专利名称：含有白细胞介素－15(il－15)的疫苗组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及免疫学领域，尤其涉及IL-15在主动免疫治疗与IL-15过表达相关的疾病中的新用途。
已知细胞因子IL-15为14-15KDa的糖蛋白，由两个研究小组同时描述为T细胞-激活生长因子(Grabstein K.H.等人，Science1994，264，965；Burton J.D.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1994，91，4935)。IL-15的mRNA广泛存在于细胞和组织中，但由于在转录水平和胞内运输方面对其表达有较强的转录后调控，因而很难在这些细胞内或细胞上清液中发现该蛋白质(Bamford RN.等人，J.Immunol 1998，1604418-4426)，(Kurys G等人，J Biol Chem2000，27530653-30659)。
IL-15的生物学效应通过其与由α、β和γ三个亚基组成的细胞膜受体结合介导。IL-15Rα是该细胞因子的特异性亚基，与其具有非常高的亲合性Kd 10-11，β亚基与IL-2共有，而γ亚基为若干细胞因子IL-2；IL-4；IL-7；IL-9；IL-15；IL-21的通用受体(BamfordRN.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994，91，4935)，(GiriJG.等人，EMBO J.1995，143654-3663)。
IL-15为免疫刺激细胞因子，促进T、B和NK细胞的增殖与功能活性(Giri，J.G.，EMBO J.1994，13，2822-2830)，激活嗜中性粒细胞，修饰单核因子的分泌(Girard D.，1996，Blood，88，3176；Alleva D.G.，1997，J.Immunol.，159，2941)。该细胞因子介导若干免疫反应步骤的不同效应，诱导CD56 NK细胞增殖，与IL-12一起作用，诱导IFNγ和TNFα((Ross ME，1997，Blood 89，910-918；Fehniger TA，1999，Transplant Proc，31，1476-1478)。
配体与T细胞受体的结合诱导IL-15Rα的表达以及若干活化抗原例如CD69、CD25和TNFRII的表达。IL-15同时也是人血液T淋巴细胞的化学引诱物(Wilkinson 1995，J.Exp.Med.181，1255-1259)。所有这些资料表明抗原提呈细胞表达的IL-15对于炎症部位的早期T细胞活化可能非常重要。
已在若干疾病过程中检测到IL-15，包括Crohn′s疾病(KirmanI.，1996，Am.J.Gastroenterol.91，1789)，银屑病(Rückert R.2000，1652240-2250)，白血病(Yamada Y.1999，Leukemia andLimphoma，35(1-2)37-45)和类风湿性关节炎(RA)，(McInnes I.B.1998，Immunology Today，19，75-79)。
Feldmann等人，1996，Annu Rv Immunol，14397-440)提出，TNFα是细胞因子级联中的主要细胞因子，该级联包括IL-1β，IL-6，GM-CSF和若干炎症性细胞因子，例如与类风湿性关节炎(RA)发展与进展密切相关的Mip 1α、Mip 1β和IL-8。McInnes等人发现IL-15在这些疾病中表达异常，IL-15在滑液中浓度很高，且在滑膜细胞中有表达。他们认为IL-15在细胞因子级联中领先于TNFα，提出细胞接触依赖机制，其中IL-15激活的T细胞诱导巨噬细胞合成TNFα。而且，提出IL-15是T细胞迁移至滑液的重要因素(McInnes，1997，NatMed，3189-195)。
Ziolkowska等人报道，IL-15诱导IL-17在RA患者关节的表达，已知该细胞因子刺激滑膜细胞释放若干炎症性介质例如IL-6，IL-8，GM-CSF和前列腺素E2，表明IL-15在RA的病理发生中具有重要作用(Ziolkowska y col 2000，J Immunol，1642832-2838)。
