNA的高水平表达。
图3.原位杂交显示RUP41在成年大鼠心脏中的广泛心肌表达。反义RUP41放射性标记的探针检测到RUP41在所有心室中的表达。反义对照(GAPDH)及心房特异性(心钠素，ANF)探针被用于其它部分以显示心脏部分探针标记的特异性。
图4A至B。A.RT-PCR显示了RUP41转录本在不含血清的条件下保持24小时的新生大鼠心室心肌(NRVMs)中的表达。在向培养基中加入脱羟肾上腺素(PE)或小牛血清(NCS)后RUP41转录本水平显著下降并且与肥大表现型相关。G3PDH PCR产物显示用作PCR反应的相同模板水平以及凝胶上样量的一致性。
B.用包括脱羟肾上腺素(PE)，佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)，前列腺素F2α(PGF2α)的肥大剂以及小牛血清(NCS)处理24小时后Northern印迹显示NRVMs中RUP41 mRNA表达水平的降低。相应于所有肥大刺激物心肌肥大的遗传标志心钠素(ANF)被上调。28S rRNA亚甲基蓝染色显示RNA的完整性以及相等的上样量。
图5.上图.在超负荷压力诱导的心脏肥大的体内小鼠模型中RUP41mRNA被下调。对从进行横向主动脉缩窄(TAC)或者假手术(SHAM)7天的小鼠分离的总RNA进行Northern印迹分析。ANF的增加表达显示TAC心脏中形成天然肥大应答。28S rRNA亚甲基蓝染色显示RNA的完整性以及相等的上样量。
底部.经密度测量法分析RUP41信号并且标准化到28S rRNA信号。
*6个假手术以及6个TAC样品的方差统计分析显示RUP41mRNA的明显减少，P＜0.00005。
图6.Northern印迹显示从经受缺氧6小时的NRVMs分离的总RNA中RUP41 mRNA的水平降低。缺氧后(H6/R24)复氧24小时后RUP41 mRNA水平恢复到对照(正常氧)水平。c-fos表达(缺氧-6)水平的增加显示肌细胞对低含氧环境的胁迫应答。28S rRNA亚甲基蓝染色显示RNA的完整性以及相等的上样量。
图7A-B.A.对从人心脏分离的总RNA进行RT-PCR。充血性心力衰竭(CHF)的病人RNA与正常心脏功能(正常的)的病人RNA相比RUP41转录水平下降。向每一PCR反应中添加人GAPDH引物作为模板浓度以及上样量一致性的内部对照。
B.*方差统计分析显示CHF病人与正常人相比RUP41转录本明显减少，p＜0.05。心肌梗塞(MI)病人RUP41转录本水平与正常心脏没有差别。
图8.上图.COS-7细胞用pCMV-HARUP41(HA-RUP41)或pCMV-HA主链(CMV)以及组成型活性的Gs-偶联的促甲状腺激素受体(pCMV-CART-TSHR)共-转染。[HARUP41相应于血球凝集素(HA)-标记的RUP41。]此外，共-转染CRE-荧光素酶报告基因构建体以确定在百日咳毒素(PTX)存在或者不存在的条件下cAMP活化途径的活性。共-表达CART-TSHR以及HARUP41的细胞中荧光素酶报道基因的活性比共-表达CART-TSHR以及pCMV-HA对照的细胞中的活性小，显示RUP41与Gi的偶联。用PTX处理由RUP41抑制cAMP的减少证明Gi与这种受体的偶联。
底部.在百日咳毒素(PTX)存在或者缺乏的条件下用pCMV-HA(CMV)or pCMV-HARUP41(RUP41)构建体转染COS-7细胞。毛喉素(1μM)刺激的cAMP水平的增加由RUP41的表达抑制。用PTX处理由RUP41抑制cAMP的减少证明Gi与这种受体的偶联。
图9A-B.A.用各种感染复数的编码RUP41的重组腺病毒(AdRUP41)处理NRVMs，所述感染复数由每细胞噬斑形成单位(PFU)中的病毒效价定义。腺病毒感染后24小时，分离总RNA并且使用Northern印迹分析确定病毒表达RUP41的水平。在50PFU/细胞，就可检测到RUP41的表达，但是高水平表达显示在100PFU/细胞。
B.100PFU/细胞感染AdRUP41 48小时的NRVMs显示无血清培养基中细胞存活率的增加。用结合鬼笔环肽以及Hoechst 33342的德克萨斯红共-染色NRVMs。
图10.寡核小体DNA断裂(也称为形成序列梯)显示缺氧(8小时)后复氧(24小时)刺激了感染100PFU/细胞对照(AdGFP)腺病毒的NRVMs(H8/N24)细胞凋亡的增加。然而，腺病毒介导的RUP41(100PFU/细胞)的超量表达降低了由除去血清(normox)以及缺氧后复氧(H8/N24)诱导的DNA断裂的水平。
发明详述关于受体的科学文献已经采用了大量涉及对受体具有各种作用的配体。为了清楚和一致的目的，下列定义将贯穿本专利文献使用。当这些术语的定义与其它定义冲突时，应参照下列定义激动剂是指当其结合于受体时激活胞内应答的物质(例如，配体，候选化合物)。在一些实施方案中，激动剂是之前不知当其与受体结合时激活胞内应答(例如，增强GTPγS结合于薄膜或降低胞内cAMP的水平)的物质。在一些实施方案中，激动剂是之前不知当其与受体结合时抑制分解的那些物质。
别构调节物是指影响受体的功能活性但不抑制内源配体与受体结合的物质(例如，配体，侯选化合物)。别构调节物包括反激动剂，部分激动剂以及拮抗剂。
本发明使用的氨基酸缩写列举在表格A中表格A


拮抗剂是指与激动剂竞争性结合于受体相同的位点但不激活胞内应答，并且可以因此抑制由激动剂引起的胞内应答的物质(例如，配体，候选化合物)。在激动剂存在的条件下拮抗剂不减少基线胞内应答。在一些实施方案中，拮抗剂是之前不知当结合于受体时能与拮抗剂竞争抑制细胞应答的那些物质，例如其中的细胞应答是指GTPγS结合于膜或降低胞内cAMP的水平。
这里的抗体是指包括单克隆抗体以及多克隆抗体。抗体进一步包括IgG，IgA，IgD，IgE以及IgM。抗体包括含有单链整个抗体的整个抗体，以及其抗原结合片段，包括Fab，Fab′，F(ab)2以及F(ab′)2。抗体可以是任何动物来源的抗体。优选地抗体是人，鼠科动物，兔，山羊，豚鼠，仓鼠，骆驼，驴，绵羊，马或小鸡。优选地，抗体具有解离常数或者Kd值小于5×10-6M，10-6M，5×10-7M，10-7M，5×10-8M，10-8M，5×10-9M，10-9M，5×10-10M，10-10M，5×10-11M，10-11M，5×10-12M，10-12M，5×10-13M，10-13M，5×10-14M，10-14M，5×10-15M以及10-15的结合亲和性。本发明的抗体可以通过本领域已知的任一合适方法进行制备。
细胞凋亡(又名细胞程序死亡)是指一种细胞死亡形式，其中细胞通过细胞内操纵的信号转导系统诱导细胞程序性死亡。相反，坏死是指细胞被外源因素杀死。
候选化合物是指扫描技术可使用的分子(例如而非限制性的为一种化合物)。优选地，术语“候选化合物”不包括公众已知作为受体的反激动剂，激动剂或拮抗剂的化合物；更优选地，不包括先前已被确定对至少一种哺乳动物具有疗效的化合物；并且最优选地，不包括先前已被确定对人类具有治疗效用的化合物。
心脏射血部分是指单次收缩从左心室排射出的血液部分。例如，如果100ml血液存在于左心室中并且收缩后喷出90ml，那么心脏射血部分是90％。
心脏肥大是指心肌增大。心脏肥大通常而不是总是对增加施加于心肌上的血液动力学负载的适应反应。
密码子是指一组三个核苷酸(或核苷酸的等效物)通常包括与磷酸基结合的核苷(腺嘌呤核苷(A)，鸟嘌呤核苷(G)，胞嘧啶核苷(C)，尿嘧啶核苷(U)以及胸腺嘧啶(T)，并且当其被翻译时编码氨基酸。
组合物是指包括至少一个组分的物质；“药用组合物”是组合物的实例。
化合物的效果是指测定的化合物抑制或刺激受体功能的能力；即，激活/抑制信号转导途径和受体结合亲合性对比。检测化合物效果的示范性方式公开于本专利文献的实施例部分。
这里的包括，基本上由...组成以及由...组成根据它们的标准含义进行定义。M.P.E.P.中显示的定义控制本领域的定义并且统制FederalCircuit判例法显示的定义控制M.P.E.P中的显示的含义。
充血性心衰竭(CHF)是指心脏失去其有效泵出血液能力的失调。随着年龄的增长充血性心衰竭会更普通。缺血性心脏病是充血性心衰竭最普遍的原因，占所有病例的60-70％。增加大于12mmHg静脉压是充血性心衰竭的一个主要的Framingham原则，相当于大于25秒循环时间的心输出量的减少。
组成型活性受体是指通过除了通过受体结合其配体或其化学等同物的方式稳定在活性态的受体。组成型活性型受体可以是内源或非-内源的。
组成型激活的受体是指已被修饰从而组成型活化的内源性受体。CART是组成型激活的受体技术的缩写并且在这里当在GPCR前加上前缀时应该被理解为鉴定所述带前缀的GPCR为组成型激活的受体。
组成性受体活化是指在不将受体与其配体或其化学等同物结合的条件下激活受体。
接触或接触是指无论是在体外系统或者体内系统中将至少两部分结合在一起。
降低被用来指可测量量的减少并且使用时与术语“减少”，“减小”，“降低”以及“变少”同义。
超声波心动描记法是指利用声波测定心脏结构以及活动物功能的方法。
内源性是指哺乳动物天然产生的物质。
内源性应被理解为包括所述哺乳动物基因组内表示的基因的变体以及其编码的等位基因多肽变体。相比之下，这里的术语非内源性应该指不是由哺乳动物(例如但不限于人)天然产生的。例如但不限于，不是内源形式组成型活化但是当进行操纵时变成组成型活化形式的受体在这里最优选地是指“非-内源性组成型活化的受体”。这两个术语均可用于描述“体内”以及“体外”系统。例如但不限于在筛选方法中内源或非-内源性受体可以指体外筛选系统。例如但不限于，当哺乳动物的基因组被操作包括非-内源性组成型活化受体时可以通过体内系统筛选侯选化合物。
表达载体在这里被定义为在表达载体的合适宿主细胞重组体中，转录克隆的DNA以及转录的mRNA翻译所需的DNA序列。适当构建的表达载体应该含有宿主细胞中自主复制的复制起点，选择性标记，有限的限制性酶切位点，可以具有高拷贝数的潜能以及活化的启动子。所述待转录的克隆的DNA可操作的连接于所述表达载体内的组成型或条件活化的启动子。例如但不限于，pCMV是表达载体。
本发明上下文公开的G蛋白偶联受体融合蛋白以及GPCR融合蛋白是指包括融合到至少一个G蛋白，最优选地，这种G蛋白的α亚基的内源组成型活化GPCR或非-内源组成型活化GPCR的非-内原性蛋白，G蛋白优选地与和内源孤儿GPCR天然偶联的G蛋白类型相同。例如但不限于，在内源状态，如果G蛋白“Gs蛋白质α”是与GPCR偶联的主要G蛋白，基于特异性GPCR的GPCR融合蛋白将是包括融合Gsα的GPCR的非-内原性蛋白；在一些情况下，如下所列举，非-主要的G蛋白可以融合至GPCR。G蛋白可以直接融合至组成型活化GPCR的C-末端或在二者之间可能有间距。
宿主细胞是指其中能够包含载体的细胞。宿主细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中宿主细胞是真核细胞，优选地哺乳动物细胞，且更优选地选自293，293T，CHO以及COS-7细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是真核细胞，更优选为黑色素细胞。
在这里使用的需要治疗是指由护理者(就人来说例如为医生，护士，护士从业者等；就动物来说为兽医，包括非-人哺乳动物)判断个体或需要或将受益于治疗。这种判断是基于多种护理者专业知识的范围内的因素，但包括个体或动物生病或者将生病的知识，作为可由本发明的化合物治疗的病症。
静脉压增加应该是指由于循环系统变弱所引起的血泊静脉系(静脉)中发展的血压增加。
在这里使用的个体是指任一种动物，包括哺乳动物，优选小鼠，大鼠，其它啮齿类动物，兔子，狗，猫，猪，牛，绵羊，马或灵长类动物，最优选人。
与术语“应答”相关的抑制是指与缺乏化合物的情况下相反在存在化合物的条件下应答减少或受到阻止。
反激动剂是指与内源形式或者组成型活化型受体结合从而降低所观察到的受体基线胞内的应答的物质(例如，配体候选化合物)。
缺血性心脏病应该是指由心组织缺氧引起的失调，其中心脏的肌肉受到影响并且心脏不能适当泵血。缺血性心脏病是美国最常见的心肌病。
分离的是指从原始环境(例如，如果是天然存在的自然环境)取出的物质。例如存在于活动物体内的天然存在的多核苷酸或多肽未经分离但是从自然系统的一些或所有共存物质分离的相同的多核苷酸或DNA或多肽是经分离的。这种多核苷酸可以是载体的一部分和/或这种多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分并且仍然是被分离的因为载体或组合物不是自然环境的一部分。
这里的基因敲除小鼠/RAT包括已经重组体方法操作的小鼠或大鼠因此精选的单个基因已被灭活或以使所有其它的未受影响的基因保留的方式敲除基因。
已知的受体是指特异于该受体的内源性配体已被鉴定的内源性受体。
配体是指特异于天然存在的受体的分子。
在这里使用的术语调节或修饰是指特定活性功能或分子的量，质量或效果的增减。
心肌梗塞是指由于不充分供氧的心肌区域的损伤或坏死。心肌梗塞通常由阻塞一个冠状动脉(给心肌带来血液和氧气的血管)的凝块所引起。凝结阻止血液和氧气到达心脏的那个区域导致那个区域心脏细胞的死亡。非-孤儿受体是指特异于鉴定的配体的内源性天然存在的分子，其中配体与受体的结合激活胞内信号途径。孤儿受体是指该受体的特异性配体尚未被鉴定的或未知的内源性受体。部分激动剂是指当结合于受体时比完整激动剂更小程度/幅度活化胞内应答的物质(例如，配体，候选化合物)。
药物组合物是指包括至少一种活性成分的组合物，其中所述组合物可用于研究哺乳动物(例如但不限于人)的指定效果。本领域技术人员将理解和认识到上述技术适于确定活性成分是否具有基于技术人员需要的所希望的效果。
多核苷酸是指以单链或者双链体形式超过一个核苷酸的RNA，DNA，或RNA/DNA杂交体序列。本发明的多核苷酸可以通过任一已知的方法制备，包括合成的，重组体，离体繁殖或其组合，以及利用本领域已知的任一提纯法。
多肽是指不考虑聚合物长度的氨基酸的聚合物。因此，肽，寡肽和蛋白包括在本发明定义的多肽的范围内。这个术语不特指或排除的表达后修饰。例如，包括共价连接的葡糖基基团，乙酰基，磷酸基脂基等等的多肽清楚地由术语多肽包括。
心肌梗塞后重建.心肌梗塞损失的心肌组织引起心室上持续的过量血液动力学负载。心室肥大建立了一种据此心脏补偿负载增加的原理机制。然而，在血液动力学超负荷面前这种适应于持续心脏性能的能力是有限的并且当长期维持时就变成病态适应。逐渐地，因为扩大的心室逐渐增大并且收缩功能变弱，所以适应的肥大表现型转变为心衰竭。对心脏中心肌梗塞的适应性以及不适应性应答的自然史被称作“重建”。
关于心肌梗塞后重建，有大量关于病理学进展的信息参数(a)如果心脏肥大增加，是有害的；(b)如果心脏肌细胞程序死亡增加，是有害的；(c)如果心脏射血部分减少，是有害的；以及(d)如果心室容积增加，是有害的。
用超声波心动描记法可以进行活动物包括大鼠以及小鼠射血部分，心室扩张的测定。这些参数通常在最初检查。为了正确地确定涉及的致病机制，然而，一般进一步需要处死动物以测定心肌细胞的程序死亡。
引物在这里是指特异性寡核苷酸序列，其互补于靶核苷酸序列并且被用于杂交至靶核苷酸序列。引物用作DNA聚合酶，RNA聚合酶或逆转录酶摧化的核苷酸聚合的起点。
受体功能是指受体的正常操作以接收刺激物并且调节细胞内的功能，包括但不限于通过G-蛋白调节基因转录，调节离子的流入或流出，作用催化反应，和/或调节活性。
减少心输出量是指减少衰竭心脏的泵排量由此减少心室每次收缩注入循环系统(动脉)的血液。
第二信使是指受体活化产生的胞内应答。第二信使可以包括例如肌醇三磷酸(IP3)，甘油二酯(DAG)，环化AMP(cAMP)，环鸟苷酸(cGMP)以及Ca2+。可以测定第二信使来确定受体活化。此外，可以测定第二信使应答以直接鉴定候选化合物，包括例如反激动剂，部分激动剂，激动剂以及拮抗剂。
信噪比是指响应活化，扩增或刺激产生的信号，其中信号超出响应非-活化，非-扩增或非-刺激的背景噪声或基态水平。
跨距是指位于基因，例如目标GPCR的最后一个密码子或者最后一个氨基酸后，但是起始密码子或者目标G蛋白的开始区域之前的翻译的氨基酸的数目。翻译的氨基酸的数目可以是一个，两个，三个，四个等等以及高达十二个。
与术语“应答”相关的刺激是指在存在化合物的条件下与缺乏化合物条件相比应答加强。
受试者是指灵长类动物，包括但不限于人类和狒狒以及宠物诸如狗和猫，实验动物诸如大鼠和小鼠以及家畜诸如马，绵羊以及牛。
本发明使用的治疗有效量是指引起组织，系统，动物，个体或者人生物学或者药物应答的活性化合物或者药剂的量，所述组织，系统，动物，个体或者人正在被研究人员，兽医，医生或者其它临床医生研究，所述生物学或者药物应答包括下列的一种或者多种活性(1)预防疾病；例如预防可能易患疾病，体况或者失调但是还没有经历或者显示所述疾病的病理或者症状的个体的疾病，体况或者失调，(2)抑制疾病；例如抑制正在经历或显示疾病，体况或者失调的病理和/或症状的个体的疾病，体况或失调(即，阻止病理和/或症状的进一步发展)，以及(3)改善疾病；例如改善正在经历或显示疾病，体况或者失调的病理和/或症状的个体的疾病，体况或失调(即，逆转病理和/或症状)。
这里的转基因小鼠/大鼠应该包括通过重组体手段被工程改造携带异体基因，或者转基因，选择作为其自身的部分遗传物质的小鼠或者大鼠。
心室体积是指测量的心脏的左或者右心室内部尺寸。在衰竭的心脏中，心室增大。
A.介绍下列部分的顺序是为了阐述效率而非也不应该被理解为是对本发明的内容或者附属权利要求的限制。
B.筛选候选化合物1.一般的GPCR筛选分析技术当G蛋白受体活化时，其结合G蛋白(例如，Gq，Gs，Gi，Gz，Go)并且激发GTP与G蛋白的结合。然后G蛋白起GTP酶的作用并且缓慢水解GTP到GDP，借此在正常情况下受体失活。然而，活化的受体继续将GDP转化为GTP。不可水解的GTP类似物，[35S]GTPγS，可用于监控与表达活化受体的膜的加强结合。据报道[35S]GTPγS可用于监控在配体缺乏或者存在的条件下G蛋白与膜的偶联。这种监控的一个实例，以及其他公知的以及本领域可获得的实例由Traynor和Nahorski于1995年发表。这种分析系统的一种优选应用是候选化合物的最初初筛，因为所述系统一般可用于所有G蛋白偶联受体而不管是否是与受体的胞内区域互作的特定G蛋白。
2.具体的GPCR筛选分析技术一旦利用“一般的”G蛋白偶联受体分析(即，选择作为激动剂或者反激动剂的化合物的分析)鉴定了候选化合物，在一些实施方案中，优选进行进一步的筛选以证实所述化合物作用于受体位点。例如，通过“一般的”分析鉴定的化合物可能不与受体结合，但是但是可能紧紧“不偶联”于细胞内结构域的G蛋白。
a.Gs，Gz以及Gi.
