专利名称：含白头翁总皂甙元组合物的药物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含白头翁总皂甙元组合物的药物及其制备方法和白头翁总皂甙元组合物在制药中的应用，属于医药技术领域。
背景技术：
白头翁Pulsatilla chinensis(bge.)regel在植物分类学上属毛茛科植物。近几年来对白头翁的水及醇提取液进行了一些药理研究研究，发现白头翁的提取物具有抗菌、抗阿米巴原虫作用，具杀死阴道滴虫的作用，及镇静镇痛等作用。白头翁的主要有效成分有白头翁素及白头翁皂甙等，白头翁皂甙元组合物可以由白头翁药材中直接提取得到，也可以从白头翁药材中提取白头翁总皂甙，总皂甙再进行水解得到白头翁总皂甙元提取物。所说的白头翁总皂甙元组合物至少含有以下四种单体组分所组成3β，23羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羟基-23-羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；齐暾果酸及长春藤甙远等。
但到目前为止，尚未见到有将白头翁总皂甙元制备成药物的文献报道，发明人经过大量的试验研究证实，白头翁总皂甙元还具有抗肿瘤和免疫活性调节作用。在发现白头翁总皂甙元新的治疗和调节功能的基础上，完成了药用用途的发明。
发明内容
本发明的目的在于提供由白头翁总皂甙元组合物为主要活性成分的药物。
本发明的另一个目的是提供含白头翁总皂甙元组合物的药物及其制备方法。
本发明的再一个目的是提供白头翁总皂甙元组合物在制备抗肿瘤和免疫活性调节作用的药物中的应用。
本发明的药物是由白头翁总甙元组合物为活性成份，以其单一成分或加入任意比例的一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂及其他具有协同作用的成分组成。
本发明药物的口服剂型中，白头翁总甙元组合物的优选含量为占总成分重量的50-90％。
本发明药物的口服剂型中，白头翁总甙元组合物的最佳含量为占总成分，60-70％。
本发明的药物制备方法是将白头翁水煮或醇提取，过滤所得的提取液，将滤液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用乙醇洗脱。收集乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，将所得浓缩物再用乙醇溶解，放置，并滤过，滤液减压浓缩干燥，得到黄色粉末状白头翁总皂苷。取白头翁总皂苷，用硫酸或盐酸加热水解小时，放冷，过滤或离心，取沉淀，即得白头翁总甙元组合物，取白头翁总甙元组合物和医药上可接受的载体和/或赋形剂按选定的比例混合，制成常规的剂型。
本发明的白头翁总甙元组合物在药物中的应用包括白头翁总皂甙元组合物在制备抗肿瘤药物中的应用；白头翁总皂甙元组合物在制备促进脾NK细胞活性药物中的应用；白头翁总皂甙元组合物在制备促进THP-1细胞产生TNFα药物中的应用；白头翁总皂甙元组合物在制备能促进IL-8产生的药物中的应用。
本发明药物的服法及用量口服每次白头翁总皂甙元组合物净含量50-300mg，每日1-3次。
肌肉注射每次白头翁总皂甙元组合物净含量50-200mg，每日1-2次。
本发明的积极效果在于提供了一种新的，以白头翁总皂甙元组合物为活性成分的药物，将该药物应用于抗肿瘤和免疫活性调节中，能取得抗肿瘤和免疫活性调节的良好效果。
以下结合实验对本发明的积极效果进一步验证说明实验例1白头翁总甙元组合物抗肿瘤作用研究。
材料和方法动物P388腹水型、S180实体肉瘤、肝癌肿瘤腹水传代小鼠，均购自吉林省肿瘤研究所。昆明种小白鼠，体重18-22g，雌雄各半，购自长春市绿园区科新实验动物养殖场。合格证号吉动质字10-1015。
药品白头翁总甙元组合物自制。
方法试验小组随机分为对照组(ig蒸馏水20ml.kg-1)，取接种7-10天的荷瘤动物，脱颈椎处死，在无菌条件下，消毒腹部皮肤，抽取乳白色瘤液，以生理盐水按1∶2比例稀释，然后给正常动物接种，每只0.2ml，腹水型接种于雌性动物腹腔，实体型接种于雄性动物腋窝皮下，接种后次日开始分组给药，观察对腹水型的生命延长率及对实体型的抑瘤率，结果用统计学t检验处理。见下表。
表1白头翁总甙元组合物对动物移植性肿瘤P388的影响
注提取物1为白头翁总皂甙元组合物除去3β，23羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羟基-23-羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸两种单体化合物的白头翁总皂甙元提取物。
*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001以下同略表2白头翁总甙元组合物对动物称植性肿瘤S180的影响
提取物1为白头翁总皂甙元组合物除去3β，23羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羟基-23-羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸两种单体化合物的白头翁总皂甙元提取物。
表3白头翁总甙元组合物对动物移植性肿瘤Hep-A-22的影响
提取物1为白头翁总皂甙元组合物除去3β，23羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羟基-23-羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸两种单体化合物的白头翁总皂甙元提取物.
