抑制副粘病毒感染的抗病毒组合物的制作方法

专利名称：：抑制副粘病毒感染的抗病毒组合物的制作方法
技术领域：
：本发明大体上涉及微生物学、病毒学、传染性疾病和免疫学领域。更具体来说，本发明涉及抑制或预防哺乳动物中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的多肽、多肽片段和有机小分子。
背景技术：
：呼吸道合胞病毒(RSV)是非分节负链RNA病毒，而且是婴幼儿、患有潜在疾病或免疫异常的患者和老年人中下呼吸道(LRT)疾病的主要起因(Domachowske和Rosenberg，1999；Hall，2001)。事实上，全球每年发生65,000,000例RSV感染，导致160,000人死亡(Robbins和Freeman，1988)。仅在美国，每年有100,000名因受RSV感染而患有严重肺炎和细支气管炎的儿童被送进医院治疗(Glezen等人，1986；Katz，1985)。1992年估计美国感染上RSV的住院和不必住院的儿童的开支超过每年340000000美元(Wertz和Sullender，1992)。目前没有预防人类疾病的得到许可的疫苗。因此，季节性流行病期间所出生的无免疫性婴儿必须依赖于从母亲得到的抗体来预防由RSV引发的严重LRT疾病。对于高风险婴儿来说，由于母亲的免疫状况和得自母亲的抗体的有限半衰期，因此这可能产生问题。目前已经批准两个生物药品IVIG和人类化单克隆抗体帕利珠(palivizumab)(Synagis)来预防高风险婴儿的感染(Hall，2001；Krilov，2002)。尽管免疫预防的益处是明显的，但是开支却是巨大的。除了上述生物药品之外，还存在一种得到许可的药剂利巴韦林(ribavirin)来治疗由RSV所引发的急性呼吸道疾病(Torrence和Powel，2002)。然而，利巴韦林是致畸剂，并且对医院工作人员、父母和其他生育年龄的亲属造成安全风险；因此利巴韦林的益处是有争议的(Hall，2001；Krilov，2002)。因此，在缺少得到许可的疫苗的情况下，目前极为需要具有改良效力和增加安全性的新颖医药和/或生物化合物来预防由例如RSV的副粘病毒所引发的LRT疾病。
发明内容本发明广泛涉及抑制或预防哺乳动物中感染的抗病毒组合物。更具体来说，本发明涉及抑制或预防哺乳动物中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的新颖抗病毒分子和其医药组合物。因此，在某些实施例中，本发明针对包含CCL5多肽的抗病毒组合物，其中CCL5多肽抑制哺乳动物受检者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在一个特定实施例中，副粘病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。在另一个实施例中，CCL5多肽通过阻断RSV融合(F)蛋白与哺乳动物上皮细胞之间的互作来抑制RSV感染。在某些实施例中，CCL5多肽是合成CCL5多肽或重组表达的CCL5多肽。在某些其他实施例中，CCL5多肽在哺乳动物受检者中是作为无生物活性的趋化因子。在一个特定实施例中，所述哺乳动物受检者是人类。在其他实施例中，所述哺乳动物受检者是经驯养的非人类哺乳动物，其选自由牛、马、猪、狗、猫、山羊和绵羊组成的群组。在另一个实施例中，CCL5多肽包含SEQIDNO1的氨基酸序列。在某些实施例中，CCL5多肽是NH2-末端经修饰的CCL5多肽。在一个特定实施例中，NH2-末端经修饰的CCL5多肽选自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬酰基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5组成的群组。在其他实施例中，本发明的抗病毒组合物进一步包含一个或一个以上的CCL5肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO1的CCL5多肽的约10至20个相邻氨基酸。在特定实施例中，所述一个或一个以上CCL5肽片段选自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18组成的群组。在其他实施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO2的氨基酸序列。