Gs激活腺苷酸环化酶。另一方面Gi(以及Gz和Go)抑制腺苷酸环化酶。腺苷酸环化酶催化ATP转化到cAMP；因此，偶联Gs蛋白的活化GPCRs与cAMP细胞含量的增加相关。另一方面，偶联Gi(或者Gz，Go)蛋白的活化GPCRs与cAMP细胞内含量的减少相关。通常参见“突触传递的间接机制(Mechanisms of Transmission Synaptic)”，第8章，从神经元到大脑(From Neuron To Brain)(第三版)Nichols，J.G.等编辑，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，检测cAMP的分析可被用于确定候选化合物是否为例如受体的反激动剂(即，这种化合物将减少cAMP的含量)。可以使用本领域测定cAMP的多种方法；在一些实施方案中，优选的方法依赖于使用基于ELISA形式的抗cAMP抗体。可以使用的另一种分析是全细胞第二信使报告物系统分析。基因的启动子启动特定基因编码的蛋白的表达。cAMP通过促进cAMP-应答的DNA结合蛋白或者转录因子(CREB)的结合驱动基因表达，然后所述cAMP-应答DNA结合蛋白或者转录因子(CREB)与启动子在被称作cAMP效应元件的特异性位点结合并且驱动基因的表达。报告系统可被构建为在报告基因前具有包含多个cAMP效应元件的启动子，例如，β-半乳糖苷酶或者荧光素酶报告系统。因此，活化的Gs-结合的受体引起cAMP的聚集然后活化基因以及报告蛋白的表达。然后可以利用标准生物化学分析检测报告蛋白诸如β-半乳糖苷酶或者荧光素酶(Chen等人1995)。
b.Go以及Gq.
Gq以及Go与磷脂酶C的激活有关，其依次水解磷脂PIP2，释放两种胞内信使二酰甘油(DAG)以及肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)。IP3的增加积累与Gq-以及Go-相关受体的激活有关。通常参见“突触传递的间接机制(Mechanisms of Transmission Synaptic)”，第8章，从神经元到大脑(From Neuron To Brain)(第三版)Nichols，J.G.等编辑，Sinauer Associates，Inc.(1992)。检测IP3积累的分析可被用于确定候选化合物是否为例如Gq-或Go-相关受体的反激动剂(即，这种化合物将减少IP3的含量)。Gq-相关受体可以利用AP1报告分析检验，因为Gq-依赖的磷脂酶C引起包含AP1成分的基因的活化；因此，活化的Gq-相关受体将证明这种基因表达的增加，借此其反激动剂将证明这种表达的减少以及激动剂将证明这种表达的增加。可以获得这种检测的市售分析。
3.GPCR融合蛋白通过利用内源，组成性活化的GPCR或者非内源性组成性活化的GPCR用于筛选直接鉴定反激动剂或者激动剂的候选化合物提供了一种有价值的筛选方法，通过定义，受体即使在缺乏结合其上的内源性配体时也是活化的。因此，为了区分，例如在存在候选化合物的条件下非内源性受体以及在缺乏化合物条件下的非内源性受体，为了使这种区分颗粒被理解为这种化合物是反激动剂或者激动剂或者对这种受体没有作用，在一些实施方案中，优选使用可以加强这种分化的方法。在一些实施方案中，优选采用GPCR融合蛋白的方法。
通常，利用上述分析技术一旦确定非内源性GPCR已经被组成性活化，就可以确定与内源性GPCR偶联的主要G蛋白。G蛋白与GPCR的偶联提供了可被评价的信号途径。在一些实施方案中，优选利用哺乳动物表达系统进行筛选，因而期待其中具有内源性G蛋白的系统。因此，根据定义，在这种系统中，非内源性组成性活化的GPCR将连续地发信号。在一些实施方案中，优选地加强这种信号是的在例如受体的反激动剂存在的条件下，当与反激动剂接触时，更可能更容易地，尤其是在筛选过程中区分受体。
GPCR融合蛋白是用来加强与非内源性GPCR偶联的G蛋白的效力。在一些实施方案中，GPCR融合蛋白优选用内源性组成性活性GPCR或者非内源性组成性活化GPCR进行筛选，因为这种方法加强了在这种筛选技术中产生的信号。这对促进显著的“信噪比”是很重要的；这种显著的比值对于筛选本发明公开的候选化合物是优选的。
用于表达GPCR融合蛋白的构建物的构建是在本领域技术人员熟知的范围内。市售的表达载体以及系统提供了各种可以满足研究者特定需求的方法。构建这种GPCR融合蛋白构建物的重要标准包括但不限于GPCR序列以及G蛋白序列都在框架内(优选地，内源GPCR的序列在G蛋白序列的上游)，而且GPCR的终止密码子被缺失或者替换使得GPCR表达后，也可以表达G蛋白。GPCR可以直接连接到G蛋白，或者可以在二者之间具有间隔物残基(优选地，仅仅约12个残基，虽然这个数目可以由本领域技术人员很容易地确定)。为方便起见，优选使用间隔物。在一些实施方案中，优选地偶联至非内源性GPCR的G蛋白在构建GPCR融合蛋白构建物前即被鉴定。因为只有少数G蛋白被鉴定，优选地包括G蛋白序列的构建物(即，通用G蛋白构建物，参见以下的实施例5(a))可用于在其中插入内源GPCR序列；这就给大规模筛选各种具有不同序列的不同内源性GPCRs提供了更高的效率。
如上所述，偶联至Gi，Gz以及Go的活化的GPCRs可以抑制cAMP的形成，使得基于这些类型的GPCRs的分析具有挑战性[即，活化后cAMP信号减弱，使得直接鉴定例如激动剂(将进一步减弱这种信号)具有挑战性]。如本发明下面所公开，已经确定对于这些类型的受体而言，可能建立不是基于GPCR内源性G蛋白的GPCR融合蛋白，以建立基于活环化酶的分析。因此，例如内源性Gi偶联受体可以融合到Gs蛋白，使得融合构建物在表达后，可以“驱动”或者“启动”内源性GPCR与例如Gs偶联而非与“天然的”Gi蛋白偶联，从而建立基于环化酶的分析。因此，对于Gi，Gz以及Go偶联受体而言，在一些实施方案中，当使用GPCR融合蛋白以及所述分析是基于检测腺苷酸环化酶的活性时，优选用Gs(或者激发腺苷酸环化酶形成的同等物G蛋白)构建融合构建物。
表B

相同效果为利用Gq蛋白与Gs，Gi，Gz，或Go蛋白融合的G蛋白融合构建体。在一些实施方案中，优选的融合构建体可以是其中的G蛋白α亚基(“Gαq”)的前六个氨基酸被删除，且在Gαq的C末端后5个氨基酸被目的G蛋白的Gα的相应氨基酸取代。例如，融合构建体可以具有与Gi蛋白融合的Gq(6氨基酸)，产生“Gq/Gi融合构建体”。此融合构建体将促进内源性Gi偶联受体偶联至其非内源性G蛋白，Gq，使得第二信使，例如，三磷酸肌醇或二酰甘油，可以代替cAMP的产生被测量到。
4.靶Gi偶联的GPCR与信号增强剂Gs偶联的GPCR的共转染(基于cAMP的分析)Gi偶联受体已知抑制腺苷酸环化酶，因此，降低cAMP的产量，其使得cAMP水平的评定具有挑战性。在一些实施方案中，测量活化后显示主要偶联Gi的受体活化的cAMP产量降低的有效技术可以通过共转染增强子与连接GPCR的Gi，所述增强子为例如活化后主要与Gs偶联的非内源性组成性活化的受体(如TSHR-A6231；参见以下)。显而易见，活化的Gs偶联受体可基于cAMP产量的增加进行确定。Gi偶联受体的活化引起cAMP产量的降低。因此，共转染技术目的在于方便地利用这些“相对”作用。例如，非内源性组成性活化的Gs偶联受体(“信号增强子”)与单独的表达载体的共转染提供了基线的cAMP信号(即，虽然Gi偶联受体将降低cAMP的量，但是这种“减少”将与由组成性活化的Gs偶联的信号增强子引起的cAMP含量的显著增加相关)。接着带有“靶受体”的信号增强剂与Gi偶联的靶受体的反激动剂的共转染将增加测出的cAMP信号，同时Gi偶联的靶受体的激动剂将减少这种信号。
直接利用这种方法鉴定的候选化合物应该独立地进行评价从而保证这些候选化合物并不靶向信号增强受体(其可以在筛选针对共转移受体之前或之后进行)。
C.药物化学候选化合物本领域已知的任一分子可用来测试其调节(增加或减少)本发明GPCR活性的能力。为了鉴定节活性的化合物，候选化合物可直接提供给表达所述GPCR的细胞。
本发明的实施方案非常适合于筛选调节，例如，抑制、拮抗或刺激受体产量或者活性的化学分子文库。化学文库可以为肽文库，肽模拟物文库文库，化学合成文库，重组体，例如，噬菌体表达文库，以及体外基于翻译的文库，其它非肽合成有机文库等。本发明的实施方案非常适合于筛选含有生物材料的内源性候选化合物，包含但不限制血浆及组织提取物，以及筛选已知具有生化活性的内源性化合物文库。
在一些实施方案中，与通过组合化学技术产生的化合物一起进行候选化合物的直接鉴定，通过组合化学技术制备了用于这种分析的数以千计的化合物。候选化合物可为化学文库的一个成员。所述化学文库可包含任一数目的单独成员，例如几十至几百至几千至几百万合适的化合物，例如，肽，类肽及其它寡化合物(环状或直线)，及基于模板的小分子，例如苯并二氮杂，乙内酰脲，双芳香基，碳环及多环化合物(例如，萘，吩噻嗪，吖啶，类固醇等)，碳水化合物及氨基酸衍生物，二氢吡啶，二苯甲基以及杂环化合物(例如，trizine，吲哚，噻唑烷等)。引用的数目以及列举的化合物类型是说明性的而非限制性的。优选的化合物文库包括低分子量的化合物以及可能的治疗剂。
示范性的化学文库可以从几个来源市售获得(ArQule，Tripos/PanLabs，ChemDesign，Pharmacopoeia)。在一些情况下，利用组合的策略产生这些化学文库，所述组合策略将文库每一成员的同一性编码在附着了成员化合物的基质上，从而可以直接以及间接鉴定作为有效调节物的分子。因此，在许多组合方法中，化合物平面上的位置具体指明化合物的成份。而且，在一个实施例中，一个单独的平面位置可有1至20个化学物质，其可通过施用于含有目标相互作用的小孔筛选得到。因此，如果检测到调节，可以分析反应对的较小集合的调节活性。通过这种方法，可以筛选很多候选化合物。
许多适合使用的文库是本领域已知的并且可用于提供根据本发明试验的化合物。或者，可以利用常规方法构建文库。此外，更一般地，也可以使用结构性限制的有机多样性(例如，非肽)文库。例如，可以使用苯并二氮杂文库(参见例如，Bunin等的，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712)。
在本发明另一个实施方案中，组合化学可被用于鉴定本发明的GPCR调节物。组合化学能够建立包含几十万化合物的文库，其中的很多可以结构相似。同时，高通量筛选程序能够筛选这些大量的文库对已知靶的亲合性，已经开发了新的方法从而获得较小尺寸但是最大化学多样性的文库。(参见例如，Matter，1997，Journal of MedicinalChemistry 401219-1229)。
一种组合化学方法，亲和指纹分析，先前已被用来测试小分子的分散文库对给定蛋白质组的结合亲合性。由扫描获得的指纹被用于预测单独的文库成员对其它目的蛋白或者受体的亲合性(在本发明中，本发明的受体)。所述指纹与从已知与目的蛋白反应的其它化合物获得的指纹比较以预测文库化合物是否可以进行类似的反应。例如，不是测试大文库中与复合物或蛋白质成分相互作用的每一个配体，仅测试与已知具有所述活性的其它化合物具有指纹相似性的那些配体。(参见，Kauvar等人，1995，Chemistry and Biology 2107-118；Kauvar，1995，Affinity fingerprinting，Pharmaceutical Manufacturing International.825-28；及Kauvar，Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition inNew Frontiers in Agrochemical Immunoassay，D.Kurtz.L.Stanker及J.H.Skerritt.Editors，1995，AOACWashington，D.C.，305-312)。
被鉴定为调节物的候选化合物一般，这种扫描的结果将为有一致核结构的化合物；因此这些化合物可围绕优选的核结构进行其它化学修饰从而进一步加强其药学特性。这种技术对于本领域技术人员而言是已知的，并且在本申请中将不再详细描述。
在一些实施方案中，上述鉴定的调节物是可生物利用的。已经开发了大量本领域普通技术人员可以使用的计算方法用于预测可口服生物利用的药物[Ooms等人，Biochem Biophys Acta(2002)1587118-25；Claek & Grootenhuis，Cirr OpinDrug Discov Devel(2002)5382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23172-83；Norinder & Haeberein，Adv Drug Deliv Rev(2002)54291-313；Matter等人，Comb Chem HighThroughput Screen(2001)4453-75；Podlogar & Muegge，Curr Top MedChem(2001)1257-75；其中每一个公开物都在此处全部引入作为参考]。此外，阳离子发射层析成像(PET)已被很多小组成功用于在口服施用药物后的哺乳动物体内获得药物分布的直接测定，所述哺乳动物包含非人类灵长类动物及人体[Noda等人，J.Nucl Med(2003)44105-8；Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)291031-8；Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)14576-81；其中每一个公开物都在此处全部引入作为参考]。页参见下面的实施例19。
D.药物组合物本发明提供了通过给需要治疗(或预防)的个体施用治疗有效量的本发明调节物进行治疗(或预防)的方法[也参见，见PCT申请PCT/IB02/01461，国际公开号WO 02/066505，公开于2002年8月29日；其中每一个公开物都在此处全部引入作为参考]。在一个优选的方面，调节物是纯化的形式。个体优选为动物，包含但不限于诸如牛，猪，马，鸡，猫，狗，兔子，大鼠，小鼠，等，且优选为哺乳动物，且最优选为人。
本发明的调节物可施用于非人类动物[参见下面的实施例]及/或人，单独的或药用组合物的形式，在药用组合物的情况下本发明的调节物与合适的载体或赋型剂利用本领域技术人员公知的技术进行混合。合适的药用载体本领域技术人员可以获得；例如，参见Remington’sPharmacetical Sciences，16thEdition，1980，Marking Publishing Co.，(Oslo等人编)。
然后药学或生理可接受的组合物以治疗有效量提供。治疗有效量是指调节物的量足以预防或者缓解缺血性心脏病症状或生理状态，所述缺血性心脏病包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建，及充血性心衰竭，所述剂量由本发明描述的方法说明性而非限制性的确定。在一些实施方案中，治疗有效量是指调节物的量足以预防或者缓解心血管失调的症状或生理状态，所述心血管失调包含降低心脏输出，增加静脉压，所述剂量由本发明描述的方法说明性而非限制性的确定。在一些实施方案中，治疗有效量是指调节物的量足以影响心血管功能的所需改变，所述心血管功能的改变包含减小心脏肥大，增加心脏射血量，降低心室容积，降低心肌细胞凋亡，所述剂量由本发明描述的方法说明性而非限制性的确定。很清楚，本发明的调节物可以单独或者与其它药用或者生理用化合物组合提供。其它用以治疗本发明失调的化合物是本领域公知的。本发明的一个方面包含本发明公开的实施方案的应用，进一步包括一种或者多种选自如下的药剂卡托普利(captopril)，马来酸依那普利片(Enalapril Maleate)，lininopril，雷米普利(Ramipril)，perindopril，呋塞米(Furosemide)，托拉塞米(torasemide)，chlorothiazide，hydrochlorothiazide，amiloride hydrochloride，螺内酯(spironolactone)，阿替洛尔(atenolol)，比索洛尔(bisoprolol)，carvedilol，metoprololtartrate，及地高辛(digoxin)。
在一些实施方案中，缺血性心脏病选自心肌梗塞，心肌梗塞后重建，及充血性心衰竭。在一些实施方案中，心肌失调选自降低心脏输出及增加静脉压。在一些实施方案中，心血管功能的需要改变选自心脏肥大，心脏射血量增加，心室体积降低，及心肌细胞凋亡降低。
施用途径合适的施用途径包含利用本领域已知的方法口服，鼻，直肠，跨粘膜，或肠施用，非肠道输送，包含肌内，皮下，脊椎内注射，以及鞘内，直接心室内，静脉内，腹膜内，鼻内，肺内(吸入)或眼内注射。其它尤其优选的施用途径为气雾剂以及贮存制剂。本发明的药剂的持续释放剂型，尤其是贮存制剂很清楚被考虑在内。在一些实施方案中，施用途径为口服。
成份/配方用于本发明的药用或者生理用组合物核药剂可以常规方式利用一种或者多种生理上可接受的载体包括赋型剂核助剂进行配制。合适的制剂依赖于所选择的施用途径。