我们的离体试验研究证明白头翁总甙元组合物在100-0.1μg/ml剂量范围内对人宫颈癌(HeLa)细胞株的增殖均有明显的抑制作用。在低剂量(0.1μg/ml)时，较4种阳性药物(硫酸长春新碱；甲氨蝶呤；顺铂；盐酸阿霉素)的抗癌活性还强。对A549和HepG2等细胞株在本品高剂量时对细胞的增殖有抑制作用。本试验研究表明白头翁总甙元组合物(200mgkg-1)和(100mgkg-1)对小鼠S180肉瘤和P388腹水均具有明显的抑制作用，对Hep-A-22腹水型也有一定的抑制作用。综上所述，白头翁总甙元组合物无论在整体或离体条件下，均具有抗肿瘤作用。
实验例2白头翁总甙元组合物对肿瘤细胞株增殖的抑制作用。
实验目的采用MTT比色法，检测受试药物对离体癌细胞的增殖抑制作用，比较药物的抗癌活性。本试验按照中药新药研究指南的规定，受试样品分5个剂量组，与不同作用机理的阳性对照药进行抗癌活性比较。
仪器和试剂Eagle’s MEM培养基(Gibco，USA)；胰蛋白酶(Trypsin)(Gibco，USA)；96孔培养板(Costar，USA)，四甲基偶氮唑盐(MTT，Sigma，USA)；酶标光度计(CliniBio 128C，EC)；胎牛血清(中国医学科学院血液研究所，批号200004)；CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)，其余试剂均为国产AR。
阳性对照药硫酸长春新碱(白色冻干粉)，广州明兴制药厂；批号010701。甲氨蝶呤(白色冻干粉)淅江万马药业有限公司；批号010301。顺铂(白色冻干粉)，山东省德州制药厂，批号010914。盐酸阿霉素(桔红色冻干粉)，深圳万乐药业有限公司，批号0111E1。
肿瘤细胞株人宫颈癌细胞株(HeLa，ATCC)购自武汉大学菌种保藏中心。
受试样品白头翁总甙元组合物，淡色结晶自制，加入8％二甲基乙酰胺助溶，药物充分溶解在培养液中，过滤除菌备用。
细胞培养常规传代培养。
实验方法取生长状态良好的上述细胞各一瓶，制成细胞悬液，以1×104/孔100μl接种在96孔培养板中，同时加入受试样品20μl，10倍稀释成5个不同浓度，阴性对照组加入不含样品的培养液20μl，溶剂对照组加入与样品组等体积的含8％二甲基乙酰胺的培养液20μl。阳性对照组加入不同作用机理的抗癌药物20μl，并稀释成5个剂量浓度。样品与细胞在含5％CO2，37℃饱和湿度下孵育48h。加入MTT溶液(1mg/ml)20μl，继续培养4小时，吸弃培养液，加入100％二甲基亚砜100μl，经微量混合振荡器振荡10分钟后，酶标仪测定各孔光密度值(OD)。λ测量＝550nm，λ参考＝620nm。数据经“t”显著性检验。
实验结果表4.白头翁总甙元细合物对HeLa细胞株增殖活性的影响x
提取物1为白头翁总皂甙元组合物除去3β，23羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸；3-羟基-23-羟基羽扇豆-Δ20(29)-烯-28-酸两种单体化合物的白头翁总皂甙元提取物.
