专利名称：尺寸均一的包埋亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法
技术领域：
本发明属于医药工程的药物制剂领域。
背景技术：
随着基因工程及分子生物学技术的高速发展，人们可以通过基因重组的方法大规模生产蛋白质或多肽药物[1]。然而蛋白质或多肽药物半衰期短、在体内易于降解、容易失活、需要重复多次给药且生物吸收率低，这些特点决定了蛋白质等多肽药物单独用药效果不理想和用药成本昂贵[2]。为了解决这个问题，科技人员开始采用药物缓释或控释技术对蛋白质或多肽药物进行包埋修饰，以期增强药物药效，降低用药成本，并达到靶向释药的目的。药物载体的研究已经成为世界科学研究的热点课题。
制备蛋白质或多肽药物的高分子材料微球或微囊药物载体需要下面三个条件[3]1)需要生物降解性材料制备微球；2)制备过程不会导致多肽药物变性；3)包埋率要足够高。目前大多数包埋蛋白质或多肽药物的研究基本上都采用PLA或PLGA作为药物载体材料，PLA或PLGA是目前临床上应用最为广泛的高分子材料，其无毒、具有生物相容性并可生物降解[4]，已被FDA批准作为可用于人类的生物高分子材料[5，6]。PLA/PLGA物理性质包括强度、疏水性和柔曲性。其降解产物乳酸或乙醇酸能够很快从人体内排出[7，8]。PLA或PLGA作为药物载体另一个优点由于高分子链的水解速率仅仅依赖于温度、pH值的变化或催化剂的存在与否，因而其在体内的各个地方的降解速率基本一致。PLA或PLGA的降解速率主要由高分子材料分子量、结晶度控制，对于PLGA来说，其降解速率还与Lactide/Glycolide比例有关[9]。
复乳溶剂蒸发法是常用的一种制备缓控释制剂的方法，已有很长一段历史了[10]。同W/O或O/W等普通乳化型药物载体比较，复乳型药物载体包埋率较高、易于控释、不易引起药物失活，因此成为主要的药物载体制备技术。但是传统溶剂蒸发法长期以来采用机械搅拌、均质乳化和超声等剧烈的方法进行复乳液的制备，这大大增加了药物失活的可能性，同时能耗过高，不易于工业放大生产。同时，由于机械乳化方法不易定量控制，往往制备出的载体微球粒径不均一、药物包埋率低且实验重复性差。药物载体粒径不均一还会导致以下问题的存在1)由于粒径不同的药物载体在体内的吸收部位和吸收机理各不相同，如果粒径不均一，就不能对药物载体粒径和吸收部位、吸收机理之间的关系进行有效地研究；2)在进行体内外药理实验时，由于药物载体粒径大小直接影响到所包药物的释放速率，如果药物载体粒径不均一，将导致实验的重复性差，直接影响药物载体的缓控释效果。
为了解决这些问题，本发明将开发微孔膜膜乳化技术取代传统的机械搅拌法制备复乳液滴，并在此基础上固化复乳液滴制备亲水性药物的聚合物微球或微囊载体。本发明不但能严格控制载体的直径，制备1微米至100微米以上的乳液或微球，而且由于乳化条件温和，在用作制备变性的蛋白质或多肽药物的药物载体时、能够保持药物的活性。到目前为止，国内外还没有人通过膜乳化技术制备以聚合物材料作为载体的亲水性药物的药物载体。
发明内容
本研究针对亲水性药物(蛋白质、多肽、酶、核酸、疫苗、激素、抗菌素、抗癌剂及其混合物等)，提供尺寸均一的聚合物微球或微囊药物载体，以用于实现药物在体内的缓控释释放，提高药物在体内的吸收率等。其特征是将含有亲水性药物的缓冲液与含聚合物的油相混合，用均相乳化器或超声破碎仪制备成油包水型初乳液后，将该初乳液用压力通过微孔膜压入外水相，得到尺寸均一的复乳乳液，然后采用一定的方法去除油相中有机溶剂对复乳乳液进行固化，得到尺寸均一的聚合物微球或微囊药物载体。通过条件优化，载体的直径分布系数控制在15％以内，直径可在1-100微米内自由控制，药物包埋率达到90％以上，载体内的蛋白质或多肽药物保持较高的活性。
该技术解决了以往采用机械搅拌乳化法制备的亲水性药物载体粒径不均一、包埋率低的问题，有望解决蛋白质或多肽药物单独用药时易被降解、容易失活、吸收率低等难题。同时，载体以固体粉末状形式存在，有利于其运输和保藏，通过对载体粒径的控制，可实现其在口服、注射、透皮等多种给药途径的应用。
本发明制备的聚合物微球或微囊药物载体的制备方法及其产物还能够带来下列效应(1)本专利提供的聚合物微球或微囊药物载体可用于各种亲水性药物的包埋，用于控释给药。如蛋白质、多肽药物、核酸药物、以及丝裂酶素、阿霉素、顺铂、5-氟尿嘧啶等抗癌药、抗生素、激素等；调控微球或微囊载体的粒径，可将其用于皮下注射、静脉注射、腹腔注射、口服等。
(2)本专利提供的聚合物微球或微囊药物载体，由于粒径均一并且可控，使用本药物载体可以开展粒径和其治疗效果的关系研究。这是因为复乳药物载体的粒径与其在体内的吸收和分布位置以及时间可能有较大关系。如果药物载体的尺寸不均一，则无法开展这方面的研究。