某些描述于此的药剂将包含药用或者生理用载体以及至少一种本发明的调节物。用以注射时，本发明的药剂可制配置在水溶液中，优选为生理用缓冲液中，诸如Hanks溶液，Ringer溶液，或生理盐水缓冲液诸如磷酸或双碳酸溶液。经粘膜施用时，制剂中使用使用适合渗透屏障的渗透剂。这种渗透剂一般来说是本领域已知的。
可以口服的药用或者生理用制剂包含由凝胶制成的推动配合胶囊，由凝胶和诸如甘油或者山梨糖醇的增塑剂制成的软的，密封胶囊。推动配合胶囊可包含与填充剂如乳糖，粘合剂如淀粉，和/或润滑剂诸如滑石或硬脂酸镁及任选的稳定剂混合的活性成份。在软胶囊中，活性成份可溶于或悬浮于合适的液体中，诸如脂肪油，液体石蜡，或液体聚乙二醇。另外，可添加稳定剂。所有的口服制剂都应该在适于口服的剂量。
口腔施用时，组合物可以采用传统方式配制的片剂或者锭剂的剂型。
吸入施用时，本发明使用的化合物以从喷雾器中的压缩团气雾剂喷射递送的方式方便地递送，所述喷雾器使用例如二氧化碳的气体推进剂。在压缩气雾剂的情况下，可以通过提供阀门递送特定量确定剂量单位。用于吸入器或者吹药器的胶囊及例如凝胶的药筒可以配制成含有化合物以及诸如乳糖或者淀粉的合适粉末基体的粉末混合物。
化合物可被配制成通过注射，例如通过弹丸注射或者连续注射用于非肠道给药。注射制剂可以单位剂量存在，例如在安瓿瓶或者多剂量的容器中，通式向其中添加防腐剂。组合物可以为水介质的悬浮，溶液或乳化液的形式，并且可以含有诸如悬浮，稳定和/或分散剂的制剂试剂。
非肠道给药的药用或者生理用制剂包括以水溶形式的活性化合物的水溶液。水溶悬浮液可包含增加悬浮液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠，山梨糖醇或葡聚糖。任选地，悬浮液也可以含有合适的稳定剂或者提高化合物溶解性从而制备高度浓缩溶液的试剂。
或者，活性成份可为粉末或冻干形式的成份以在使用前与合适的介质，诸如无菌无热原水混合。
除了上述的制剂外，化合物也可以配制成长效制剂。这种长效制剂可以通过植入(例如，皮下或肌内)或通过肌内注射。因此，例如，化合物可以与合适的聚合物或疏水性材料(例如可接受油的乳化剂)或离子交换树脂一起配制，或为微溶衍生物，例如为微溶盐。
在一个特别的实施方案中，化合物可经由控制释放系统递送。在一个实施方案中，可以使用泵(Langer，supra；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biom.Eng.14201-240；Buchwald等，1980，Surgery 88507-516；Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574-579)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(Medical Applications of Controlled Release，Langer andWise，eds.，CRC Press，Boca Raton，Florida，1974；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，S，molen和Ball编辑，Wiley，New York，1984；Ranger and Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；Levy等，1985，J.Neurosurg.71858-863)。其它控制释放系统由Langer论述在综述中(1990，Science2491527-1533)。
另外，可以使用持续释放系统递送化合物，诸如包含治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质。多种持续释放材料已被建立并且是本领域技术人员公知的。持续释放胶囊可以，依赖于其化学性质，释放化合物几周到超过100天。
依靠治疗剂的化学性质及生物稳定性，可以使用稳定调节物的其它策略。
药学及生理学组合物也可以包含合适的固体或胶体相的载体或赋形剂。这种载体或赋形剂的例子包括，但不限于碳酸钙，磷酸钙，多种糖类，淀粉，纤维素衍生物，凝胶，以及诸如聚乙二醇的聚合物。
有效剂量适合本发明使用的药学及生理学化合物包括其中含有可以实现治疗目的的有效量活性成分的组合物。更具体的，治疗有效量是指预防接受治疗的受试者出现的症状发展或者缓解所述症状的有效量。有效量的确定是本领域技术人员公知的，尤其是根据本发明提供的详细公开。
对于用于本发明的任一化合物而言，治疗有效剂量可最初由细胞培养分析进行估计。例如，可以在动物模型中配制剂量，以达到循环浓度范围，其包含或含有显示体外系统中保护细胞免于死亡的浓度点或范围。[参见，下面的实施例的体外分析及体内动物模型。]这种信息可被用于更精准地确定用于人体的剂量。
治疗有效量是指使得患者的症状缓解的化合物的量。这种化合物的毒性及疗效可由细胞培养或实验动物的标准药理方法进行确定，用于确定LD50(50％试验群的致死剂量)及ED50(50％试验群的治疗有效剂量)确定。毒性与疗效的剂量比为治疗指数，且其可表示为LD50与ED50的比。表现出高治疗指数的化合物是优选的。
从细胞培养物分析及动物试验获得的数据可被用于配制用在人体的剂量范围。这种化合物的剂量优选落在循环浓度范围内，所述循环浓度范围包含少量或无毒性的ED50。剂量可以根据采用的剂型以及使用的给药途径在这个范围内改变。每个医生可以根据病人的状况选择准确的制剂，给药途径以及剂量。(见，Fingl等人，1975，“治疗的药学基础(The Pharmacological Basis of Therapeutics)”第一章)。
剂量及间隔可以单独调节从而使得提供的活性化合物的血浆浓度根据特定的状态足以预防或者治疗本发明所述的失调。需要获得这些效果的剂量取决于个体特性及给药途径。
剂量间隔也可以利用最低有效浓度的值进行确定。化合物应该利用保持血浆水平高于最低有效浓度10-90％倍，优选30-99％之间，最优选50-90％之间的给药方案进行施用。在局部给药或者选择性摄入的情况下，药物的有效局部浓度可能不与血浆浓度相关。
组合物的施用量当然取决于进行治疗的受试体，受试体的体重，病痛的严重性，给药方式以及处方大夫大判断。
本发明调节物量的优选剂量范围为0.1至100mg/kg体重，所述本发明调节物可以每日或者规律性施用达到需要的效果，包括但不限于预防或治疗本发明所述的缺血性心脏病，预防或治疗本发明所述的心血管失调，或者影响本发明所述的心血管功能所需的改变。其它优选的剂量范围为0.1至30mg/kg体重。其它优选的剂量范围为0.1至10mg/kg体重。其它优选的剂量范围为0.1至3.0mg/kg体重。当然，这些每日剂量可以在一天的时间内周期性小剂量的递送或者施用。应该注意这些剂量范围仅仅是指优选的范围并且并不意味着是对本发明的限制。
E.治疗方法本发明尤其涉及预防或治疗缺血性心脏病，包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建，以及充血性心衰竭的方法，包含给需要这种治疗的个体提供本发明的调节物。本发明尤其涉及预防或治疗心血管失调，包含降低心脏输出及增加静脉压的方法，包含给需要这种治疗的个体提供本发明的调节物。本发明还涉及影响心血管功能需要的改变，包含降低心脏肥大，增加心脏射血体积，降低心室提及，以及减少心肌细胞凋亡的方法，包含给需要这种治疗的个体提供本发明的调节物。在一些实施方案中，所述调节物为口服可生物利用的。在些实施方案中，调节物在药用组合物中通过口服提供给个体。优选地，个体为哺乳动物，并且最优选为人类。
F.其它应用调节(增加，降低，或阻断)心肌细胞保护的RUP41受体功能的试剂可通过将候选化合物与RUP41受体接触并且确定候选化合物对RUP41受体功能的影响进行鉴定。调节RUP41受体功能的化合物的选择可以通过将其对RUP41受体的影响与其对其它受体的影响的比较进行评价。在鉴定了调节RUP41受体功能的化合物后，这些候选化合物可以在其它分析中进行进一步的试验，所述其它分析包括但不限于体内模型，用以对它们活性进行证实以及定量分析。RUP41受体功能的调节物可用于治疗涉及正常或异常RUP41受体功能的疾病及生理状况。
调节(增加，降低，或阻断)心脏保护的试剂可通过将候选化合物与RUP41受体接触以及确定候选化合物对RUP41受体功能的影响进行鉴定。在一些实施方案中，上述心脏保护包含预防或降低心肌细胞死亡。在一些实施方案中，所述心肌细胞死亡包含心肌细胞凋亡。在一些实施方案中，所述心脏保护包含保护心肌防止缺血。在一些实施方案中，所述心脏保护包含降低梗塞面积。在一些实施方案中，在一些实施方案中，所述心脏保护包含改善缺血后收缩性的恢复。在一些实施方案中，所述心脏保护包含抑制恶性缺血诱导的心律不齐。调节RUP41受体功能的化合物的选择可以通过将其对RUP41受体的影响与其对其它受体的影响的比较进行评价。在鉴定了调节RUP41受体功能的化合物后，这些候选化合物可以在其它分析中进行进一步的试验，所述其它分析包括但不限于体内模型，用以对它们活性进行证实以及定量分析。RUP41受体功能的调节物可用于治疗涉及正常或异常RUP41受体功能的疾病及生理状况。
本发明还涉及被鉴定为RUP41的调节物或者配体的本发明化合物的同位素标记形式，其不仅可用于放射性显影[见Lemstra等人，Gerontology(2003)4955-60；Myers等人，JPsychopharmacol(1999)13352-7；其公开物在此处全部引入作为参考]，而且还可以用于体外核体内分析中，用于将RUP41在组织样品中，包括人类的组织样品中定位以及定量分析，并且用以通过抑制同位素标记的化合物的结合鉴定RUP41配体。本发明进一步的目的是开发包含这种同位素标记化合物的新的RUP41分析方法。通过举例而非限制的方式，可以想象通过放射性显影观察到的RUP41可以鉴定一个个体具有发展成缺血性心脏病的危险，所述缺血性心脏病包含心肌梗塞，心肌梗塞后重建以及充血性心衰竭。
本发明包含被鉴定为RUP41调节物或配体的本发明化合物的放射性同位素的形式。
在一些实施方案中，放射线同位素标记形式的化合物与所述化合物相同，但是实际上一个或者多个原子被原子质量或者质量数与通常天然发现(即，天然存在)的原子的原子质量或者质量数不同的原子替换或者取代。可掺入本发明化合物的合适的放射性核素包括但不限于2H(氘)，3H(氚)，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，18F，35S，36Cl，82Br，75Br，76Br，77Br，123I，124I，125I，及131I。掺入本发明的放射性标记的化合物的放射性核素将依赖于放射性标记的化合物的具体应用。例如，对于体外RUP41标记及竞争分析而言，掺入3H，14C，82Br，125I，131I，35S的化合物通常是最有用的。对于放射性显影应用而言，11C，18F，125I，123I，124I，131I，75Br，76Br，或77Br通常是最有用的。在一些实施方案中，放射性核素选自3H，11C，18F，14C，125I，124I，131I，35S及82Br。
将放射同位素掺入有机化合物的合成方法可应用于本发明的化合物并且为本领域所公知。这些合成方法，例如，将将活性水平的氚掺入靶分子，如下所述A.用氚气催化还原-此过程一般产生特异性活性产品并且需要卤化或不饱和前体。
B.用硼氢化钠[3H]还原-此过程非常便宜并且需要含有可还原官能团的前体，诸如醛，酮，内酯，酯类等。
C.用氢化锂铝[3H]还原-此过程提供理论上特异性活性的产品。其也需要含有可还原官能团的前体，诸如醛，酮，内酯，酯类等。
D.氚气暴露标记-此过程包含在存在合适催化剂的条件下将含有可交换质子的前体暴露于氚气。
E.使用甲基碘[3H]进行N-甲基化-此过程一般被用来通过用高特异性活化的甲基碘(3H)处理合适的前体制备O-甲基或N-甲基(3H)产物。此方法一般允许较高特异性的活性，如例如，约70至90Ci/mmol。
将活性水平的125I掺入靶分子的合成方法包括A.Sandmeyer及相似反应-此过程将芳基或杂芳基胺转化成重氮盐，诸如四氟硼酸盐，且随后利用Na125I转化成125I标记的化合物。一种典型的过程由Zhu，D，-G.及其合作者公开于J.Org.Chem.2002，67，943-948中。
B.酚的邻位125I化作用-此过程允许125I掺入酚的邻位，如Collier，T.L.及其合作者公开于J.Labeled Compd Radiopharm.1999，42，S264-S266中。
C.芳基或杂芳基溴化物的125I交换-此方法一般为2个步骤。第一步骤为利用例如，Pd催化的反应[即，Pd(Ph3P)4]或通过芳基或杂芳基锂，在卤化三烷基锡或六烷基二锡[如(CH3)3SnSn(CH3)3]存在下将芳基或杂芳基溴化物转化成相应的三烷基锡中间物。代表性过程由Bas，M.-D.及其合作者报道于J.Labeled Compd Radiopharm.2001，44，S280-S282中。
在一些实施方案中，放射性同位素标记的化合物与所述化合物相同，除了添加一个或者多个含有放射性核素的取代基。在一些进一步的实施方案中，化合物为多肽。在一些更进一步的实施方案中，化合物为抗体或其抗原结合片段。在一些更进一步的实施方案中，所述抗体为单克隆抗体。上述合适的放射性核素包括但不限于2H(氘)，3H(氚)，11C，13C，14C，13N，15N，15O，17O，18O，18F，35S，36Cl，82Br，75Br，76Br，77Br，123I，124I，125I，及131I。掺入本发明列举的放射性标记的化合物的放射性核素将依赖于放射性标记的化合物的具体应用。例如，对于RUP41标记以及竞争分析而言，掺入3H，14C，82Br，125I，131I，35S的化合物通常最有用。对于放射性显影应用而言，11C，18F，125I，123I，124I，131I，75Br，76Br，或77Br通常是最有用的。在一些实施方案中，放射性核素选自3H，11C，18F，14C，125I，124I，131I，35S及82Br。
添加一种或多种包含放射性核素的取代基的方法为本领域技术人员所熟知，并且包括但不限于通过酶促法[Marchalonic JJ，BiochemicalJournal(1969)113299-305；Thorell JI and Jahansson BG，Biochimica etBiophysica Acta(1969)251363-9；每个公开物全部在此处引入作为参考]，以及或者通过氯胺-T/Iodogen/Iodobead法[Hunter WM andGreenwood FC，Nature(1962)194495-6；Greenwood FC等，BiochemicalJournal(1963)89114-23；每个公开物全部在此处引入作为参考]添加放射性同位素碘。
所公开的受体和方法的其它应用尤其是基于本专利文献的综述对于本领域技术人员而言是显而易见的。
实施例下列实施例为说明目的，并且并不限制本发明。虽然本发明公开了具体的核酸及氨基酸序列，但是本领域的普通技术人员应该有能力对这些序列进行微小的修饰同时达到与下面报道的相同或大致上相同的结果。本发明公开的突变方法不依赖于这种方法而是基于一种算法以及与位于人类GPCRS的TM6区内的保守脯氨酸残基的位置距离。一旦这种方法是安全的，本领域技术人员就应该有能力对其进行微小修饰达到与本发明公开的大致上相同的结果(即，组成性活性)。这种修饰方法在本发明公开的范围内。
下列的提供是为了说明的目的并且并不意味着是一种限制。本领域的一个普通技术人员根据本发明所公开的内容可以设计同样的分析和方法，所有构成了本发明的一部分。虽然对本领域技术人员而言可以采用多种表达载体，但是为了利用内源性和非内源性GPCRs利用的目的，在一些实施方案中，优选采用的载体为pCMV。这种载体在1998年10月13日保藏在用于专利目的的布达佩斯条约承认的生物材料样品国际保藏单位美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。由ATCC测试DNA并且确定且可执行确定。ATCC指定了下列的保藏编号pCMVATCC#203351。在一些实施方案中，优选采用腺病毒表达载体。
与本发明主题相关并且是本领域普通技术人员已知的重组DNA技术参见Maniatis等人的，Molcular CloningA Laboratiry Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory；美国专利6,399,373；以及PCT申请PCT/IB02/01464，公开于2002年8月29日，公开号WO/02/066506；其中每个的公开内容在此处全部引入作为参考。
实施例1内源性人类RUP41的全长克隆本发明公开的RUP41是基于GenBank数据库的信息进行鉴定的。当检索数据库时，登录号为U66581的cDMA克隆被鉴定为7号染色体的人基因组序列。全长RUP4通过使用下列引物以及人基因组DNA作为模板的PCR进行克隆5’-TCCCCCGGGAAAAAAACCAACTGCTCCAAA-3’(SEQ IDNO7；正义)5’-TAGGATCCATTTGAATGTGGATTTGGTGAAA-3’(SEQ IDNO8；反以，包含BamHI位点)。