T细胞募集和活化可能是IL-15局部合成的结果，这种非特异性活化可能导致无止境的炎症。所有这些表明IL-15抑制在疾病治疗上可能具有治疗潜力。
已经证明在动物模型中使用IL-15拮抗剂分子是有效的。Ruchatz等人制备了来自小鼠受体的α亚基(IL-15α)的可溶性片段，并证明将其给予DBA/1小鼠时该片段抑制胶原-诱导的关节炎(Ruchatz H.1998，J.Immunol.1605654-5660)。
其他已获专利的IL-15拮抗物分子包括，一个或多个氨基酸残基发生突变的IL-15，以及能够结合成熟IL-15阻断其受体信号转导的单克隆抗体(专利US6001973、US6177079、US6168783和US6013480)。尽管前述专利文件中描述了它们的应用，但科学期刊上发表的不少结果证实了它们的功效。2002年5月，Genmab公司公开了使用Immunex专利抗IL-15抗体的I/II期临床试验，该专利应相当于前面提及的专利US6177079，但这些结果尚未发表。
其它的研究包括嵌合蛋白质MutIL15-Fc，其与携带IL-15受体的细胞结合，导致激活的免疫细胞数目减少至低于临界水平并诱导耐受，例如在同种异体移植排斥中发挥重要作用的自反应激活T细胞应答IL-15，表明这些细胞可被作为IL-15拮抗剂的MutIL15-Fc蛋白质抑制。
疫苗参考书目中有少数关于抗自身分子抗体生成的实例，例如，用于治疗EGF依赖性肿瘤的针对EGF的疫苗(专利US5894018)，其功效已在临床试验中通过诱导阻断EGF活性抗体的产生得到证明。由于天然的自我耐受机制，针对自身蛋白质中和抗体的生成非常复杂。
在本发明中，以适当配方的IL-15主动免疫产生针对IL-15的中和自身抗体，能中和出现在自身免疫疾病和白血病患者中异常大量的该细胞因子。
本发明中，进行主动免疫产生中和IL-15的自身抗体，通过免疫方案调节IL-15水平。
发明详述本发明的创造性和新颖性在于，疫苗组合物使用IL-15进行主动免疫治疗IL-15过表达相关疾病。
该疫苗组合物将用于人体，以便诱导针对自身IL-15的中和抗体的应答。
本发明还包括IL-15与载体蛋白融合以及任何含有它们的其它制剂。
本发明还涉及该疫苗单独使用，或与抗炎药物或其它细胞因子拮抗物联合使用的用途。
根据本发明的某些实施方案，哺乳动物表达载体包含编码IL-15的DNA序列以适当配方用于主动免疫。
根据本发明的某些实施方案，IL-15是从大肠杆菌获得的重组蛋白质，其糖基化模式与自身IL-15不同。在本发明某些实施方案中，IL-15为活性蛋白质，根据CTLL-2分析比活性为2-5×106U/mg。
本发明从LPS-激活的单核细胞中分离IL-15基因，克隆入大肠杆菌表达载体并从此来源纯化。通过CTLL2测定对T细胞增殖的诱导测定蛋白质生物学活性。
根据本发明的某些实施方案，设计寡核苷酸通过PCR扩增IL-15基因，并将该基因插入含有编码p64k蛋白质基因的大肠杆菌表达载体获得融合蛋白质p64kIL-15。IL-15蛋白质融合在p64k载体蛋白的C-末端区域，从该来源纯化。通过CTLL2测定对T细胞增殖的诱导测定蛋白质生物学活性。
通过使用macacus irus猴作为模型阐述本发明的概念验证(proof-of-concept)，猴IL-15与人具有96.4％的同源性。
根据本发明提供结果，证明用IL-15或融合蛋白质p64kIL-15主动免疫，在免疫动物血清中均生成IL-15特异性的抗体应答和中和抗体。
根据本发明，本发明目的还延伸至DNA疫苗，其包括含有编码IL-15 DNA的载体，及其作为IL-15表达相关疾病基因治疗替代物的应用。
所述疫苗可与抗炎药或免疫抑制剂或其它常用于RA治疗的细胞因子拮抗物联合给药。
附图简述
图1IL-15的纯度图2融合蛋白质的纯度图3ELISA试验结果，显示猴中抗IL-15抗体水平图4猴血清中IL-15中和抗体的测定提供下列实例以说明本发明的实施方案实例1重组IL-15的获得通过RT-PCR从LPS-激活的单核细胞中分离编码人IL-15的DNA，克隆入大肠杆菌表达载体。
用8M尿素从细胞沉淀中提取大肠杆菌表达的重组IL-15，用TSKG4000SW(Merck)层析，继之用RP-C4(J.T.Baker)，在水/丙酮、TFA缓冲体系中层析纯化。通过刺激CTLL-2细胞系增殖，用MTT线粒体染色来测定生物学活性(Cosman y col 1984，Nature，312768-771)。IL-15的比活性为2×106U/mg(图1)。