在某些实施例中，SEQIDNO2肽片段进一步被定义为SEQIDNO1的NH2-末端肽。在某些其他实施例中，CCL5多肽被进一步定义为人类CCL5多肽。在其他实施例中，本发明的抗病毒组合物进一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物。在一个特定实施例中，CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆转CCL5多肽。在某些其他实施例中，本发明的抗病毒组合物进一步包含结合CCR3趋化因子受体的有机分子。在某些所述实施例中，所述有机分子是CCR3受体拮抗剂。在一个特定实施例中，所述有机分子包含一个或一个以上的以下化学结构在某些其他实施例中，本发明的抗病毒组合物是藉由鼻内投药或非经肠投药而投与哺乳动物受检者。在其他实施例中，本发明的抗病毒组合物进一步包含为CCR1拮抗剂或CCR5拮抗剂的有机分子。在某些实施例中，为CCR1拮抗剂的有机分子包含一个或一个以上的以下化学结构在某些实施例中，为CCR5拮抗剂的有机分子包含一个或一个以上的以下化学结构在其他实施例中，本发明针对包含编码CCL5多肽的多核苷酸序列的重组表达载体。在其他实施例中，本发明针对经包含编码CCL5多肽的多核苷酸序列的载体转染、转化或侵染的宿主细胞。在另一个实施例中，本发明针对包含CCL5多肽的NH2-末端肽片段的抗病毒组合物，其中所述片段包含CCL5多肽的NH2-末端的约10至20个相邻氨基酸，其中所述片段抑制哺乳动物受检者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在一个特定实施例中，副粘病毒是RSV。在另一个实施例中，CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列。在其他实施例中，NH2-末端肽片段包含选自由以下序列组成的群组的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。在某些实施例中，NH2-末端多肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列。在某些实施例中，所述组合物在哺乳动物受检者中是作为无生物活性的趋化因子。在其他实施例中，所述抗病毒组合物是藉由鼻内投药或非经肠投药而投与哺乳动物受检者。在其他实施例中，NH2-末端的CCL5肽片段通过阻断RSV融合(F)蛋白与哺乳动物上皮细胞之间的互作来抑制RSV感染。在某些其他实施例中，所述抗病毒组合物进一步包含一个或一个以上选自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬酰基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5组成的群组的NH2-末端经修饰的CCL5多肽。在一个实施例中，抗病毒组合物进一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物。在一个特定实施例中，CCL5多肽的NH2-末端多肽模拟物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆转CCL5多肽。在另一个实施例中，抗病毒组合物进一步包含为CCR1受体、CCR3受体或CCR5受体的拮抗剂的有机分子。在一个特定实施例中，CCR1受体、CCR3受体或CCR5受体的拮抗剂包含如由式I-XII所示的化学结构。在某些其他实施例中，本发明针对包含编码NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列的重组表达载体。在某些其他实施例中，本发明针对经包含编码NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列的载体转染、转化或侵染的宿主细胞。在某些其他实施例中，本发明针对通过基于计算机的分子模型化而设计的有机小分子模拟物，所述基于计算机的分子模型化使用SEQIDNO1的前15个CCL5NH2-末端氨基酸的原子X、Y、Z坐标，其中X、Y、Z坐标见于选自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A组成的群组的BrookhavenProteinDataBank文件。在另一个实施例中，本发明针对包含上述由基于计算机的分子模型化而设计的有机分子的抗病毒组合物。