(3)本专利所使用的制备方法由于制备条件温和、重复性好，尤其适用于生物活性药物的包埋，如蛋白质、核酸等，能够保持生物活性药物的高活性。
图1亲水型药物聚合物微球或微囊药物载体的制备流程。
图2实施例1制备的溶菌酶聚乳酸微囊的光学显微照片。
图3实施例1制备的溶菌酶聚乳酸微囊的扫描电镜照片。
图4实施例1和比较例1制备的溶菌酶聚乳酸微囊的粒径分布图(测定仪器激光粒度仪COULTER LS230)。
图5比较例1制备的溶菌酶聚乳酸微球的光学显微照片。
具体实施方案本发明包括尺寸均一的亲水性药物(蛋白质、多肽、酶、核酸、疫苗、激素、抗菌素、抗癌剂及其混合物等)的聚合物微球或微囊载体的制备方法。亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备按图1所示的步骤制备，具体方法和步骤说明如下1)W1/O型初乳的制备将一定质量的亲水性药物及其它内水相添加剂溶于缓冲液中，作为内水相(W1)；将聚合物材料、一种或一种以上的油溶性乳化剂溶于该种聚合物材料的良溶剂中，作为油相(O)。将内水相与油相混合，用均相乳化器或超声波细胞破碎仪乳化，制备成W1/O型初乳。
亲水性药物包括蛋白质或多肽药物、基因工程药物、疫苗、DNA、RNA、干扰素等，可根据治疗需要一起或单独溶于内水相中；内水相添加剂可包括血清白蛋白、卵磷脂、明胶、海藻酸钠、葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚吡咯烷酮(PVP)、盐等对人体无害的水溶性物质。油相中材料包括聚乳酸(PLA)、聚丙交酯(PLGA)等具有生物相容性、可生物降解的高分子材料或其它合成高分子材料。油相为常温下呈液体状，不溶于水或微溶于水的可挥发性有机溶剂，有机溶剂在水中的溶解度应低于2％，可使用二氯甲烷、甲苯、环己烷、环己酮、乙腈、苯、氯仿等等。油性乳化剂必须溶解于所使用的有机溶剂，可使用失水山梨醇倍半油酸酯(Arlacel83)、PO-500、PO-310、聚氧乙烯氢化蓖麻油、失水山梨醇三油酸酯(司班85)、失水山梨醇单油酸酯(司班80)、失水山梨醇三硬脂酸酯(司班65)、亲油-亲水嵌段共聚物等。油相中乳化剂的浓度为0.5-10wt％。也可将油溶性药物一起添加在油相内。
内水相与油相的体积比为1∶1～1∶10。油相与外水相的体积比为1∶1～1∶100。
2)W1/O/W2复乳的制备将一种或一种以上的水溶性悬浮稳定剂和/或乳化剂溶解于水中，作为外水相。将上述步骤1所得的初乳通过多孔膜压入外水相(W2)。
上述外水相中的水溶性悬浮稳定剂可使用聚乙烯醇、聚吡咯烷酮、聚乙二醇、聚氧乙烯加氢蓖麻油、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯(Tween80)、聚氧乙烯山梨糖醇酐月桂酸酯(Tween 20)、亲油性-亲水性嵌段共聚物等。稳定剂使用范围为0.1％～20％。
上述外水相中的水溶性乳化剂可使用十二烷基磺酸钠(SDS)、十二烷基硫酸钠(SLS)、十二烷基苯磺酸钠等阴离子表面活性剂、烷基铵盐、烷基苄基铵盐等阳离子表面活性剂、聚氧乙烯壬基苯基醚、聚乙二醇硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨糖醇硬脂酸酯等非离子型表面活性剂。水溶性乳化剂的使用范围为0.1％～10％。
3)W1/O/W2型复乳载体的固化将上述步骤2所得的复乳液置于烧杯中，经一定方法除去有机溶剂，即可得到高分子微球或微囊载体。将所得微球或微囊用乙醇或甲醇或去离子水洗涤后，真空后冷冻干燥48h得成品高分子复乳微球或微囊药物载体。
上述有机溶剂的去除方法包括溶剂挥发法、溶剂萃取法等。
4)药物包埋率的测定方法将复乳液离心后，测定上清液中药物的含量和上清体积，药物包埋率按下式计算 实施例1将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将10mg溶菌酶溶于1.5mL去离子水中，作为内水相。将0.25g聚乳酸(分子量30万)和一定质量的油溶性乳化剂溶于5mL二氯甲烷/甲苯(体积比为1∶1)的混合有机溶剂中，作为油相。将内水相与油相混合，采用均质乳化器乳化1min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入到100mL水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将6.5mL的初乳用5.0KPa的恒定压力，通过孔径均一的微孔膜压入外水相。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除有机溶剂二氯甲烷/甲苯，离心后得到复乳型高分子微球或微囊药物载体。将所得的微球或微囊用去离子水洗涤二次后，真空干燥48h得成品微球或微囊。干燥后的微球重新分散在水中，用激光粒度仪(COULTER LS230)测试粒径分布状况，平均粒径为8.98um，CV值为14.1％。光学显微镜照片如图2所示，扫描电镜照片如图3所示。干燥后的粒径分布如图4所示，粒径较均一。药物包埋率为62.23％。