使用带有由厂商提供的缓冲系统的rTth聚合酶(Perkin Elmer)，0.25mM的每种引物以及0.2mM的每一种的4种核苷酸进行扩增。循环条件为94℃，1分钟，50℃，1分钟，及72℃，1.5分钟，共30个循环。5’PCR引物用激酶作用并且用BamHI酶解1.38kb的PCR片段并克隆到pCMV表达载体的EcoRV-BamHI位点。参见核酸序列SEQ IDNO1推测的氨基酸序列SEQ ID NO2。
实施例二制备非内源性，组成性活化的人类RUP41本领域技术人员应该能够选择突变核酸序列的技术。下面显示的是用于产生人GPCRs非内源性形式的技术。下面显示的RUP41的突变是基于一种算法，通过该方法从保守脯氨酸(或其内源性的保守取代物)残基(位于GPCR的TM6区，接近TM6/IC3的界面)的第16个氨基酸(位于GPCR的IC3区)突变，优选突变为丙氨酸，组氨酸，精氨酸或赖氨酸残基，最优选突变为赖氨酸残基。
非内源性组成性活化的全长人RUP41位于SEQ ID NO2或SEQID NO3的312位的苯丙氨酸残基突变为赖氨酸(F312K)实现。
1.转化位点-DirectedTM诱变制备非内源性人GPCRs可以通过根据说明书使用转化位点-DirectedTM诱变试剂盒(Clontech)在人CPGRs的基础上实现。使用两种诱变引物，最优选为产生赖氨酸突变的赖氨酸诱变寡核苷酸，以及选择标记寡核苷酸。为了方便起见，以常规的形式将密码子突变引入人GPCR。
2.QuikChangeTM位点-DirectedTM诱变也可以通过使用QuikChangeTMSite-DirectedTM诱变试剂盒(Stratagene，根据说明书)实现非内源性人GPCRs的制备。优选内源性GPCR作为模板并且采用两个诱变引物，以及最优选的赖氨酸诱变寡核苷酸以及选择性标记寡核苷酸(包含于试剂盒中)。为了方便起见，以常规的形式掺入新的人GPCR的密码子突变以及单独的寡核苷酸。实施例3
受体表达虽然本领域有多种细胞可用于表达蛋白，但是最优选采用哺乳动物细胞或者黑色素细胞。主要原因是根据经验进行的预测，即，利用例如酵母细胞表达GPCR，虽然可以向所述试验流程中引入可能不(实际上在酵母中不)包括哺乳动物系统演化的受体偶联，遗传机制以及分泌途径的非哺乳动物细胞，而且从非哺乳动物细胞获得的结果，虽然可能有用，但是不如从哺乳动物细胞或者黑色素细胞获得的优选。虽然所使用的具体哺乳动物细胞的预测依赖于技术人员的具体需要，但是哺乳动物细胞CHO，COS-7，293，及293T尤其优选。参见下列有关黑色素细胞，包含实施例8。
a.瞬间转染在第一天，以6×106/10cm平皿将293细胞铺板。第二天，制备两个反应试管(每个试管后的比例为每个平板)试管A由将4μg DNA(例如，pCMV载体；带有受体cDNA的pCMV载体，等)混合在0.5ml的无血清DMEM(Gibco BRL)中进行制备；试管B由将24μg脂质转染胺试剂(Gibco BRL)混合于0.5ml的无血清DMEM中进行制备。试管A及B通过倒置(数次)进行混合，随后在室温下培养30至45分钟。混合物被称作“转染混合物”。铺板的293细胞用1×PBS清洗，随后添加5ml的无血清DMEM。将1ml的转染混合物添加至细胞，然后在37℃/5％CO2下培养4小时。转染混合物通过抽吸除去，随后添加10ml的DMEM/10％胎牛血清。细胞在37℃/5％CO2下培养。在培养48小时后，收集细胞并用于分析。
b.稳定的细胞系约12×106的293细胞在15cm的组织培养皿上铺板。在韩10％胎牛血清和1％丙酮酸钠，L-谷氨酰胺和抗生素的DME高葡萄糖培养基。293细胞铺板后24小时(或～80％的铺满率)，利用12μg的DNA转染细胞。12μg的DNA与60μl的脂质转染胺试剂和2的无血清DME高葡萄糖培养基混合。从平皿抽吸培养基，且用无血清的培养基清洗细胞一次。将DNA，脂质转染胺试剂和培养基混合物连同10ml无血清培养基添加平皿中。随后在37℃培养4至5小时，抽吸培养基并且添加25ml的含血清培养基。转染24小时后，再次抽吸培养基，并且添加带有血清的新鲜培养基。转染48小时后，抽吸培养基并且添加含有终浓度为500μm/ml的遗传霉素(G418药物)的含血清培养基。选择转染的细胞中含有G418抗性基因的阳性转染细胞。进行选择时，每4到5天更换一次培养基。在选择期间，细胞生长形成稳定的集合，或者分裂用于稳定的克隆选择。
实施例4用于确定GPCR活化的分析多种方法用于评估人GPCRs的活化。下面列举的是说明性的，本领域普通技术人员应该能够优选地对于技术人员的需要有益的那些技术。
1.细胞膜结合分析[35S]GTPγS分析当G蛋白偶联受体在其活化状态，如由于配体结合或组成性活化，受体偶联G蛋白并且刺激GDP的释放以及随后GTP与G蛋白的结合。G蛋白受体复合物的α亚基起GTPase的作用并且缓慢水解GTP至GDP，在这点时通常受体失活。活化的受体继续将GDP转换成GTP。非水解的GTP类似物，[35S]GTPγS，可被用来证实[35S]GTPγS与表达活性受体的膜的增强结合。使用[35S]GTPγS结合来测量活化的优点在于(a)其一般可应用与全部G蛋白偶联受体；(b)其靠近膜表面使其不可能挑选影响细胞内级联的分子。
此分析利用G蛋白偶联受体刺激[35S]GTPγS结合表达相关受体的膜。因此，此分析可用于直接鉴定方法从而筛选内源性GPCRs及非内源性，组成性活化的GPCRs的候选化合物。此分析是通用的，并且可用于所有G蛋白偶联受体的药物发现。
GTPγS分析为培养于20mM HEPES及1至20mM氯化镁中(可调节此量优化结果，虽然20mM是优选的)pH7.4，约0.3至约1.2nM[35S]GTPγS之间的结合缓冲液(可调节此量优化结果，虽然1.2是优选的)，及12.5至75μg的膜蛋白(可调节此量优化结果)及10μMGDP(可调节此量优化结果)1小时。然后加入麦芽凝集素粒(25μl；Amersham)且在室温培养混合物30分钟。然后将试管1500×g，室温下离心5分钟，且在闪烁计数器中计数。
2.腺甘酸环化酶设计用于基于细胞分析的Flash PlateTM腺甘酸环化酶试剂盒(NewEngland Nuclear；Cat.NO.SMP004A)可以进行修饰用于粗原生质膜的分析。Flash Plate微孔中可包含一闪烁覆盖层其亦包含特异性抗体识别的cAMP。微孔中产生的cAMP可通过直接竞争放射性cAMP指示剂与cAMP抗体的结合进行定量。随后提供的是测定表达受体的全细胞中cAMP水平改变的简要方案。
在瞬间转染后24小时收集转染的细胞。小心抽移培养基且丢弃。10毫升PBS缓慢添加至细胞的每一平皿中，然后小心抽吸。向每一微孔板中添加1ml的Sigma细胞裂解缓冲液及3毫升的PBS。从微孔板移出细胞并将细胞悬浮液收集于50毫升的圆锥形离心管中。接着细胞在室温下以1,100rpm离心5分钟。将细胞沉淀小心再悬浮于合适体积的PBS中(约3毫升/板)。然后利用血球计数器对细胞计数，并且添加另外的PBS得到合适数量的细胞(最终体积为约50μl/孔)。
制备cAMP标准以及检测缓冲液[含有1μCi指示剂125I cAMP(50μl)到11ml检测缓冲液]并且根据厂家的说明书进行保存。制备新鲜的分析缓冲液用于筛选并且含有50μl激化缓冲液，3μl试验化合物(12μM终分析浓度)以及50μl的细胞，将分析缓冲液储藏在冰上直至使用。通过向适当的微孔中添加50μl的cAMP标准，然后向微孔H-11以及H12中添加50μl的PBSA起始分析。将50μl的激化缓冲液添加到所有的微孔中。利用能够分配3μl化合物溶液的针型工具将DMSO(或选择的候选者化合物)添加到适当的微孔中，终分析浓度为12μM试验化合物以及100μl的总分析体积。然后将细胞添加至微孔且在室温下温育60分钟。然后将含有指示剂cAMP的100μl的检测混合物添加至微孔。然后另外温育板2小时然后在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。然后从标准cAMP曲线推断每微孔cAMP的值，所述标准cAMP包含在每个分析板中。
3.基于细胞的cAMP用于Gi偶联的靶GPCRsTSHR为Gs偶联GPCR，其引起cAMP在激活后的累积。通过突变氨基酸残基623(即，将丙氨酸残基改变为异亮氨酸残基)组成型激活TSHR。预计Gi偶联的受体抑制腺苷酸环化酶，并且因此减少cAMP的产生水平，从而可以进行cAMP水平攻击的估计。用于测定作为Gi偶联的受体组成性激活指示的cAMP产生减少的有效技术可以通过共-转染，最优选地非-内源性组成型活化的TSHR(TSHR-A623I)(或内源性的组成型活化的Gs偶联的受体)作为“信号增强剂”，用Gi连接的靶GPCR建立cAMP的基线水平进行。在产生Gi偶联受体的非-内源性形式后，然后与信号增强剂共转染靶GPCR的非-内源性形式，并且它为可用于筛选的物质。当使用cAMP分析时，我们将利用这种方法有效地产生信号；这种方法优选用于抗Gi偶联受体的候选化合物的直接鉴定。人们注意到当使用这种方法时，靶GPCR的反激动剂，Gi偶联的GPCR将增加cAMP信号并且激动剂将减少cAMP信号。
在第一天，将293细胞以2×104/微孔进行铺板。第二天，制备两个反应试管(每个试管后的比例为每个平板)试管A由将2μg的转染到哺乳动物细胞的每种受体的DNA，总共4μg的DNA[例如，pCMV载体；带有突变的THSR(THSR-A623I)的pCMV载体；THSR-A623I和GPCR等受体cDNA的pCMV载体，等]混合在1.2ml的无血清DMEM(Gibco BRL)中进行制备；试管B由将120μg脂质转染胺试剂(GibcoBRL)混合于1.2ml的无血清DMEM中进行制备。然后试管A及B通过倒置(数次)进行混合，随后在室温下培养30至45分钟。混合物被称作“转染混合物”。铺板的293细胞用1XPBS清洗，随后添加10ml的无血清DMEM。然后将2.4ml的转染混合物添加至细胞，然后在37℃/5％CO2下培养4小时。转染混合物通过抽吸除去，随后添加25ml的DMEM/10％胎牛血清。细胞在37℃/5％CO2下培养。在培养24小时后，收集细胞并用于分析。
设计用于基于细胞分析的Flash PlateTM腺甘酸环化酶试剂盒(NewEngland Nuclear；Cat.NO.SMP004A)却可以根据本领域技术人员的需要进行修饰用于粗原生质膜的分析。FlashPlate微孔中可包含一闪烁覆盖层其亦包含特异性抗体识别的cAMP。微孔中产生的cAMP可通过直接竞争放射性cAMP指示剂与cAMP抗体的结合进行定量。随后提供的是测定表达受体的全细胞中cAMP水平改变的简要方案。
在瞬间转染后24小时收集转染的细胞。小心抽移培养基且丢弃。10毫升PBS缓慢添加至细胞的每一平皿中，然后小心抽吸。向每一微孔板中添加1ml的Sigma细胞裂解缓冲液及3毫升的PBS。从微孔板移出细胞并将细胞悬浮液收集于50毫升的圆锥形离心管中。接着细胞在室温下以1,100rpm离心5分钟。将细胞沉淀小心再悬浮于合适体积的PBS中(约3毫升/板)。然后利用血球计数器对细胞计数，并且添加另外的PBS得到合适数量的细胞(最终体积为约50μl/孔)。
制备cAMP标准以及检测缓冲液[含有1μCi指示剂125I cAMP(50μl)到11ml检测缓冲液]并且根据厂家的说明书进行保存。制备新鲜的分析缓冲液用于扫描并且含有50μl激化缓冲液，3μl试验化合物(12μM终分析浓度)以及50μl的细胞，将分析缓冲液储藏在冰上直至使用。通过向适当的微孔中添加50μl的cAMP标准，然后向微孔H-11以及H12中添加50μl的PBSA起始分析。将50μl的激化缓冲液添加到所有的微孔中。利用能够分配3μl化合物溶液的针型工具将DMSO(或选择的候选者化合物)添加适当的微孔中，终分析浓度为12μM试验化合物以及100μl的总分析体积。然后将细胞添加至微孔且在室温下温育60分钟。然后将含有指示剂cAMP的100μl的检测混合物添加至微孔。然后另外温育板2小时然后在Wallac MicroBeta闪烁计数器中计数。然后从标准cAMP曲线推断每微孔cAMP的值，所述标准cAMP包含在每个分析板中。
4.基于报告基因的分析Reporter-Based Assaysa.CRE-LUC报告基因的分析分析(Gs-相关受体)293和293T细胞以2×104个细胞/微孔的密度在96孔板上铺板，并且在第二天利用脂质转染胺试剂(BRL)根据厂家的说明书进行转染。如下所述为每个6-孔转染制备DNA/脂质混合物260ng的质粒DNA的100μl DMEM溶液与2μl的脂质的100μl DMEM溶液(由200ng的8xCRE-Luc报告质粒，50ng含有内源性受体或者非内源性受体或者单独的pCMV的pCMV，以及10ng的GPRS表达质粒(GPRS于pcDNA3中(Invitrogen)构成的260ng的质粒DNA)混合。8XCRE-Luc报告质粒制备如下通过将大鼠抑生长素启动子(-71/+51)克隆在pβgal-Basic载体(Clontech)的BglV-HindIII位点获得载体SRIF-β-gal。通过从腺病毒模板AdpCF126CCRE8(参见，7 Human Gene Therapy1883(1996))进行PCR获得8个拷贝的cAMP应答元件，并且克隆到SRIF-β-gal载体的Kpn-BglV位点，产生8xCRE-β-gal报告载体。通过用从pGL3-basic载体(Promega)获得的荧光素酶基因在HindIII-BamHI位点替换8xCRE-β-gal报告载体的β-半乳糖苷酶基因产生8xCRE-Luc报告质粒。30分钟后，在室温下温育，用400μl的DMEM稀释DNA/脂质混合物，并且将100μl的稀释的混合物添加至每个微孔中。在细胞培养箱中培养4小时后，将带有10％FCS的100μl的DMEM添加至每个微孔中。第二天，转染的细胞更换带有10％FCS的200μl/微孔的DMEM。8小时后，用PBS冲洗后，微孔转变为不带酚红的100μl/微孔的DMEM。利用LucLiteTM报告基因分析试剂盒(Packard)根据厂家的说明书在第二天测定荧光素酶的活性，并且在1450 MicroBetaTM闪烁和荧光计数器上读数(Wallac)。
b.AP1报告基因分析(Gq-相关受体)检测Gq激活的方法取决于Gq-依赖的磷脂酶C引起在其启动中含有AP1元件基因的激活的已知特性。PathdetectTMAP-1顺式-报告系统(Stratagene，Catalogue#219073)可根据上述方案参考CREB报告基因分析进行利用，除了磷酸钙沉淀的成分为410ng的pAP1-Luc，80ngpCMV-受体表达质粒以及20ng的CMV-SEAP。
c.SRF-LUC报告基因分析(Gq-相关受体)检测Gq激活的方法取决于Gq-依赖的磷脂酶C引起在其启动中含有血清效应因子基因的激活的已知特性。PathdetectTMSRF-Luc报告系统(Stratagene)可用于分析例如COS7细胞中Gq偶联活性。利用哺乳动物TransfectionTM试剂盒(Stratagene，目录#_200285)根据厂家的说明书，用系统的质粒组分以及显示的编码内源性或非-内源性GPCR的表达质粒转染细胞。B简言之，根据每个厂家的说明书，将410ng的SRF-Luc，80ng的pCMV-受体表达质粒以及20ng的CMV-SEAP(分泌的碱性磷酸酶表达质粒；在转染的细胞中测定碱性磷酸酶活性以调节样品之间转染率的变化)组合在磷酸钙沉淀中。一半的沉淀均等分配在96-微孔板中的3个微孔上，将细胞保存在不含血浆的培养基中24小时。最后5小时，细胞用1μM的血管紧张素温育，如图所示。然后溶解细胞并且根据厂家的说明书，利用LucliteTM试剂盒(Packard，Cat.#6016911)以及“Trilux 1450 Microbeta液体闪烁以及发光计数器(Wallac)”分析荧光素酶活性。可利用GraphPad PrismTM2.0a(GraphPad Software公司)分析数据。
细胞内IP3累积分析(Gq-相关的受体)在第一天，含有受体(内源性的和/或非-内源性的)的细胞可以铺板在24微孔板上，通常密度为1×105个细胞/微孔(尽管红棕色可以最佳化。第二天，可以通过首先将0.25μg的DNA混合在50μl的不含血浆的DMEM/微孔以及2μl脂质转染胺试剂的50μl不含血清的DMEM/微孔中进行转染。轻轻地混合溶液并且在室温下温育15-30分钟。用0.5ml的细胞PBS清洗并且将400μl不含血浆的培养基与转染培养基混合并添加至细胞。然后将细胞在37℃/5％CO2温育3-4小时然后除去转染培养基并用1ml/微孔的正常生长培养基替换。第三天用3H-肌醇标记细胞。简要地，除去培养基并且用0.5ml的PBS清洗细胞。接着将0.5毫升不含肌醇/不含血清的培养基(GIBCO BRL)添加至含有0.25μCi的3H-myo-肌醇/孔的每个微孔中，且细胞在37℃/5％CO2下培养16至18小时。第四天，细胞以0.5毫升的PBS清洗并且添加0.45毫升包含无肌醇/不含血清培养基，10μM pargyline，10mM氯化锂分析培养基或0.4毫升分析培养基及50μl 10×ketanserin(ket)至最终浓度10μM。细胞接着在37℃培养30分钟。接着以0.5毫升PBS清洗细胞并且添加200μl新鲜/冰过的冷终止溶液(1M氢氧化钾；18mM硼酸钠；3.8mMEDTA)至孔中。溶液保持在冰中5至10分钟或直到细胞溶解，接着以200μl的新鲜/冰过的冷中和溶液中和(7.5％盐酸)。然后将溶解物转入1.5毫升微量试管并且向每个试管中1毫升氯仿/甲醇(1∶2)。溶液涡旋15秒且将上层液相应用于Bioead AG1-X8TM阴离子交换树酯(100至200孔径)。首先，树酯以1∶1.25W/V的水清洗，且将0.9毫升上层液相上样到管柱中。管柱以10毫升的5mM肌醇及10毫升的5mM硼酸钠/60mM甲酸钠清洗。三磷酸肌醇洗脱进入包含10毫升有2毫升的0.1M甲酸/1M的甲酸铵的闪烁混合物的发光瓶。管柱用10毫升的0.1M甲酸/3M甲酸铵清洗且用ddH2O冲洗2次并且储存于4℃的水中。