在某些其他实施例中，本发明针对CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物，其中所述多肽模拟物抑制哺乳动物受检者中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染。在某些实施例中，所述模拟物是通过使用SEQIDNO1的前15个CCL5NH2-末端氨基酸的原子X、Y、Z坐标的基于计算机的分子模型化而设计，其中X、Y、Z坐标包含于选自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A组成的群组的BrookhavenProteinDataBank文件中。在一个特定实施例中，肽模拟物是回折模拟物。在某些实施例中，回折模拟物是β-转角模拟物、单环β-转角模拟物、双环β-转角模拟物、γ-转角模拟物或单环γ-转角模拟物。在某些其他实施例中，肽模拟物包含于抗病毒组合物中。在某些其他实施例中，本发明针对预防或抑制哺乳动物宿主中的副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，所述方法包含对所述宿主投与医药学有效量的本发明抗病毒组合物。根据以下详细描述，根据其优选实施例并且根据权利要求书，本发明的其他特征和优势将变为显而易见。图1展示CCL5抑制上皮表面处的RSV感染。Hep-2单层在受RSVA2感染之前，经指定剂量的重组rCCL5(环形)或met-CCL5(正方形)预处理(感染前一小时)。三天后，计数菌斑，并表示为相对于仅经培养基中病毒培养而未暴露于趋化因子的对照孔(100％感染率)的感染百分比(±1标准偏差)。图2展示HEp-2和A549细胞上CCR1、CCR3和CCR5的表达。用细胞刮取器将HEp-2和A549细胞单层从组织培养瓶中小心地移出。用与藻红蛋白结合的抗人类CCR1或抗CCR3mAb，或者与FITC结合的抗CCR5(FL2-H，x轴，实线)来染色细胞。y轴展示相对细胞数目(计数)。图3展示CCL5的重叠合成肽与Hep-2细胞单层的结合。用递增浓度(0.0039-4.0μg/ml)的所示经生物素标记的肽培养(4℃)可存活Hep-2细胞单层。冲洗之后，将单层固定在甲醇中，并且通过OD450-550下的ELISA来观察肽的结合。图4A和4B展示CCL5多肽对CCL3多肽的水疗法曲线。图4A是CCL5(SEQIDNO1的氨基酸5至68)与CCL3(SEQIDNO22的氨基酸5至69)比对的水疗法曲线。图4B是CCL5(SEQIDNO1的氨基酸5至31)与CCL3(SEQIDNO22的氨基酸5至31)比对的水疗法曲线。用Kyte和Doolittle(1982)的氨基酸水疗法值产生y轴的水疗法标尺，其具有9氨基酸移动平均窗口。标尺上负水疗法值表示亲水性环境，而标尺上正数表示疏水性环境。具体实施例方式本发明下文的描述是关于所属
技术领域：
需要用于投与易受副粘病毒感染，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳动物宿主(例如人类)的有效抗病毒分子。因此，在某些实施例中，本发明针对新颖抗病毒分子和其医药组合物。如下文所定义，本发明的“抗病毒分子”是“多肽”、“趋化因子多肽”、趋化因子“多肽片段”(下文“肽片段”)、“有机小分子”(或“小分子模拟物”)或“肽模拟物(peptidemimetic)”(或“拟肽(peptidomimetic)”)，其中所述抗病毒分子抑制或预防哺乳动物细胞的副粘病毒感染。趋化因子是在指引细胞朝向受伤或感染部位运动中起重要作用的小分子量细胞因子(Baggiolini，2001)。举例来说，人们认为趋化因子CCL5(也称为“RANTES”；其是对调控活化、正常T细胞表达和分泌的英文首字母缩写)在对由RSV复制所引起的组织伤害区域的白细胞募集方面起主要作用(Appay和Rowland-Jones，2001；Moser和Loetscher，2001)。基于保守半胱氨酸基序的数目和间距将趋化因子分为亚家族，将其命名为C、CC、CXC和CX3C。先前已经确定，经RSV感染诱导气道上皮细胞中的基因表达和趋化因子分泌(Harrison，1999；Noah等人，2002；Zhang，2001)。此外，CC家族的某些趋化因子多肽已经展示拥有有效对抗人类免疫缺失病毒1型(HIV-1)的抗病毒特性(Lusso，2002；Lehner，2002；Proudfoot等人，2003)。