各加药组分别与对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
表4结果表明，样白头翁总甙元组合物对人宫颈癌细胞的增殖有显著的抑制作用，剂量在0.1μg/ml时对细胞在增殖仍有显著的抑制作用(P＜0.01)。溶剂对照组在最高浓度时对细胞的增殖有一定抑制作用，浓度降低其抑制作用消失。顺铂在高剂量时，HeLa细胞不能增殖，在1.0μg/ml对细胞的增殖有显著抑制作用，而0.1μg/ml时抑制作用降低。长春新硷在高剂量时对细胞增殖有抑制作用，低剂量时作用下降。氨甲蝶呤在不同浓度时，对HeLa细胞的增殖均有抑制作用。
实验例3白头翁总甙元组合物对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠脾NK细胞活性。
药品与试剂细胞培养试剂Eagle MEM培养基(Gibco，UAS)胰蛋白酶(Gibco，USA)胎牛血清(中国医学科学院血液研究所提供)；曲拉通(TritonX-100，Sigma)；还原型辅酶I(CoI，NADH，Sigma)；丙酮酸钠(上海生化试剂厂)；环磷酰胺(CY，上海第十二制药厂)。阳性对照药人参茎叶皂苷，黄色粉沫，纯度为95％，由白求恩医科大学提供。
实验设备与材料CO2培养箱(SANYO，MCO-175M，Japan)；超净工作台(CJ-1，苏州长桥净化设备厂)；紫外线光度计(TU-1221，北京瑞利分析仪器厂)自动酶标光度计(clincbio，EC-128C)倒置显微镜(CK40-F200，日本奥林巴斯公司)；96孔培养板(Costar，USA)离心机(LD5-2A，北京医用离心机厂)。
动物、细胞株
昆明种小白鼠，封闭群，实验动物购于国家动管会认证颁发实验动物合格证的单位大连市药品检定所动物实验基地购进。
白血病细胞株(K562，购于上海细胞生物研究所)。
小鼠纤维母细胞系(L-929，卫生部药品生物制品检定所提供)。
小鼠脾脏NK细胞，自备。
实验方法(一)、实验分组实验分六组，每组10只小鼠，雌雄各半。生理盐水组每只小鼠每天腹腔注射生理盐水0.2ml，连续15天；环磷酰胺组(CY)每只小鼠每5天腹腔注射环磷酰胺30mg.Kg-1，共3次；白头翁总甙元组合物环磷酰胺同上给药，同时每天腹腔注射白头翁总甙元组合物10mg.Kg-1和5mg.Kg-12个剂量组，连续15天；人参茎叶皂苷组环磷酰胺同上给药，同时每天腹腔注射人参茎叶皂苷5mg.Kg-1，连续15天；溶剂对照组环磷酰胺同上给药，同时每天腹腔注射等体积助溶剂二甲基乙酰胺(800μl/Kg)，连续15天。各加药组给药体积均为0.2ml。
(二)、小鼠脾细胞的制备方法1、小鼠眼球放血，拉颈处死，浸75％C2H5OH1分钟。
2、无菌取脾，放置在无血清的MEM培养液中。
3、将脾剪成小块，放置在培养皿中，注射器芯研磨至单个细胞，过200目尼龙网，1000rpm离心5分钟。
4、弃上清液，轻轻叩松细胞沉淀。
5、加6ml双蒸水轻轻振荡30秒。
6、加2ml双倍生理盐水(3.6％NaCl)。
7、1500rpm离心2分钟，加红细胞洗涤液，再滤过一次。
8、离心后用EagleMEM制备成脾细胞悬液，1×107细胞/ml；L929配成2×105细胞/ml。
(三)、白头翁总甙元组合物对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响—MTT法测定1、把靶细胞(L929)细胞悬液加入96孔平底培养板中，0.1ml/孔，37℃，5％CO2，至少培养1小时。
2、待靶细胞成一单层细胞，每孔加0.1ml效应细胞(效靶比10∶1)，每个样品5孔，靶细胞对照孔加培养液0.1ml。
3、混合后的细胞，放置37℃，5％CO2，孵育48小时。
4、弃上清，用生理盐水(37℃)轻轻灌满各孔，反复3次，滤纸吸于各孔。
5、每孔加入MTT孵育4小时，终止反应，100％二甲基亚砜。
6、酶标仪492nm测OD值，参考波长450nm。