实施例5融合蛋白制备a.GPCRGs融合构建体设计组成性活化的GPCR-G蛋白融合构建体如下大鼠G蛋白GSα的5’及3’末末端(长结构；Itoh，H等人，83 PNAS 3776(1986))被操作其中包含HindIII(5’-AAGCTT-3’)序列。确认正确序列后(包含侧接HindIII序列)，通过使用该载体的HindIII限制性位点，通过亚克隆将全序列穿梭进入pcDNA3.1(-)(Invitrogen，cat.No.V795-20)。Gsα序列的正确的起点在亚克隆进入pcDNA3.1(-)后确定。然后验证在HindIII序列包含大鼠Gsα基因的修饰的pcDNA3.1(-)；此载体可用作“通用”Gsα蛋白载体。PcDNA3.1(-)载体包含多种在HindIII上游的已知限制性位点，因此有益于在Gs蛋白的上游插入内源性组成性活性GPCR的编码序列。相同的方法可利用来形成其它“通用”的G蛋白受体，及当然，其它市售的或者本领域技术人员公知的载体可被利用-重要的标准为GPCR序列为上游并且在G蛋白的读码框内。
b.Gq(6氨基酸缺失)/Gi融合构建体Gq(del)/Gi融合构建体设计可完成于下N末端6个氨基酸(氨基酸2至7，TLESIM Gαq-亚基的序列将缺失且C末端5个氨基酸，EYNLV序列将用具有DCGLF序列的Gαi蛋白的相应氨基酸取代。这个融合构建体将通过使用下列引物的PCR获得5’-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3’(SEQID NO9)以及5’-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3’(SEQ ID NO10)及包含小鼠Gαq野生形式的质粒63313，红血球凝集素尾作为模板。包含低程度加帽的核苷酸作为间隔区。
TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)将在随后循环中被用来复制，其中步骤2至4重复35次95℃ 2分钟；95℃ 20秒；56℃20秒；72℃ 2分钟；及72℃ 7分钟。PCR产品将克隆于pCRII-TOPO载体(Invitrogen)中，并且使用ABI Big Dye Terminator试剂盒(P.E.Biosystems)进行测序。从包含融合构建体序列的TOPO克隆嵌入物将由2步骤的克隆过程穿梭进入表达载体pcDNA3.1(+)的HindII/BamHI位点。也参见，PCT申请编号PCT/US02/05625，公开号WO02068600，公开于2002年9月6日，其公开内容全不在此处引入作为参考。
实施例6规约反激动剂与激动剂的直接鉴定A.[35S]GTPγS分析在一些实施方案中，内源性GPCR被用以直接鉴定作为例如激动剂或拮抗剂的候选化合物。在一些实施方案中，内源性组成性活化的GPCR或非内源性组成性活化的GPCR被利用来直接鉴定作为例如反激动剂或激动剂的候选化合物。在一些实施方案中，包含内源性，组成性活化的GPCR或非内源性组成性活化的GPCR的GPCR融合蛋白被用来直接鉴定作为例如反激动剂或激动剂的候选化合物。在所述实施方案中，提供随后的分析方案用于所述直接鉴定。
膜制备在一些实施方案中，包含目的GPCR/融合蛋白且用以直接鉴定作为反激动剂，激动剂或拮抗剂的候选化合物优选制备如下a.材料“膜刮除缓冲液”包含20mM HEPES及10mM EDTA，pH7.4；“膜清洗缓冲液”包含20mM HEPES及0.1mM EDTA，pH7.4；“结合缓冲液”包含20mM HEPES，100mM氯化钠及10mM氯化镁，pH7.4。
b.过程全部的材料在整个过程中，都保存在冰上。首先，将从细胞铺满的单层抽吸培养基，随后用10毫升冷PBS清洗，随后吸出。此后，5毫升的膜刮除缓冲液将添加至刮除细胞；然后将细胞提取物转入50毫升离心管中(在4℃，20,000rpm离心17分钟)。随后，上层液将被吸出，且在4℃，20000rpm离心17分钟后颗粒将会再次悬浮于30毫升膜清洗缓冲液中。上层液将被吸出，且颗粒将再次悬浮于缓冲液中。然后使用Binkman PolytronTM匀浆机匀浆(15至20秒破裂，直到全部材料于悬浮液中)。在此提及为“膜蛋白”。
Bradford蛋白质分析在匀浆后，膜的蛋白质浓度将利用Bradford蛋白质分析测(蛋白质稀释至约1.5毫克/毫升，分份并进行冷冻(-80℃)待用；当冷冻时，将使用下列试验方案在分析当天，冷冻的膜蛋白在室温下融化，随后进行涡旋，然后用Polytron在约12×1,000rpm匀浆约5至10分钟；值得注意，为了多重制备，在匀浆不同的制备物时，要对匀浆机彻底清洗。
a.材料结合缓冲液(如上)；Bradford染剂；Bradfore蛋白质标准亦将被使用，参照说明书(Biorad，cat.No.500-0006)。
b.过程准备复制管，一个包含膜，且一个作为“空白“。每一个包含800μl结合缓冲液。然后，将10μl的Bradford蛋白质标准液(1毫克/毫升)添加至每一个试管，且将10μl膜蛋白添加至一个管(不是空白管)。此后，将200μl的Bradford染剂添加至每一管中，随后涡旋。5分钟后，试管将再涡旋，且将其中的物质转入小玻璃管。小玻璃管将使用CECIL3041分光光度计，在波长595下读数。
直接鉴定分析a.材料包含37.5毫升结合缓冲液及2mg的GDP(Sigma，cat.No.G-7127)的GDP缓冲液，随后在结合缓冲液中连续稀释以含有0.2μM的GDP(每孔的最终GDP浓度为0.1μM的GDP)；每一个孔包含一种候选化合物，包含100μl GDP缓冲液(最终浓度，0.1μM GDP)，50μl于结合缓冲液中的膜蛋白及50μl于结合缓冲液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(2.5μl[35S]GTPγS/10毫升结合缓冲液)的200μl体积。
b.过程候选化合物最好使用96孔板形式扫描(其可以冷冻至-80℃)。膜蛋白(或包含排除了GPCR融合蛋白表达载体的膜，作为对照)，将简单地匀浆直到悬浮。然后使用上述列举的Bradford蛋白质分析确定蛋白浓度确定。膜蛋白(及对照)将接着稀释至0.25毫克/毫升结合缓冲液中(最终分析浓度为12.5μg/孔)。随后，将100μl的GDP缓冲液添加至Wallac ScintistripTM(Wallac)的每个微孔中。然后使用5μl的针状工具用来转移5μl的候选化合物至每一孔(即，5μl于200μl总分析体积为1∶40，因此最终候选化合物的扫描浓度为10μM)。再次，为了避开污染物，在每一个转移步骤后，针状工具将用三种包含水(1X)，乙醇(1X)及水(2X)储液器清洗-多余液体的在每次清洗后将多余液体从工具上甩掉并用纸或纸巾干燥。此后，将50μl的膜蛋白添加至每一孔中(包含没有GPCR融合蛋白的膜的对照孔亦被使用)，且在室温下预先培养5至10分钟。此后，结合缓冲液中50μl的[35S]GTPγS(0.6nM)将添加至每一孔中，随后在室温下以震荡培养60分钟(再次，在此实施例中，板用金箔覆盖)。分析将通过在22℃，4000rpm转动板15分钟停止。薄板用8歧管吸出且用板面密封。薄板用设定在“Prot.#37”(如操作说明书)的Wallac1450上读数。
B.cAMP分析另一个直接鉴别作为反激动剂，激动剂，及拮抗剂的候选化合物的方法通过利用基于环化酶的分析完成。除了直接鉴定，这种分法可用作独立的方法提供上述[35S]GTPγS方法结果的确认。
修饰的Flash PlateTM腺甘酸环化酶试剂盒(New England Nuclear；Cat.No.SMP004A)根据下列方案优选用于直接鉴定用作内源性或者组成性GPCRs的反激动剂及激动剂的候选化合物直接鉴定。
转染的细胞在转染后3天收集。膜通过将包含20mM HEPES，pH7.4，及10mM氯化镁的缓冲液中悬浮细胞的匀浆制备。匀浆最好在冰上使用Brinkman PolytronTM约10秒进行。产生的匀浆物在4℃，49，000X克下离心15分钟。产生的颗粒接着再次悬浮于含有20mM HEPE，pH7.4及0.1mM EDTA的缓冲溶液中，匀浆10秒，随后在4℃，49，000X克下离心15分钟。产生的颗粒接着储存于-80℃直到使用。直接鉴定扫描当天，膜颗粒在室温下缓慢融化，再次悬浮于含20mMHEPES，pH7.4，及10mM氯化镁的缓冲溶液中以产生最终蛋白质浓度0.60毫克/毫升(悬浮的膜至于冰中直到使用)。
cAMP标准及检测缓冲液[包含2μCi示踪剂125IcAMP(100μl)至11毫升检测缓冲溶液]根据操作说明书进行制备及保存。分析缓冲溶液新鲜制备用以扫描且包含20mM HEPES，pH7.4，10mM氯化镁，20mM磷酸肌酸(Sigma)，0.1单位/毫升的肌酸磷酸激酶(Sigma)，50μM GTP(Sigma)，及0.2mM ATP(Sigma)。分析缓冲溶液接着储存于冰中直到使用。
将候选化合物(若冷冻，在室温下融化)与40μl膜蛋白(30μg/孔)及50μl分析缓冲溶液一起优选添加至96孔板(3μl/孔；12μM最终分析浓度)。混合物在室温下伴随轻微震动培养30分钟。
培养后，将100μl的检测缓冲溶液添加至每一个孔中，随后培养2至24小时。然后使用“Prot.#31“(如操作说明)由Wallac MicroBetaTM薄板进行计数。
举例而非限制的方式，典型扫描分析薄板(96孔)结果如图1所示。每一个条状柱代表不同孔化合物的结果，“靶受体”为内源性，组成性活化的Gs偶联蛋白GPCR的Gsα融合蛋白构建体。在第图1中的代表性结果也提供了基于每一薄板(“m”)结果平均值的标准偏差，并且平均值乘以2个反向激动剂的随机选择偏爱作为最初扫描的“指引”包括选择降低平均板应答的应答百分比的候选化合物，除以两个标准偏差。相反的，选择的激动剂作为最初扫描的“指引”的激动剂选择的随机偏爱包括选择选择增加平均板应答的应答百分比的候选化合物，乘以两个标准偏差。以这些选择过程为基础，在随后孔中的候选化合物直接鉴定为分别在孔A2及G9中所述内源性GPCR推断的反激动剂(化合物A)及激动剂(化合物B)至。参见图1。清楚显示这些化合物不用这种GPCR内源性配体的任何知识就可直接鉴定。通过关注于基于受体功能的分析技术我们能够确定能降低此受体(化合物A)功能活性和增加受体(化合物B)功能活性的化合物。
实施例7测量细胞内钙浓度的萤光显影板读取机(FLIPR)从各自克隆系的靶受体(实验性)及pCMV(阴性对照)稳定转染的细胞以5.5×104细胞/孔接种在聚-D-赖氨酸预先处理的带有完全培养基(10％FBS，2mM L-麸氨酸，1mM丙酮酸钠的DMEM)的96孔板中(Becton-Dickinson，#356640)隔天分析用。为了制备Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培养缓冲液储液，将1毫克Fluo4-AM溶解于467μl DMSO及467μl Pluoronic酸(Molecular Probe，#P3000)中以产生1mM储液，其可以储存于-20℃一个月。Fluo4-AM为萤光钙指示染剂。
候选化合物制备于清洗缓冲液中(1XHBSS/2.5mMProbenicid/20mM HEPES，pH7.4)。
在分析时，培养基从孔移除并且向细胞加入100μl的4μMFluo4-AM/2.5mM的Probenicid(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培养基，pH7.4。培养于37℃/5％CO260分钟。
在培养1小时后，移除Fluo4-AM培养缓冲液且细胞以2倍100μl清洗缓冲溶液清洗。每一孔中剩余100μl清洗液。薄板再次培养于37℃/5％CO260分钟。
FLIPR(萤光显影板读取机；分子设备)被设置在30秒添加50μl的候选化合物，且记录由候选化合物在另一个150秒中引起细胞内钙浓度([Ca2+])的瞬时改变。使用FLIPR软件，总萤光改变计数被用来确定激动剂活性。设备软件将荧光读书较准在0点给出相同的最初的读数。
在一些实施方案中，包含靶受体的细胞进一步包含混栖Gα15/16或嵌合Gq/Giα单位。
虽然先前提供了使用稳定转染的进行激动剂活性FLIPR分析，本领域技术人员对分析进行修改以鉴定拮抗剂的活性。上述本领域技术人员也可以容易地认识到，或者可以使用瞬间转染的细胞。
实施例8黑色素细胞技术黑色素细胞为发现于低等脊椎动物的皮肤细胞。其包含称作黑色素体的有色素的细胞器。黑色素细胞能够在G蛋白偶联受体(GPCR)活化后将这些黑色素体沿着微管网再分配。这些色素移动的结果是发现细胞明显变亮或者变暗。在黑色素细胞中，从Gi偶联受体活化引起细胞内cAMP浓度降低造成黑色素细胞移动至细胞中央，产生引人注意的颜色变亮。若cAMP量接着升高，随着Gs偶联受体的活化，黑色素细胞再分配且细胞再次变暗。Gq偶联受体活化产生的二酰甘油含量的增加也可诱导这种再分配。另外，此技术也适用于研究某些受体酪氨酸激酶。黑色素细胞反应发生于受体活化的几分钟内，且产生简单，较浓的颜色改变。此反应可简单使用常见吸收微板读取器或中度显影系统测定确定。不像其它皮肤细胞，黑色素细胞从神经嵴衍生并且表达全组分的信号蛋白。尤其是，细胞表达非常广的G蛋白范围，且几乎可以功能性表达所有的GPCRs。
黑色素细胞可用来鉴别化合物，包含天然配体，GPCRs激动剂。此方法可由引导能分配或聚集色素的色素细胞系的测试细胞对特殊刺激应答并且表达编码GCPR的内源性克隆实施。如果GPCR的活化诱导色素分散，活化刺激剂，例如黑色素，将色素沉积设定在试验细胞内色素最初分配的状态。如果GPCR的活化诱导色素聚集，用活化刺激剂细胞将最初的色素沉积设定在色素分散的位置。将测试细胞接着与化学化合物接触，并且确定细胞中的色素沉积是否从色素沉积的最初状态改变。由于候选化合物，包含但不限制偶联至GPCR的配体，引起的色素细胞的分配培养皿中变暗，同时色素细胞的聚集将变亮。
材料与方法随后参考美国专利5462856及美国专利6051387。这些专利的公开内容在此处全部引入作为参考。
细胞在96孔板(一种受体/板)中铺板。转染后48小时，对每一板的一半的细胞用10nM黑色素处理。黑色素活化黑色素细胞内源性Gi结合受体，并造成其色素聚集。剩下一半的细胞转移至无血清培养基0.7X L-15(Gobco)。一小时后，在无血清培养基中的细胞保持在色素分配状态，同时黑色素处理的细胞在色素聚集状态。在这一点上，细胞用反应剂量的候选化合物处理。若平板的GPCRs与候选化合物结合，黑色素细胞将经历对化合物反应的颜色改变。若受体为Gs或Gq偶联受体，且若候选化合物为激动剂，接着黑色素聚集的黑色素细胞将经历色素分配。相反，若受体为Gi偶联受体，且若候选化合物为激动剂，那么色素分散的细胞将经历取决剂量的色素聚集。
实施例9人类RUP41的组织分布A.AFFYMETRIX GENECHIP技术氨基酸序列提供给Affymetrix使用GeneChip技术用于设计及制造包含寡核苷酸的微阵列从而监控G蛋白偶联受体(GPCRs)的表达水平。同时微阵列上存在源于Harvard Brain Band或市售获得的特定人脑组织探针。根据厂商的说明书对RNA样品扩增，标记，杂交至微阵列，并杂交至微阵列，并且进行数据分析。
使用GeneChip，研究人类RUP41的表达谱。参见图2A图。图2A为表示在各种组织中人RUP41的表达水平的图。对这些图的检查显示RUP41表达于大脑及心脏中。在远离大脑的组织中，RUP41由心脏选择性表达。选择性表达的RUP41给由RUP41的调节物可能的副作用提供较少的机会。
点状图(图2B)及Northern印迹(图2C)结果符合GeneChip的结果。
B.RT-PCRRT-PCR应用至人RUP41表达的研究。使用的寡核苷酸为RUP41特异性的，并且使用cDNA作为模板。Taq DNA聚合酶(Stratagene)被用来根据说明书在40μl的反应物中进行扩增。PCR条件为96℃ 2分钟，随后96℃ 30秒，55℃ 30秒及72℃ 2分钟30循环，随后72℃10分钟。20μl的反应物装载于1.5％琼脂胶以分析RT-PCR产物。