比较例1(机械搅拌法)采用与实例1相同的配方，配制溶菌酶水溶液1.5mL作为内水相，溶菌酶质量为10mg。将0.25g聚乳酸(分子量30万)和一定质量的油溶性乳化剂溶于5mL二氯甲烷/甲苯(体积比为1∶1)的混合有机溶剂中，作为油相。将内水相与油相混合，采用均质乳化器乳化1min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入到100mL水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将外水相与初乳混合，磁力搅拌1000rpm，10min后得到W/O/W型复乳液。继续低速搅拌24h以去除有机溶剂二氯甲烷/甲苯，离心后得到复乳型高分子微球或微囊药物载体。将所得的微球或微囊用去离子水洗涤二次后，真空干燥48h得成品微球或微囊。干燥后的微球重新分散在水中，用激光粒度仪(COULTER LS230)测试粒径分布状况。光学显微镜照片如图5所示，干燥后的粒径分布如图4所示，粒径分布很宽。药物包埋率仅为10％。
实施例2(在内水相中加入稳定剂聚乙烯醇)将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将10mg溶菌酶和15mg聚乙烯醇(PVA)溶于1.5mL去离子水中，作为内水相。将0.25g聚乳酸(分子量30万)和一定质量的油溶性乳化剂溶于5mL二氯甲烷/甲苯(体积比为1∶1)的混合有机溶剂中，作为油相。将内水相与油相混合，采用均质乳化器乳化1min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入到100mL水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将6.5mL的W/O型初乳用5.0KPa的恒定压力，通过孔径均一的微孔膜压入外水相。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除有机溶剂二氯甲烷/甲苯，离心后得到复乳型高分子微球或微囊药物载体。将所得的微球或微囊用去离子水洗涤二次后，真空干燥48h得成品微球或微囊。干燥后的微球重新分散在水中，用激光粒度仪(COULTER LS230)测试粒径分布状况，平均粒径为9.47um，CV值为19.64％。粒径较均一。药物包埋率为78.83％。
实施例3(在内水相中加入稳定剂明胶)将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将10mg溶菌酶和15mg明胶溶于1.5mL去离子水中，作为内水相。将0.25g聚乳酸(分子量30万)和一定质量的油溶性乳化剂溶于5mL二氯甲烷/甲苯(体积比为1∶1)的混合有机溶剂中，作为油相。将内水相与油相混合，采用均质乳化器乳化1min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入到100mL水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将6.5mL的W/O型初乳用5.0KPa的恒定压力，通过孔径均一的微孔膜压入外水相。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除有机溶剂二氯甲烷/甲苯，离心后得到复乳型高分子微球或微囊药物载体。将所得的微球或微囊用去离子水洗涤二次后，真空干燥48h得成品微球或微囊。干燥后的微球重新分散在水中，用激光粒度仪(COULTER LS230)测试粒径分布状况，平均粒径为9.15um，CV值为18.64％。粒径较均一。药物包埋率为73.21％。