(四)、白头翁总甙元组合物对小鼠脾NK细胞活性的影响—胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法1、各实验组脾细胞为效应细胞，每管取效应细胞0.1ml(1×106细胞/管)，加靶细胞(YAC-1)悬液0.1ml(2.0×105细胞/管)加小牛血清0.1ml，补加1640培养液至1ml，每组设5个平行样。
2、自然释放管YAC-1细胞悬液0.1ml，小牛血清0.1ml，补加培养液0.8ml。
3、最大释放管YAC-1细胞悬液0.1ml，小牛血清0.1ml，1％Triton-1000.8ml。
上述各试验组置37℃，5％CO2的培养箱中，饱和湿度孵育18h，1000r/min离心5min，取全部上清。加LDH反应液3ml，用分光光度计以340nm，32℃恒温测定吸光度值，每15s测1次共2min。
实验结果表5.白头翁总甙元组合物对小鼠脾NK细胞杀伤活性的影响—MTT法。
各加药组与模型组比较*P＜0.05，***P＜0.001.
结果表明白头翁总甙元组合物和人参茎叶皂苷对小鼠脾NK细胞杀伤活性与模型组比较有显著性差异。
表6.白头翁总甙元组合物对小鼠脾NK细胞活性的影响—胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法
各加药组与模型组比较*P＜0.05，**P＜0.01.***P＜0.001结果表明白头翁总甙元组合物5-10mg/Kg对小鼠脾NK细胞杀伤活性与模型组比较差异显著，5mg/Kg作用更明显(P＜0.001)。人参茎叶皂苷与模型组比较差异显著(P＜0.01)。
实验结论白头翁总甙元组合物对环磷酰胺所致免疫功能低下小鼠脾NK细胞活性影响，采用MTT法和胞浆乳酸脱氢酶(LDH)释放法两种实验方法。实验结果表明白头翁总甙元组合物对免疫功能低下小鼠脾NK细胞活性有明显促进作用(P＜0.05，P＜0.001)，两种方法结果一致。白头翁总甙元组合物能提高免疫功能低下小鼠细胞免疫功能，在免疫低下性疾病(如肿瘤)的治疗中有重要意义。
具体实施例方式
实施例1取白头翁1kg加适量的水，加热煮沸三次，(每次40分钟)。收集并合并所得的水提液，过滤，将滤液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用70％乙醇洗脱。收集70％乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，将所得浓缩物用70％乙醇溶解，放置，并滤过，滤液减压浓缩干燥，得到黄色粉末状白头翁总皂苷。取白头翁总皂苷，用10％的硫酸或盐酸80℃加热水解8小时，放冷，过滤或离心，取沉淀，即得白头翁总甙元组合物，取白头翁总甙元组合物1000克，与500克药用淀粉充分混匀，装入胶囊，每粒0.3克。
实施例2取白头翁1kg加适量的水，加热煮沸三次，(每次40分钟)。收集并合并所得的水提液，浓缩之相对密度为1.20，加乙醇至醇浓度为70％，或用85％乙醇提取，滤过，回收乙醇至无醇味，将药液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂(例AB-8中国天津南开大学化学)柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用80％乙醇洗脱。收集80％乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，得到黄色粉末状白头翁总皂苷，取白头翁总皂苷，用15％的硫酸或盐酸70℃加热水解9小时，放冷，过滤或离心，取沉淀，即得取白头翁总甙元组合物，取白头翁总甙元组合物1500克，与500克药用淀粉充分混匀，装入胶囊，每粒0.3克。
实施例3取白头翁1kg加适量的85％乙醇，加热回流，(每次40分钟)。收集提取液，减压回收乙醇至无醇味，放冷，过滤或离心，取沉淀，即得取白头翁总甙元组合物，取白头翁总甙元组合物2000克，与500克药用淀粉充分混匀，装入胶囊，每粒0.3克。