5’PCR引物序列5’-GTAATAATTGCCCTCCGGCGAGC-3’(SEQ ID NO11)。
3’PCR引物序列5’-CTAGTCTGTGACAACCTGAGG-3’(SEQ ID NO12)。
扩增的DNA片段为390个碱基对大小。
通过说明的方式，人RUP41的RT-PCR显示于图7，之后，充血性心衰竭病人心脏组织的RUP41表达与正常心脏功能病人的心脏组织的RUP41表达进行比较。
本领域技术人员可以类似地对小鼠RUP41及大鼠RUP41进行RT-PCR形成。
C.Northern印迹人类RUP41表达的Northern印迹分析由本领域技术人员的步骤产生。对应于SEQ ID NO1的核苷酸1,104-1,538的人RUP41编码区片段用作探针。
实施例10原位杂交成年大鼠心脏的RUP41表达原位杂交证实成年大鼠心脏中心肌的广泛表达(见图3)。反义RUP41放射性标记的探针检测到所有心室中RUP41的表达。反义对照(GAPDH)及心房特异性(心钠素，ANF)探针被用于其它部分从而证实了心脏部分探针标记的特异性。
原位杂交固定的心脏组织包埋入50∶50的OCT∶Aqua Mount(VWR，#41799-008，West Chester，PA)混合物中并且冷冻于干冰/乙醇中。块状物保持在-80℃直到冷冻切片，这时制备10微米的连续切片。在冷冻切片后，将组织切片在密封盒中储存在-20C。
SEQ ID NO6的大鼠RUP41的多核苷酸亚克隆于PCRII-TOPO载体中(Invitrogen，Carlsbad，CA)SP6及T7启动子侧接的位点。与Seq ID NO6的多核苷酸互补的[35S]-放射性标记的反义大鼠RUP41mRNA探针使用Promega RiboProbe转录试剂盒(#P1460；Madison，WI)的SP6 RNA聚合酶制备，最好如操作说明。对照放射性标记的有义探针类似使用T7 RNA聚合酶制备。
固定的组织切片解冻并在室温下进行一系列的固定后温育PBS 3分钟；10％福尔马林10分钟；PBS 10分钟；及PBS 10分钟。
组织切片接着进行渗透作用及酰化作用。之后，组织切片用K蛋白酶(0.001％K蛋白酶的0.5M Tris，0.25M EDTA溶液，pH8.0)在37℃下温育10分钟，随后在室温下用水清洗5分钟。组织切片接着在室温下用三乙醇胺缓冲溶液(0.1M TEA，pH8.0)培养5分钟，随后在0.1M TEA pH8.0中的2.5％醋酸酐中培养5分钟。组织切片接着在室温下以2X SSC；50％乙醇；95％乙醇；及100％乙醇各温育2分钟。组织切片接着风干并保持干燥直到后几天的杂交。
组织切片在60℃，0.47M氯化钠，54％甲酰胺以每切片80至100μl的体积杂交20小时。放射性标记的探针使用浓度为1×107cpm/毫升。组织切片接着以4X SSC在室温下清洗4次，每次10分钟。未杂交探针用RNAse A(20μg/毫升于0.5M氯化钠，10mM Tris，1mM EDTA，pH8)在37℃培养30分钟进行降解。组织切片接着以2X SSC在室温下清洗2次，每次5分钟，随后以1X SSC在室温下清洗10分钟，随后以0.5X SSC在室温下清洗10钟。组织切片以0.1X SSC在65℃下清洗30钟，随后以0.1X SSC在室温下清洗5钟，随后以酒精脱水。
经过杂交的组织切片接着暴露于X射线膜且通过放射性自显影观察RUP41杂交信号。之后，组织切片暴露于Biomax MR膜1天，4天，然后1星期。在放射性自显影后，组织切片使用NTB-2液体感光乳化剂浸泡。乳化剂浸泡的组织切片暴露在乳化剂1星期并且显影。在显影后，组织切片用bisbenzimide(0.001％于PBS)进行反染色并且加盖。组织切片使用超聚光镜(银颗粒显现白色)及DAPI过滤体(观察bisbenzimide反染色)成象。
相同的方法使用放射性标记并且杂交于由部分大鼠GAPDH及心钠素(ANF)序列产生的探针。
实施例11肥大的新生鼠心室心肌的RUP41下调控新生鼠心室心肌(NRVMs)如前所述进行制备[Adams，JW等人，J Biol Chem(1996)2711179-86；其内容全部在此处引入作为参考其内容全部在此处引入作为参考]。简言之，心脏从1至2天龄SD出初生大鼠获得且以胶原酶消化，心肌通过Percoll梯度进行纯化。细胞置于用0.1％明胶预先覆盖以及添加了10％马血清，5％新生牛血清，及抗体(100单位/毫升青霉素及100μg/毫升链霉素)的4∶1DMEM/培养基-199中保持过夜的组织培养盘上。在培养基中培养18小时后，心肌用维持培养基(DMEM/培养基-199加抗菌素)清洗以除去死掉细胞及碎片且在实验期间用维持培养基再次更换。
图4A RT-PCR证实的新生鼠心室心肌(NRVMs)中RUP41转录本的维持在无血清情况下24小时。随后添加脱羟肾上腺素(PE)或新生牛血清(NCS)至培养基后24小时，RUP41转录本的含显著下降，且与显型肥大有关。脱羟肾上腺素使用浓度为100μM(加2μM阻断β肾上腺受体，且因此可以选择活化α肾上腺受体)。新生牛血清使用浓度为10％。G3PDH PCR产物证实相当于用于PCR反应的模板量及胶负载量。
RT-PCR从如上描述于NRVMs分离的总RNA被用作根据说明书，利用RTPCR试剂盒(Becton Dickenson)产生反转录DNA(RT-DNA)的模板。由PCR测定RT-DNA样品中RUP41表达。PCR条件为96℃ 2分钟，随后96℃ 30秒，55℃ 30秒及72℃ 2分钟30循环，随后72℃ 10分钟。20μl的反应物负载于1.5％琼脂糖胶以分析RT-PCR产物。
5’PCR引物序列5’-GTAATAATTGCCCTCCGGCGAGC-3’(SEQ ID NO11)。
3’PCR引物序列5’-CTAGTCTGTGACAACCTGAGG-3’(SEQ ID NO12)。
扩增的DNA序列为390碱基对。
图4B.Northern印迹证实以增肥剂处理，包含脱羟肾上腺素(PE)，佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)，前列腺素F2α(PGF2α)的肥大剂以及小牛血清(NCS)处理24小时后NRVMs中RUP41 mRNA表达水平的降低。脱羟肾上腺素使用100μM(加2μM至阻断β肾上腺受体，且因此允许α肾上腺受体的选择性。佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯使用100nM。前列腺素F2α使用1μM。新生牛血清使用10％。心房利钠因子(ANF)，一种心肌肥大基因标志相应所有肥大刺激上调。28S rRNA的亚甲基蓝染色证实完整性及相同的RNA负载。
Northern印迹分析分离1-2天龄的大鼠(SD)心房心肌(NRVMs)且如先前所述放置于培养盘上。多种处理后，根据厂商的说明书利用Trizol试剂(Invitrogen)分离总RNA。15毫克的总RNA在含琼脂糖凝胶的甲醛上通过电泳方式分离并转移至PVDF膜(Amersham)。对应于SEQ IDNO6的核苷酸53-488的大鼠RUP41编码区片段被用作Northern印迹分析的探针。使用标准方法产生32P标记的探针且在55℃杂交至膜上。膜在高严格条件下清洗且在-80℃暴露至X射线膜2-4天。
实施例12过度肥大压迫的小鼠心脏实验种RUP41的下调图5上。RUP41 mRNA在过度心脏肥大压迫的体内小鼠模型中的下调。Northern印迹分析在从横向主动脉收缩(TAC)或双盲操作7天的小鼠(SHAM)左心室分离的总RNA上进行。增加的ANF表达证实TAC心脏确实发生肥大反应。28S rRNA的亚甲基蓝染色证实了RNA的完整性及相等的负载。对应于SEQ ID NO4核苷酸775-1269的小鼠RUP41编码区片段被用作Northern印迹分析的探针。使用标准方法产生32P标记的探针且在55℃杂交至膜上。膜在高严格条件下清洗且在-80℃暴露至X射线膜2-4天。
5图下。RUP41信号用光密度分析并标准化至28S rRNA信号。*Anova统计分析的6个双盲及6个TAC样品证实RUP41 mRNA显著降低，P＜0.00005。
横向主动脉收缩(TAC)小鼠横向主动脉手术收缩完成如前述(Rockman等人，Proc NatlAcad Sci.1991 9月15日；88(18)8277-81)。简言之，8周龄小鼠(C57/BL6)以氯胺酮及甲苯噻嗪混合麻醉。在显微解剖下，切开中线颈由显微术使导管及颈动脉管呈现。在成功气管内插管后，插管连接至一定体积的cuylced啮齿类换气装置(Harvard Apparatus)，以0.2毫升氧供应且呼吸率为110/分钟。穿过一个小切口胸腔进入左上胸骨边缘的第二肋间，且当针移动时，由系上一个以27标准针的7-0耐龙缝合线产生一个窄0.4cm直径并且产生65至70％的可回复横向主动脉压缩(TAC)完成主动脉压缩。绑住气胸的主动脉后进行排空，并且将动物的插管移开且使其恢复。
实施例13组织缺氧的NRVMs中RUP41的下调Northern印迹证实在组织缺氧6小时的NRVMs分离的总RNA中RUP41 mRNA量的降低(图6)。在缺氧后复氧24小时(H6/R24)后RUP41 mRNA恢复至对照(正常)水平。c-fos表达(缺氧-6)增加证实心肌对缺氧条件的胁迫应答。28S rRNA的亚甲基蓝染色证实了RNA的完整性及相等的负载。对应于SEQ ID NO6核苷酸53-488的大鼠RUP41编码区片段被用作Northern印迹分析的探针。使用标准方法产生32P标记的探针且在55℃杂交至膜上。膜在高严格条件下清洗且在-80℃暴露至X射线膜2-4天。
NRVMs的缺氧处理描述于Van Heugten等人，J Mol CellCardiol(1994)261513-24，其内容全部在此处引入作为参考。简言之，使用灌注了95％N2及5％CO2的密闭培养箱实现组织缺氧。在缺氧处理一段时间后，细胞从腔室移出至周遭空气且用无血清DMEM/F12培养基更换培养基。见下列的实施例17。
实施例14充血性心衰竭人类的RUP41下调图7A。在人心脏分离的总RNA上进行RT-PCR。RUP41转录量在充血性心衰竭(CHF)病人较正常心脏功能(正常)病人的RNA中降低。将人类GAPDH引物添加至每一个PCR反应作为模板浓度及负载量的内部对照。
图7B。*Anova统计分析证实CHF病人的RUP41转录本水平较正常人显著下降，p＜0.05。心肌梗塞(MI)病人的RUP41转录本水平与正常心脏不同。
人类心脏疾病样品对市售获得的(Clinomics)诊断具有正常心脏功能的人，充血性心衰竭(CHF)，及心肌梗塞(MI)的病人解剖的心脏提取的总RNA进行RT-PCR(如上)。RUP41表达的相对量在GAPDH校准至内部对照后每一群体中进行确定。
实施例15COS-7细胞中Gi偶联至RUP418图上。COS-7细胞用pCMV-HARUP41(HA-RUP41)或pCMV-HA骨架(CMV)以及组成性活化的Gs偶联的甲状腺刺激激素受体(pCMV-TSHR-A6231)共转染。[HARUP41对应于红血球凝集素(HA)-标记的RUP41]。另外，CRE-萤光酶受体构建体在百日咳毒素(PTX)存在或不存在的条件下共转染以确定cAMP活化途径的活性。细胞中共表达CART-TSHR及HARUP41的萤光素酶报告活性较共表达CART-TSHR及pCMV-HA对照的细胞低，显示RUP41与Gi偶联。用PTX处理抑制由RUP41引起的cAMP降低证实了Gi与此受体的偶联。
8图下。在百日咳毒素(PTX)存在或不存在下COS-7细胞与pCMV-HA(CMV)或pCMV-HARUP41(HA-RUP41)构建体共转染。Forskolin(uM)刺激的增加cAMP量由RUP41表达抑制。用PTX处理抑制由RUP41引起的cAMP降低证实了Gi与此受体的偶联。
RUP41受体构建体编码SEQ ID NO3的人RUP41多肽的氨基酸2-433的多核苷酸连接入pCMV-HA用于瞬间转染表达的研究。
瞬时转染使用5’-HA标记的RUP41表达构建体(HA-pCMVRUP41)进行DNA的转染。简言之，使用厂家说明书(Roche)所述的Fugene-6转染剂将HA-pCMVRUP41转染入在室斜面上铺板的COS-7或HEK细胞中。5’-HA标记的GPR(孤儿GPCR；GenBank登录号NM_007223)及HA-pCMV载体转染至COS-7及HEK细胞作为对照。
cAMP测定在用RUP41表达质粒转染COS-7细胞24小时后，以PBS清洗，且在收获细胞前培养于无血清有或无100ng/毫升PTX的培养基中37℃下18小时用于FlashPlate分析(PerkinElmer)，cAMP的量根据厂家的说明书进行检测。
CRE-萤光酶报告分析在用pCMVRUP41及TSHR-A6231COS-7表达质粒(TSHR-A6231RUP41(或CNV)DNA比＝1∶7(w/w)共转染后24小时，以PBS清洗细胞，并在根据厂家的说明书使用LucLite萤光酶报告分析试剂盒(Parkard)进行CRE报告分析前培养于无血清有或无100ng/毫升PTX的培养基中37℃下18小时用于FlashPlate分析(PerkinElmer)，cAMP的量根据厂家的说明书进行检测。
实施例16腺病毒介导的RUP41的过量表达促进NRVMs的存活图9A。NRVMs用由每细胞噬斑形成单位(PFU)的病毒滴度限定的多重感染的编码RUP41(AdRUP41)的重组腺病毒处理。腺病毒感染后24小时，分离总RNA且将Northern印迹分析用来确定病毒表达RUP41的水平。在50PFU/细胞RUP41时可以检测到表达，但高水平表达显示在100PFU/细胞。
图9B。感染AdRUP41以100PFU/细胞48小时的NRVMs证实在无血清培养基中细胞存活率的增加。NRVMs用与德州红结合的phalloidin及Hoechst33342共染色。
RUP41载体构建体为了腺病毒实验，在腺病毒RUP41(AdRUP41)重组体产生前将编码SEQ ID NO3的人RUP41多肽的多核苷酸亚克隆到pShuttleCMV(Qbiogene)中。
腺病毒感染带有腺病毒载体的NRVMs的感染如先前所述[Adams JW等人，Circ Res(2000)871180-7；其内容全部在此处引入作为参考]。简言之，在存在血清的条件下将NRVMs培养于薄覆盖(3.5毫克/cm2)腔室斜面上(Nunc)过夜，在腺病毒感染前在不含血清的培养基中清洗及培养额外的8小时。在0.1至500PFU/细胞的剂量范围中，最理想的多重感染(MOI)被确定为50至100的噬斑形成单位(PFU)/细胞。在AdRUP41或对照编码GFP(AdGFP)的腺病毒感染后的最初48小时，50PFU/细胞的MOI产生大于95％的感染效应(如由感染这种对照病毒的NRVMs中确定GFP表达)通式没有任何细胞毒作用。
实施例17过量表达RUP41挽救NRVMs免于组织缺氧/复氧引起的细胞凋亡寡核小体DNA断裂分析(又称途径)证实在缺氧(8小时)后复氧(24小时)刺激用对照(AdGFP)腺病毒以100PFU/细胞浓度感染的NRVMs(H8/N24)细胞凋亡的增加。然而，腺病毒介导的SEQ ID NO3的人RUP41多肽(100PFU/细胞)的过量表达降低了由血清损失(正常含氧量)及缺氧后复氧(H8/N24)诱导的DNA的断裂水平(图10)。
组织缺氧/复氧分离的NRVMs在有血清(10％FBS，5％HS)的条件下过夜培养，接着在缺氧处理前24小时用无血清培养基DMEM-F12(Sigma)更换培养基。利用密闭的灌入95％N2及5％CO2的培养箱实现缺氧[VanHeugten等人，J Mol Cell Cardiol(1994)261513-24，结合于此]。在缺氧处理一段时间后，从腔室移出细胞到环境中并且更换无血清DMEM/F12培养基。
DNA断裂根据厂家的说明书(Gentra)利用PUREGENE DNA分离试剂盒从NRVMs分离DNA。等量DNA在2％琼脂糖凝胶上分离通过用溴化乙碇染色在紫外光下进行检测。
实施例18保护心脏本发明的调节物可以利用Fryer等人的体内大鼠模型显示出保护心脏作用[Circ Res(1999)84846-51；其内容全部在此处引入作为参考]。所述调节物由腹膜内注射施用。优选剂量为0.1至100mg/kg。其它优选剂量选自0.1mg/kg；0.3mg/kg；1.0mg/kg；3.0mg/kg；30mg/kg；及100mg/kg。安慰剂组只施用介质。在一些实施方案中，所述调节物为激动剂。
350至450克的雄性Wistar大鼠被用于该研究的所有阶段。手术之前1，12，24，48，或72小时经腹膜内注射给大鼠施用上述调节物或生理盐水。随后，大鼠经由腹膜内施用thiobutababital sodium(Inaction，Research Biochemical International；100毫克/公斤)进行麻醉。实施气管切开术，且气管用连接啮齿类呼吸机(CIV-101型，Columbus Instruments，或683型，Harvard Apparatus)的插管插入。大鼠在室温下以60至65次呼吸/分钟提供氧气。通过维持正末呼气压在5至10毫米水预防肺不张。对动脉pH，PCO2，及PO2通过控制在15分钟吸留气体，以及60分钟和120分钟的血液气体系统再灌注(AVL995pH/血液气体分析仪，AVL Medical Instruments)进行监控，且通过校正呼吸频率及/或潮流气维持在正常生理范围(pH7.35至7.45；PCO2为25至44毫米汞柱；及PO2为80至110毫米汞柱)。体温通过使用加热垫维持在38℃，根据需要静脉内施用重碳酸盐从而维持动脉血液pH在正常生理范围内。