重组p64k-IL15融合蛋白质的获得设计寡核苷酸引物通过PCR扩增IL-15基因，并将其插入大肠杆菌表达载体中p64k的C-末端，得到P64k-IL15融合蛋白质(图2)。
用弗氏压碎器(French press)破裂细胞后，蛋白质是可溶的。
向破裂上清液中加入硫酸链霉素至0.8％，于4℃放置1小时，10000转/分，4℃离心15分钟。使用硫酸铵进行两步沉淀，沉淀悬浮于20mM Tris，6mM EDTA，2M尿素，0.5mg/ml pefabloc中，经TSK DEAE PW离子交换层析与Superdex 200凝胶过滤纯化。
实例2macacus irus猴模型的评价对3组猴免疫方案进行了评价用IL-15免疫、用融合蛋白质和安慰剂免疫。在弗氏佐剂中以每次接种100μg的蛋白质的量给予蛋白质。首次免疫使用弗氏完全佐剂，1个月后二次免疫用不完全弗氏佐剂，2个月后第三次免疫用不完全弗氏佐剂。第二和第三次免疫后1周，抽取血液评价猴血清中的抗IL15抗体水平。数据如图3所示。
实例3猴血清中中和抗体的测定有IL-15存在时细胞因子-依赖细胞系CTLL-2增殖。阻碍受体依赖信号转导的IL-15结合分子将会抑制该细胞系的增殖。
为了评价存在于猴血清中的抗体的中和能力，用50μl补充有10％胎牛血清(Gibco)的RPMI培养基(Gibco)，将血清在96孔板(Costar，USA)中连续稀释。向各孔加入亚最佳量的IL-15(30pg)，加入5×103细胞/孔的预先洗过的CTLL-2细胞。平板在5％CO2中，于37℃孵育48小时。使用MTT线粒体染色法测定增殖(Cosman等人，1984，Nature，312768-771)。
从图3所示的结果可以看出抗体-介导的对IL-15诱导增殖的抑制。
发明优点-在整个时期内，生成抗体的水平比通过被动免疫获得的更稳定-与被动免疫相比，患者给药次数更少-每剂量需要的蛋白质数量和剂量数远低于用IL-15拮抗物分子治疗需要的量；这指示较低的生产成本。
权利要求
1.一种疫苗组合物，其中人IL-15为抗原。
2.权利要求1的疫苗组合物，其中IL-15为重组的。
3.权利要求1和2的疫苗组合物，其中IL-15与载体蛋白融合。
4.权利要求3的疫苗组合物，其中载体蛋白为p64k。
5.用于治疗IL-15表达相关疾病的方法，该方法包括给予有效治疗剂量的权利要求1-5所述的疫苗组合物。
6.用于治疗自身免疫疾病，例如RA、Crohn’s疾病和银屑病的方法，该方法包括给予有效治疗剂量的权利要求1-5所述的疫苗组合物。
7.用于治疗与IL-15作为生长因子相关的白血病的方法，该方法包括给予有效治疗剂量的权利要求1-5所述的疫苗组合物。
8.权利要求6-8的方法，其中疫苗组合物与抗炎药物或其它细胞因子拮抗物联合使用。
9.权利要求1-5所述的疫苗组合物的用途，用于生成抗自身白细胞介素-15(IL-15)的中和抗体反应。
10.权利要求10的疫苗组合物的用途，用于治疗自身免疫性疾病，例如RA、Crohn’s疾病和银屑病。
11.权利要求10的疫苗组合物的用途，用于治疗与IL-15作为生长因子相关的白血病。
12.编码人IL-15的DNA序列，如DNA疫苗，用于治疗IL-15表达相关疾病的用途。
全文摘要
本发明涉及含有IL－15的疫苗组合物，用于主动免疫治疗与该细胞因子过表达相关的疾病。本发明的目的在于，通过研制治疗疫苗诱导免疫个体产生IL－15中和抗体抑制IL－15的活性。在本发明疫苗组合物中IL－15可单独存在，或与载体蛋白例如P64k蛋白质或佐剂例如氢氧化铝组合在一起。本发明还涉及使用该疫苗治疗类风湿性关节炎及其他与IL－15过表达相关疾病，或该细胞因子在其中起生长因子作用的疾病，例如白血病。
文档编号A61K39/00GK1703239SQ200380101132
公开日2005年11月30日 申请日期2003年10月8日 优先权日2002年10月9日
发明者A·桑托斯萨维奥, R·希尔瓦罗德里戈兹, Y·莫利拉迪亚兹, A·A·罗迪里戈兹阿尔方索, J·R·马蒂尼兹卡斯蒂洛, H·格罗尼莫佩雷兹, A·莫罗索里亚, S·E·佩里亚罗迪里戈兹 申请人:遗传工程与生物技术中心