实施例4白头翁总皂甙元制取同实施例1，取白头翁总皂甙元100g，用85％乙醇溶解制成5％的白头翁总皂甙元溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水及助溶剂制成5％的水溶液，用微孔滤膜(φ0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装，每瓶10ml，封口，即得。
实施例5白头翁总皂甙元制取同实施例1，取白头翁总皂甙元500g，药用淀粉500g，用80％乙醇湿法制粒，整粒，装2#胶囊，每粒0.2g。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版胶囊项下。
实施例6白头翁总皂甙元制取同实施例1，取白头翁总皂甙元1000g，药用淀粉500g，糊精1000g，50乙醇适量制粒，整粒，干燥，压片。每片0.25g。其它项目应符合中华人民共和国药典2000年版片剂项下，口服，一次1-3片，一日1-3次。
实施例7白头翁总皂甙元制取同实施例1，取白头翁总皂甙元100g，用75％乙醇溶解制成5％的白头翁总皂苷溶液，用活性炭脱色，滤过，减压浓缩干燥，加注射用水及助溶剂制成每ml含20mg白头翁总皂苷的水溶液，用微孔滤膜(φ0.20μm)滤过至澄明，灭菌，无菌分装于西林瓶中，每瓶5ml，置冷冻干燥机中冷冻干燥，即得。服法用量为肌注；每日1-2次，每次5ml。
权利要求
1.含白头翁总皂甙元组合物的药物，其特征是由白头翁总甙元组合物为活性成份，以其单一成分或加入任意比例的一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂及其他具有协同作用的成分组成。
2.根据权利要求1的含白头翁总皂甙元组合物的药物，其特征是口服剂型中白头翁总甙元组合物占总成分重量的50-90％。
3.根据权利要求1的含白头翁总皂甙元组合物的药物，其特征是口服剂型中白头翁总甙元组合物占总成分重量的60-70％。
4.含白头翁总皂甙元组合物的药物的制备方法，其特征是将白头翁水煮提取或醇提取，过滤所得的提取液，将滤液加于预先用酸和碱处理的大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱直到洗出液无颜色，后用乙醇洗脱。收集乙醇洗脱液，并减压回收，蒸干，将所得浓缩物再用乙醇溶解，放置，并滤过，滤液减压浓缩干燥，得到黄色粉末状白头翁总皂苷。取白头翁总皂苷，用硫酸或盐酸加热水解，放冷，过滤或离心，取沉淀，即得白头翁总甙元组合物，取白头翁总甙元组合物和医药上可接受的载体和/或赋形剂按选定的比例混合，制成常规的剂型。
5.白头翁总皂甙元组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.白头翁总皂甙元组合物在制备促进脾NK细胞活性药物中的应用。
7.白头翁总皂甙元组合物在制备促进THP-1细胞产生TNF α药物中的应用。
8.白头翁总皂甙元组合物在制备能促进IL-8产生的药物中的应用。
全文摘要
含白头翁总皂甙元组合物的药物及其制备方法和用途，属于药物领域。本发明的药物由白头翁总甙元组合物为活性成份，以其单一成分或加入任意比例的一种或多种医药上可接受的载体和/或赋形剂及其他具有协同作用的成分组成。本发明药物的制备方法是将白头翁水煮提取或醇提取，将滤液经大孔吸附树脂柱，用去离子水洗柱到洗出液无颜色，用乙醇洗脱。收集洗脱液，减压回收，蒸干，再用乙醇溶解，减压浓缩干燥，得白头翁总皂苷。用硫酸或盐酸加热水解，取沉淀，得白头翁总甙元组合物，与医药上可接受的载体和/或赋形剂按选定的比例混合，制成常规的剂型。用其作为抗肿瘤和免疫活性调节药物，能取得抗肿瘤和免疫活性调节的良好效果。
文档编号A61P35/00GK1754540SQ200410011119
公开日2006年4月5日 申请日期2004年9月28日 优先权日2004年9月28日
发明者徐东铭 申请人:徐东铭