右侧颈动脉被插管经由连结至Grass(模型7)多波扫描器的GouldPE 50或GOULD PE 23压力转换器测量血压及心率。右侧颈静脉插管被灌入生理盐水，重碳酸盐及药物。再第五肋间进行左侧开胸术，然后进行心包切开术，并且调节左侧二尖瓣附件显示出左侧冠状动脉的位置。结扎线(6-0丙烯)从左侧二尖瓣附件下的紧邻区域穿过冠状动脉以下进入左心室的右部分。缝合末端穿过丙烯管形成勒除器。冠状动脉由拉紧缝合末端阻断并用止血钳在心外膜表面上强压勒除器。冠状动脉阻断通过心外膜发绀证实，且随后血压降低。心脏再灌注经由放开止血钳以及松开勒除器启始，并且通过肉眼观察心外膜充血反应证实。在实验方案开始前稳定心率及血压。
大鼠随机分配于设计的实验组中。对照大鼠局部缺血前30分钟及再灌注2小时前施用生理盐水24小时(I/R)。为了显示由上述调节物诱导的急性心血管保护，所述调节物在延长缺血损伤施用1小时。为了显示针对急性缺血损伤的延迟心血管保护，所述调节物在I/R前以给定的剂量施用12或24小时。所述调节物在I/R前以给定的剂量施用48或72小时。
在完成上述方案的过程中，阻断冠状动脉，经颈静脉施用专利蓝色染剂阴性染色确定危险区(AAR)。大鼠以15％氯化钾实施安乐死。取出心脏，左心室从剩余组织解剖出来，随后切成6片薄-横切片。从而可以描绘出正常区，染色蓝色，与AAR，其随后保持粉红色。从非缺血区取出危险区，组织置于分离的小药瓶中并用1.0％2，3，5-三苯基四唑化氯(TTC)染色剂的100mmol/L磷酸缓冲溶液(pH7.4)于37℃温育15分钟。TTC为活以及非活性组织的指示剂。TTC由存在于活心肌中的脱氢酶还原，且产生甲腊(formazan)沉淀，其诱导深红色，反之梗塞区保持灰色{Klein等人，Virchows Arch[Pathol Anat](1981)393287-97}。组织储存于10％甲醛药瓶中过夜，且梗塞心肌在解剖显微镜下从AAR解剖出(Cambridge Instruments)。梗塞大小(IS)，AAR，及左心室重(LV)由重量分析确定。AAR被表达为LV(AAR/LV)％，并且IS被表达为AAR(IS/AAR)％。
如果大鼠表现出严重的低血压(＜30毫米汞柱收缩压)或者如果由于新陈代谢的酸中毒或碱中毒不能将充分的血液气体值保持在正常生理范围，就将这些大鼠从数据分析中排除。
全部数值表现为平均值±标准偏差。单向ANOVA的Bonferroni检验被用来确定是否在血液动力力学，IS及AAR小组中存在任一显著的差异。显著差异在P＜0.05下确定。IS/AAR减少表示新血管的保护。
实施例19口服生物可利用率直接估计口服生物可利用率的内科分析方法为已知技术且可被使用[参见例如但不限于Wang PC等人，Cardiovase Drug Rev(2002)20137-52；及Buchan P等人，Headache(2002)Suppl2S54-62；其内容全部在此处引入作为参考]。进一步说明性但非限制性的方式，所述其它分析方法可包含液相层析-串联质谱分析仪[Chavez-Eng CM等人，J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767117-29；Jetter A等人，Clin Pharmacol Ther(2002)7121-9；Zimmerman JJ等人，J Clin Pharmacol(1999)391155-61；及Barrish A等人，Rapid CommunMass Spectrom(1996)101033-7；其内容全部在此处引入作为参考]。
正电子发射断层扫描已经被成功用于(PET)直接获得口服药物后哺乳动物体内药物分布，包括生物可利用率的测定结果[Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)291031-8；其内容全部在此处引入作为参考]。
或者，本发明调节物的口服生物可利用率可在体内数据基础上确定，例如但不限于通过实施例18的老鼠模型。调节物由口服喂入的剂量范围为0.1mg kg-1至100mg kg-1。调节物口服施用显示出对心血管的保护作用。调节物的效果显示出是剂量依赖性的并且可与腹膜内施用后的效果相媲美。通过口服达到IS/AAR的一半最大减少的调节物剂量可与通过腹膜内施用达到IS/AAR的一半最大减少的调节物剂量相媲美。通过说明的方式，若所述口服剂量为腹膜内剂量的2倍，那么调节物的口服生物利用率为50％。更一般地，若所述口服剂量为θmg kg-1且腹膜内剂量为ρmg kg-1，则调节物的口服生物利用率为[(ρ/θ)×100]。
本领域普通技术人员可以很容易地明白，本发明调节物的口服生物利用率的确定除了本发明说明而非限制性列举的方法外，可使用体内动物细胞模型实现。本领域普通技术人员可以很容易地明白所述口服生物利用率的生物活性的读数除了是IS/AAR还可以是参数。很容易想象施用的参考途径可以是腹膜内施用以外的途径。在一些实施方案中，所述施用参考路径可为静脉内注射施用。
在一些实施方案中，本发明调节物的口服生物利用率为腹膜内注射的至少1％，至少5％，至少10％，至少15％，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，或至少45％。
实施例20表达人RUP41 GPCR构成的转基因小鼠/大鼠/猪本发明也提供了与表达人RUP41 GPCR的转基因非人哺乳动物的方法及组合物，所述RUP41 GPCR包含的多肽选自(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的多肽；其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被赖氨酸取代；(c)SEQ ID NO3的多肽；以及(d)SEQ ID NO3的多肽；其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被赖氨酸取代。
在一些实施方案中，所述非人哺乳动物为小鼠，大鼠或猪。
制备转基因动物诸如小鼠、大鼠以及猪的方法是本领域普通技术人员公知的，并且任何这样的方法可被用于本发明。简要地，转基因哺乳动物可通过例如，用具有编码人RUP41 GPCR的多核苷酸(“转基因”)转染多能干细胞诸如ES细胞进行制备。成功转化的ES细胞然后被导入到早期胚胎中，然后植入到同种哺乳动物的子宫中。在某些情况下，转化的(“转基因的”)细胞将包括所产生动物胚系的一部分且含有胚系转基因细胞的成年家畜然后与其它动物交配，由此最后生产出具有它们细胞中的转基因的转基因动物的种群，而且可以将转基因稳定地遗传给它们的任意一个后代。其它导入多核苷酸的方法可被使用，例如通过显微注射导入编码人RUP41 GPCR的多核苷酸到受精卵或早期胚胎中。或者，可通过用含有转基因的逆转录酶病毒传染受精卵将转基因导入到动物中[Jaenisch，R，Proc Natl Acad Sci USA(1976)731260-4]。转基因哺乳动物的制造方法描述在，例如，Wall等，J CellBiochem(1992)49113-20；Hogan等，Manipulating the Mouse Embryo.ALaboratory Manual.(1986)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.；Costa等，FASEB J(1999)131762-73；WO91/08216；美国专利4,736,866；以及美国专利6,504,080；每个的内容全部引入作为参考。
在一些实施方案中，所述人RUP41 GPCR的表达是心肌细胞-选择性的。在特定实施方案中，所述所述人RUP41 GPCR的心肌细胞-选择性表达被通过α肌球蛋白重链启动子启动[Subramaniam A等，JBiol Chem(1991)26624613-20；其内容在这里全部引入作为参考]。
实施例21心脏保护的体内转基因动物模型本发明化合物可以显示出具有利用实施例20中描述的体内转基因动物模型进行心脏保护的作用。在特定实施方案中，所述动物为小鼠、大鼠或猪。
所述化合物可以通过，施用所述化合物给所述转基因动物，以及测定是否所述施用导致实施例18的体内大鼠模型或小鼠体内模型或类似的猪的IS/AAR相对于所述单独施用载体的转基因动物的IS/AAR有所减少进行评价。
在优选的实施方案中，所述化合物为本发明的调节物。在一些实施方案中，所述调节物降低cAMP的胞内水平。在一些实施方案中，所述调节物为激动剂。在一些实施方案中，所述化合物被通过腹膜内注射施用。优选的剂量为0.1-100mg/kg。其它优选的剂量选自0.1mg/kg，0.3mg/kg；1.0mg/kg；3.0mg/kg；10mg/kg；30mg/kg and 100mg/kg。安慰剂为单独施用的介质。在一些实施方案中，所述剂量每天施用。在一些实施方案中，所述剂量被施用持续下述的时间段一周、两周、三周以及四周。应指出这些给药途径、剂量范围、施药频率以及给药持续时间是例证性的且不是对本发明的限制。
实施例22RUP41基因敲除的小鼠/大鼠/猪小鼠优选的DNA构建体将包括，从5′-末端到3′-末端(a)包含在小鼠RUP41基因组序列中的第一核苷酸序列；(b)含有阳性选择标记诸如新霉素抗性(neo)标记的核苷酸序列；以及(c)包含在小鼠RUP41基因组序列中且位于第一小鼠RUP41核苷酸序列(a)的基因组下游的第二核苷酸序列通过本领域普通技术人员公知的方法分离小鼠RUP41基因组序列(Maniatis T等，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)ColdSpring Harbor Laboratory；其全部内容引入作为参考)。用于分离小鼠RUP41基因组的探针来自编码小鼠RUP41多肽的cDNA，其中所述的cDNA可利用来自小鼠心脏、肺或脂肪组织的模板mRNA获得。
在优选的实施方案中，这些DNA构建体也含有位于核苷酸序列(a)上游或核苷酸序列(c)下游的阴性选择标记。优选地，阴性选择标记包括胸苷激酶(tk)基因[Thomas等，Cell(1986)44419-28]，潮霉素β基因[Te Riele等，Nature(1990)348649-51]，hprt基因[Van der Lugt等，Gene(1991)105263-7；Reid等，Proc Natl Acad Sci USA(1990)874299-4303]或Diptheria毒素A片段(Dt-A)基因[Nada等，Cell(1993)731125-35；Yagi等，Proc Natl Acad Sci USA(1990)879918-9922]，其内容整体引入作为参考。优选地，阳性选择标记位于小鼠RUP41外显子序列内，中断了编码小鼠RUP41多肽的序列。这些置换型载体被描述在，例如，Thomas等，Cell(1986)44419-28；Thomas等，Cell(1987)51503-12；Mansour等，Nature(1988)336348-52；Koller等，Annu Rev Immunol(1992)10705-30；以及美国专利5,631,153；其内容整体引入作为参考。
第一和第二核苷酸序列(a)和(c)可随意地位于小鼠RUP41调节序列，内含子序列，外显子序列或含有调控和/或内含子和/或外显子序列的序列的中间。核苷酸序列(a)和(c)核苷酸序列的大小为1到50kb，优选地从1到10kb，更优选地2到6kb，且最优选地2到4kb。
制备含有选择性基因敲除的小鼠的方法是本领域普通技术人员公知的，且已经成功地使各种基因失活。
大鼠对于大鼠的基因靶向技术为比用于小鼠的更为不实用且是很有积极兴趣的研究区域。一种方法是使大鼠胚胎干细胞(ESC)类细胞中的大鼠RUP41基因失活，则然后在两个细胞晶胚融合后将具有失活的大鼠RUP41基因的细胞注射到大鼠胚囊中[Krivokharchenko等，MolReprod Dev(2002)61460-5]。
在严格杂交条件下利用大鼠RUP41多核苷酸SEQ ID NO6筛选大鼠基因组文库来鉴定大鼠基因。通过在类似条件下筛选大鼠心脏或脑cDNA文库来鉴定全长的或大体上全长的大鼠RUP41 cDNA。严格核酸杂交的条件是本领域普通技术人员公知的[Maniatis T，等(1982)Molecular CloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NewYork]。
另一种可选的方法是将大鼠ESC类细胞中的大鼠RUP41基因失活，然后将具有失活的大鼠RUP41基因的大鼠ESC类细胞的核转移到去核的卵母细胞中[Sato K等，Hum Cell(2001)14301-4；Wakayama andYanagimachi，Semin Cell Dev Biol(1999)10253-8；Hochedlinger andJaenisch，Nature(2002)4151035-8；Yanagimachi；Mol Cell Endocrinol(2002)187241-8；其内容在这里全部引入作为参考]。
中描述的类似或可选的用于小鼠的方法可用来制备RUP41的基因敲除大鼠。
猪类似的或可选择的方法可用来制备RUP41的基因敲除猪[参见，例如，Lai等，Science(2002)2951089-1092；其内容在这里全部引入作为参考]。
CRE-LoxP系统含有选择性RUP41基因敲除心肌细胞的小鼠/大鼠/猪小鼠这些新的DNA构建体利用P1噬菌体的位点特异性重组系统。P1噬菌体具有称为Cre的重组酶，其与34碱基对loxP位点相互作用。loxP位点含有两个通过8bp保守序列分离的13bp回文序列[Hoess RH等，Nucleic Acids Res(1986)142287-300；其内容在这里全部引入作为参考]。具有相同取向的两个loxP位点之间通过Cre酶进行的重组导致DNA片段的缺失。
与同源重组技术联合使用的Cre-loxP系统首先被Gu等人所描述[Gu H等，Cell(1993)731155-64；Gu H等，Science(1994)265103-6；其内容整体引入作为参考]。简而言之，待插入基因组目标位置的目的核苷酸序列具有至少两个在相同方向上的loxP位点，且位于待由重组体基因组切除的核苷酸序列的相应末端。切除作用需要重组细胞宿主的核内重组酶(Cre)的存在。重组酶可在期望的时间产生通过(a)在含有这些酶的培养基中温育重组细胞，通过直接注射Cre酶到目的细胞中，诸如通过酶脂转染到细胞中，诸如Baubonis等描述的[Baubonis W和Sauer B，Nucleic Acids Res(1993)212025-9；其内容在这里全部引入作为参考；(b)用含有与重组细胞中功能性启动子可操作地连接的Cre编码序列的载体转染细胞宿主，其中启动子任选地是可诱导的，所述载体被导入到重组细胞宿主中，诸如描述在[Gu H等，Cell(1993)731155-64；其内容在这里全部引入作为参考]以及Sauer等[Sauer Band Henderson N，Proc Natl Acad Sci USA(1988)855166-70；其内容在这里全部引入作为参考]；(c)将含有与重组细胞中功能性启动子可操作地连接的Cre编码序列的多核苷酸导入到细胞宿主中，其中启动子是任选可诱导的，且所述多核苷酸被导入到细胞宿主的基因组中通过随机插入或者同源重组，诸如Gu等[Gu H等，Science(1994)265103-6；其内容在这里全部引入作为参考]描述的。
利用Cre-loxP系统的载体和方法被描述在，例如，Zou等(1994)；Minamisawa S等，J Biol Chem(1999)27410066-70；Chen等，J BiolChem(1998)2731252-6；Chen等，Development(1998)1251943-9；每一个的内容在这里整体引入作为参考]。
在本发明优选的实施方案中，Cre被引入细胞宿主的基因组通过上述的策略(c)，其中所述的启动子是心肌细胞选择性的并导致小鼠RUP41基因组序列的心肌细胞-选择性断裂(loxP侧接的；“floxed”)。在一些实施方案中，所述心肌细胞-选择性启动子是肌球蛋白轻链2(mlc-2v)的心室特异性同种型的[Minamisawa S等，J Biol Chem(1999)27410066-70；Chen等，J Biol Chem(1998)2731252-6；每一个的内容在这里整体引入作为参考]。含有插入Cre重组酶编码序列到内源性mlc-2v位点中的转基因小鼠(“mlc-2v cre敲除小鼠”)已被描述在[Chen等，Development(1998)1251943-9；其内容在这里全部引入作为参考]。插入选择性基因的方法在本领域普通技术人员的知识范围内[参见，例如，Chen等，Development(1998)1251943-9]。