实施例4(改变聚乳酸分子量)将孔径为5.2μm的亲水性微孔膜置于水中浸润，使孔膜充分湿润。将10mg溶菌酶溶于1.5mL去离子水中，作为内水相。将0.25g聚乳酸(分子量2万)和一定质量的油溶性乳化剂溶于5mL二氯甲烷/甲苯(体积比为1∶1)的混合有机溶剂中，作为油相。将内水相与油相混合，采用均质乳化器乳化1min，得到W/O型初乳。将水溶性悬浮稳定剂和乳化剂加入到100mL水中，搅拌至完全溶解作为外水相。将6.5mL的W/O型初乳用5.0KPa的恒定压力，通过孔径均一的微孔膜压入外水相。膜乳化完毕后，继续搅拌24h以去除有机溶剂二氯甲烷/甲苯，离心后得到复乳型高分子微球或微囊药物载体。将所得的微球或微囊用去离子水洗涤二次后，真空干燥48h得成品微球或微囊。干燥后的微球重新分散在水中，用激光粒度仪(COULTER LS230)测试粒径分布状况，平均粒径为8.47um，CV值为21.47％。粒径较均一。药物包埋率为69.52％。
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权利要求
1.一种尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，将含亲水性药物的内水相(W1)与含聚合物的油相(O)混合，用均质乳化器或超声乳化器制备成W1/O型(油包水型)初乳后，将该W1/O型初乳用压力通过微孔膜压入外水相(W2)，通过溶剂挥发法或溶剂萃取法去除有机溶剂后离心得到尺寸均一的聚合物微球或微囊药物载体。
2.如权利要求1所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，所得到的微球或微囊尺寸均一，由下式定义的直径分布系数(CV值)在优化条件下可控制在15％以内，直径可在1-100微米内自由控制，直径分布系数(Coefficient of Variation，CV)＝{[∑(di-d)2/N]1/2/d}×100％上式中，di为各个微球或微囊的直径，d为数平均直径，N为用于计算直径的微球或微囊的数量，N＞300个。
3.如权利要求1所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，蛋白质药物的包埋率达80％以上，在优化条件下达90％以上。
4.如权利要求1所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，内水相为水、亲水性药物、稳定剂及其它添加剂的均一混合物，亲水性药物直接溶解于内水相中(W1)；油相为聚合物、聚合物的良溶剂、油性乳化剂、油溶性药物及其其它添加剂的混合物(O)；外水相为溶有亲水性乳化剂或稳定剂及其它添加剂的水溶液(W2)。
5.如权利要求1或4所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，亲水性药物为任何溶解于水的物质，包括蛋白质、多肽、酶、核酸、疫苗、激素、抗菌素、抗癌剂及其混合物。
6.如权利要求1或4所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，油相中的有机溶剂在水中的溶解度小于2wt％，-聚合物为溶解于满足该条件的有机溶剂的聚合物，包括聚乳酸、聚乙酸醇、聚己内酯、聚苯乙烯类、聚丙烯酸酯类、聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯腈及其与其它聚合物的共聚物。
7.如权利要求1或4所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，外水相(W2)为将水溶性悬浮稳定剂和/或乳化剂溶解于水中后的混合物。
8.如权利要求1所述的尺寸均一的亲水性药物的聚合物微球或微囊载体的制备方法，其特征在于，内水相和油相的体积比为1∶1～1∶10；油相与外水相体积比为1∶1～1∶100。
全文摘要
本发明针对蛋白质、多肽等亲水性药物，提供尺寸均一的聚合物微球或微囊药物载体，用于药物的缓控释释放，达到延长治疗时间、增强治疗效果的目的。其特征是将含有亲水性药物内水相(W1)与含聚合物的油相(O)混合，用均质乳化器或超声乳化器制备成W1/O型(油包水型)初乳后，将该W1/O型初乳用压力通过微孔膜压入外水相(W2)，通过溶剂挥发法或溶剂萃取法去除有机溶剂后离心得到尺寸均一的聚合物微球或微囊药物载体。通过条件优化，载体的直径分布系数控制在15％以内，直径可在1－100微米内自由控制，药物包埋率达到90％以上，载体内的蛋白质或多肽药物保持较高的活性。该技术解决了以往采用机械搅拌乳化法制备的亲水性药物载体粒径不均一、包埋率低的问题，有望解决蛋白质或多肽药物单独用药时易被降解、容易失活、吸收率低等难题。同时，载体以固体粉末状形式存在，有利于其运输和保藏，通过对载体粒径的控制，可实现其在口服、注射、透皮等多种给药途径的应用。
文档编号A61K9/14GK1605359SQ20031010021
公开日2005年4月13日 申请日期2003年10月10日 优先权日2003年10月10日
发明者马光辉, 苏志国, 刘荣 申请人:中国科学院过程工程研究所