在一些实施方案中，本发明描述了一种制备含有RUP41基因的心肌细胞-选择性敲除的小鼠的方法，包括将floxed RUP41基因与上述的mlc-2 cre等位基因杂交。
其它制备含有RUP41基因心肌细胞-选择性敲除的小鼠的方法是本领域普通技术人员公知的；参见，例如，Kuhn R和Torres RM，Methods Mol Biol(2002)180175-204；Sauer B，Methods(1998)14381-92；Gutstein DE等，Circulation Research(2001)88333；Minamino T等，Circulation Research(2001)88587；和Bex A等，J Urol(2002)1682641-2644；其内容在这里全部引入作为参考。
大鼠类似的或可选择的方法[参见，例如，Zan等，Nature Biotechnology(2003)21645-51；其内容在这里全部引入作为参考]可用来制备含有RUP41基因敲除的大鼠。
猪类似的或可选择的方法可用来制备含有RUP41基因心肌细胞-选择性基因敲除的猪[参见，例如，Lai等，Science(2002)2951089-1092；其内容在这里全部引入作为参考]。
本申请通篇引用了各种出版物、专利以及公开的专利申请。本申请中引用的这些出版物、专利以及公开的专利申请的内容被在这里整体引入作为参考。本领域技术人员可理解，对本发明进行的改进和延伸被包括在上述的发明内容以及权利要求的范围之中。
序列表<110>阿瑞那制药公司(Arena Pharmaceuticals，Inc.)<120>治疗缺血性心脏病及充血性心衰竭的人类G蛋白偶联受体及其调节物(HUMAN G PROTEIN-COUPLED RECEPTOR AND MODULATORS THEREOF FOR THETREATMENT OF ISCHEMIC HEART DISEASE AND CONGESTIVE HEART FAILURE)<130>SCT050074-47<150>US 60/400,774<151>2002-08-01<160>12<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1881<212>DNA<213>Homo sapien<400>1gttatttctt caaaaggaaa acacaatttt cttttatatc aaaacaatgc aaacttgatg 60gttcttaatt ctacattttc tattaatagt ttacaaactt aaaaattaaa ctaagtacac 120aattgaaaga tttttttttc ttacaaagaa cacgttatac gtcatttaaa ttgccaaata 180tcaaatagtt tattctattt cactttctag ggaaaaaaac caactgctcc aaaagaatgt 240gtttttctcc cattctggaa atcaacatgc agtctgaatc taacattaca gtgcgagatg 300acattgatga catcaacacc aatatgtacc aaccactatc atatccgtta agctttcaag 360tgtctctcac cggatttctt atgttagaaa ttgtgttggg acttggcagc aacctcactg 420tattggtact ttactgcatg aaatccaact taatcaactc tgtcagtaac attattacaa 480tgaatcttca tgtacttgat gtaataattt gtgtgggatg tattcctcta actatagtta 540tccttctgct ttcactggag agtaacactg ctctcatttg ctgtttccat gaggcttgtg 600tatcttttgc aagtgtctca acagcaatca acgtttttgc tatcactttg gacagatatg 660acatctctgt aaaacctgca aaccgaattc tgacaatggg cagagctgta atgttaatga 720tatccatttg gattttttct tttttctctt tcctgattcc ttttattgag gtaaattttt 780
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<223>Novel Sequence<400>12ctagtctgtg acaacctgag g2权利要求
1.一种鉴定候选化合物是否为RUP41 GPCR调节物的方法，所述GPCR包含一种选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体，其中受体偶联至G蛋白，所述方法包含下列步骤(a’)将候选化合物与受体接触；(b’)确定受体功能是否已被调节，其中受体功能的改变表示该候选化合物为所述GPCR的调节物。
2.一种鉴定候选化合物是否为心脏保护的调节物的方法，包含下列步骤(a)将候选化合物与GPCR接触，所述GPCR包含一种选自如下的多肽(i)SEQ ID NO2的多肽；(ii)SEQ ID NO3的多肽；以及(iii)SEQ ID NO5的多肽；或其片段，其中该受体偶联至G蛋白；以及(b)确定受体功能是否已被调节；其中该受体功能的改变表示该候选化合物为该心脏保护的调节物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述GPCR为重组体。
4.权利要求1或2的方法，其中所述确定是通过测量第二信使的含量进行的，所述第二信使选自环AMP(cAMP)，环GMP(cGMP)，三磷酸肌醇(IP3)，二酰甘油(DAG)及Ca2+。
5.权利要求4的方法，其中所述第二信使为cAMP。
6.权利要求5的方法，其中细胞内cAMP的含量降低。
7.权利要求1或2的方法，其中所述确定通过使用黑色素分析进行。
8.权利要求1或2的方法，其中所述确定是通过测量结合至含有所述GPCR的膜的GTPγS进行。
9.权利要求1或2的方法，进一步包含将候选化合物对受体的调节与通过受体与受体的已知调节物接触对受体的第二调节相比较的步骤。
10.一种根据权利要求1或2的方法鉴定的调节物。
11.权利要求10的调节物，选自激动剂，部分激动剂，反激动剂以及拮抗剂。
12.权利要求11的调节物，其中所述调节物降低细胞内cAMP的含量。
13.权利要求11或12的调节物，其中所述调节物为激动剂。
14.一种调节RUP41 GPCR活性的方法，所述GPCR包含一种选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体，其中所述GPCR偶联至G蛋白，所述方法包含将该受体与权利要求10至13任一项的调节物接触的步骤。
15.权利要求14项的方法，其中所述接触包含将调节物施用于含有所述受体的膜。
16.权利要求14的方法，其中所述接触包含将调节物施用于含有所述受体的细胞或组织。
17.权利要求14的方法，其中所述接触包含将调节物施用于含有所述受体的个体。
18.权利要求17的方法，其中所述个体需要预防或治疗选自如下的心血管失调(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高。
19.权利要求17的方法，其中所述个体需要预防或治疗选自如下的缺血性心脏病(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
20.权利要求17的方法，其中所述个体需要改变选自如下的心血管功能(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室腔体积；以及(d)降低心肌细胞凋亡。
21.一种改变需要所述改变的个体心血管功能的方法，包含将治疗有效量的第二方面调节物与RUP41 GPCR接触，所述GPCR包含一种选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因变体。
22.权利要求21的方法，其中所述心血管功能的改变选自如下(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室腔体积；以及(d)降低心肌细胞凋亡。
23.一种预防或治疗需要所述改变的个体心血管失调的方法，其包含将治疗有效量的第二方面调节物与RUP41 GPCR接触，所述GPCR包含一种选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因变体。
24.权利要求23的方法，其中所述心血管失调选自如下(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高。
25.一种预防或治疗需要所述改变的个体缺血性心脏病的方法，其包含将治疗有效量的第二方面调节物与RUP41 GPCR接触，所述GPCR包含一种选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其等位基因变体。
26.权利要求25的方法，其中所述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
27.一种制备组合物的方法，包含鉴定RUP41 GPCR的调节物，然后将载体与调节物混合，其中的调节物可通过权利要求1或2的方法进行鉴定。
28.一种药学或者生理学可接受的组合物，包含权利要求10至13任一项的调节物，主要由其组成或者由其组成。
29.一种改变心血管功能的方法，包含给需要所述改变的个体提供或施用权利要求28所述的药学或者生理学可接受的组合物，其中所述心血管功能的改变选自(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室腔体积；以及(d)降低心肌细胞凋亡。
30.一种预防或治疗心血管失调的方法，其包含给需要所述治疗的个体提供或者施用权利要求28所述的药学或生理学可接受的组合物，其中所述心血管失调选自(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高。
31.一种预防或治疗缺血性心脏病的方法，其包含给需要所述治疗的个体提供或施用权利要求28所述的药学或生理学可接受的组合物，其中所述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
32.一种利用权利要求10至13任一项的调节物制备用于预防或者治疗个体心血管失调的药物的方法，其中所述心血管失调选自(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高。
33.一种利用权利要求10至13项任一项的调节物制备用于预防或治疗个体缺血性心脏病的方法，其中所述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
34.权利要求17至26以及29至33任一项的方法，其中所述个体为哺乳动物。
35.一种制造基因敲除小鼠的方法，其中所述基因敲除小鼠易患选自如下的心血管失调(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高；包含敲除编码SEQ ID NO5的多肽的基因的步骤。
36.一种制造基因敲除小鼠的方法，其中所述基因敲除小鼠易患选自如下的缺血性心脏病(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；包含敲除编码SEQ ID NO5的多肽的基因的步骤。
37.权利要求35或36的基因敲除小鼠。
38.一种利用权利要求37的基因敲除小鼠鉴定候选化合物是否对预防或治疗心血管失调或缺血性心脏病具有疗效的方法。
39.一种制造基因敲除大鼠的方法，其中所述基因敲除大鼠易患选自如下的心血管失调(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高；所述方法包含敲除在高严格条件下与SEQ ID NO6的多核苷酸杂交的基因的步骤。
40.一种制造基因敲除大鼠的方法，其中所述基因敲除大鼠易患选自如下的缺血性心脏病(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭；所述方法包含敲除在高严格条件下与SEQ ID NO6的多核苷酸杂交的基因的步骤。
41.权利要求39或40的基因敲除大鼠。
42.一种利用权利要求41的基因敲除大鼠鉴定候选化合物是否对预防或治疗心血管失调或缺血性心脏病具有疗效的方法。
43.一种分离的大鼠RUP41多核苷酸，选自(a)包含SEQ ID NO6的连续至少75个核苷酸的多核苷酸；(b)包含SEQ ID NO6的连续至少150个核苷酸的多核苷酸；(c)包含SEQ ID NO6的连续至少250个核苷酸的多核苷酸；(d)包含SEQ ID NO6的连续至少350个核苷酸的多核苷酸；及(e)包含SEQ ID NO6的连续至少500个核苷酸的多核苷酸；或其互补多核苷酸。
44.一种重组载体，所述重组载体包含权利要求43的分离的多核苷酸。
45.一种宿主细胞，包含权利要求44的重组载体。
46.一种含有组成性活化G蛋白偶联受体与G蛋白的GPCR融合蛋白构建体，所述GPCR包含选自如下的RUP41多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体。
47.一种鉴定候选化合物是否为RUP41 GPCR配体的方法，所述GPCR包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO3的多肽；以及(c)SEQ ID NO5的多肽；或其片段或变体，包含如下步骤(a’)在存在或不存在所述候选化合物的条件下，将所述多肽与已知调节物(任选标记的)接触；(b’)检测所述已知调节物与所述多肽的复合物；以及(c’)确定在化合物存在的情况下是否比不存在的情况形成更少的所述复合物；其中所述确定表示该候选化合物为所述GPCR的配体。
48.一种放射显影的方法，包含给需要所述放射显影的给体提供或者施用放射性标记的化合物，所述化合物选自权利要求2的调节物以及权利要求47的配体。
49.一种人类RUP41 GPCR的转基因非人类哺乳动物，所述GPCR包含选自如下的多肽(a)SEQ ID NO2的多肽；(b)SEQ ID NO2的多肽，其中在SEQ ID NO2的312位的苯丙氨酸被赖氨酸取代；(c)SEQ ID NO3的多肽；以及(d)SEQ ID NO3的多肽，其中在SEQ ID NO3的312位的苯丙氨酸用赖氨酸取代。
50.一种利用权利要求49的转基因非人类哺乳动物鉴定化合物是否具有保护心脏的效果的方法，其中所述化合物选自权利要求2的调节物以及权利要求47的配体。
51.一种制造RUP41 GPCR的调节物的方法，包含如下步骤(a)根据权利要求1或2的方法鉴定所述调节物；以及(b)合成(a)中鉴定的调节物。
52.权利要求51的方法，其中所述调节物选自激动剂、部分激动剂、反激动剂以及拮抗剂。
53.权利要求51的方法，其中所述调节物降低细胞内cAMP的含量。
54.权利要求52或53的方法，其中所述调节物为激动剂。
55.根据权利要求10至13任一项的调节物在改变心血管功能中的应用。
56.权利要求55的方法，其中所述心血管功能的改变选自(a)降低心脏肥大；(b)增加心脏射血量；(c)降低心室腔体积；以及(d)减少心肌细胞凋亡。
57.根据权利要求10至13任一项的调节物在预防或治疗心血管失调中的应用。
58.权利要求57的方法，其中所述心血管失调选自(a)心输出量降低；以及(b)静脉压升高。
59.根据权利要求10至13任一项的调节物在预防或治疗缺血性心脏病中的应用。
60.权利要求59的方法，其中所述缺血性心脏病选自(a)心肌梗塞；(b)心肌梗塞后重建；以及(c)充血性心衰竭。
全文摘要
本发明涉及鉴别候选化合物是否为孤儿G蛋白偶联受体(GPCR)调节物的方法。优选为人类GPCR。在一些实施方案中，GPCR由心肌细胞内源表达。在一些实施方案中，GPCR与Gi偶联并降低细胞内cAMP的含量。在一些实施方案中，GPCR的过量表达会促进心肌细胞的存活。在一些实施方案中，GPCR的过量表达可挽救心肌细胞免于缺氧/复氧诱导的细胞淍亡。在一些实施方案中，患有充血性心衰竭个体体内的GPCR被下调。本发明的激动剂可有效用作治疗包含心肌梗塞、心肌梗塞后重造，以及充血性心衰竭等缺血性心脏病的治疗剂。
文档编号A61K51/08GK1684975SQ03823488
公开日2005年10月19日 申请日期2003年7月25日 优先权日2002年8月1日
发明者约翰·W·亚当姆斯, 丹尼尔·T·康诺利 申请人:阿瑞那制药公司