举例来说，HIV-1通过结合CCR5作为主要共受体而进入T细胞和巨嗜细胞。趋化因子多肽CCL5(RANTES)、CCL3(MIP-1α)和CCL4(MIP-1β)是阻断CCR5作为HIV-1共受体并进而预防HIV-1感染的抑制性配体。本发明首次展示重组CCL5(rCCL5)多肽、N-末端经修饰CCL5多肽和N-末端CCL5肽片段(a)抑制人类上皮细胞受RSV感染(实例2)，(b)阻断上皮细胞与RSV的融合(F)蛋白的互作(实例3)，且(c)抑制活体内RSV感染(实例4)。与所公开的HIV-1感染的趋化因子抑制的报导相反(例如趋化因子CCL3、CCL4和CCL5)(Lusso，2002；Lehner，2002；Proudfoot等人，2003)，本发明的数据证明仅发生CCL5的RSV感染的趋化因子抑制，而其他例如CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)的CC抑制剂并不发生(参看实例2)，这表明RSV可能利用不同于CCR5的受体(即，与HIV-1相反)。通过已知与CCL5结合的受体(CCR1、CCR3和CCR5)的流式细胞术来检查人类上皮细胞。结果证实，CCR3(而非CCR1或CCR5)是在HEp-2和A549上皮细胞的表面上表达(参看，实例3和图1)，这表明CCL5阻断上皮细胞表面上RSV与CCR3之间的互作。测试其他已知与CCR3结合的重组CC趋化因子(Baggiolini，2001)，以确定其是否也降低RSV感染性。用递增量的重组CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子(eotaxin))、CCL8(MCP-2)或CCL15(MIP-1δ)来预先处理HEp-2细胞单层并不减弱RSV感染性(表10和表12)。此外，在针对CCR1、CCR3和/或CCR5的多或单克隆抗趋化因子受体抗体的存在下预培养HEp-2细胞单层并不降低RSV感染性(数据未显示)。先前已经证实，活体外，使用缺少SH(小疏水性)蛋白和/或G(粘附)蛋白的突变RSV菌株，仅F(融合)蛋白足以介导RSV粘附(Karron等人，1997)。因此，通过检查rCCL5抑制缺失G蛋白和/或SH蛋白的RSV菌株的感染的能力来进一步研究CCL5抑制。用缺失SH蛋白(RSVΔSH)或G蛋白C-末端的外部域截去氨基酸118(RSVΔ118)的经遗传修饰的RSV菌株来进行一系列研究。所述研究表明，相对于仅经培养基中病毒培养的对照细胞，经10μg/mlrCCL5或Met-CCL5预处理降低RSVΔ118和RSVΔSH病毒的感染率。用rCCL5(10μg/ml)预先处理也降低突变cp32/D1(缺少SH和G蛋白)和RSV的亲代B1菌株的感染(实例3，表15)。因此，rCCL5抑制缺失G和/或SH蛋白的RSV菌株的感染。为了确定CCL5抑制RSV感染的区域，合成代表SEQIDNO1的所有68个氨基酸的一系列9个CCL5肽片段(15聚体，由7个氨基酸重叠)(实例4和表2)，并且在用于感染的活体内小鼠模型中测试。当与RSV感染同时投与或在RSV感染之前投与时，代表CCL5NH2-末端前15个氨基酸残基的肽1(SEQIDNO2)是活体内的主要抑制肽(实例4，表16和表17)。总而言之，本发明的数据表明新颖的CCL5抑制机制，其中CCL5阻断发生在RSV包膜中的F蛋白与上皮细胞表面之间的互作。此外，已经鉴定出抑制RSV感染的代表CCL5的NH2-末端部分的CCL5肽片段。因此，在某些实施例中，本发明的抗病毒分子是CCL5多肽、NH2-末端经修饰的CCL5多肽、NH2-末端CCL5肽片段、经修饰NH2-末端CCL5肽片段、设计以模拟CCL5多肽的NH2-末端部分的肽模拟物或设计以模拟CCL5多肽的NH2-末端部分的小分子，其中所述抗病毒分子抑制或预防哺乳动物细胞，尤其是上皮细胞的副粘病毒感染。如下文所定义，“副粘病毒”涵盖副粘液病毒科的病毒，其包括(但不限于)RSV、副流感病毒(PIV)1-4型、麻疹病毒、腮腺炎病毒、人类偏肺病毒(humanMetapneumovirus)、尼派(Nipah)病毒、亨德拉(Hendra)病毒、牛瘟病毒和犬瘟病毒。A.抗病毒分子如上文所述，本发明的抗病毒分子是抑制或预防哺乳动物细胞的副粘病毒感染的多肽、肽片段、有机小分子或肽模拟物。更具体来说，抗病毒分子是阻断、抑制或预防副粘病毒F蛋白与上皮细胞表面受体之间互作，进而阻止副粘病毒进入细胞的多肽、肽片段、有机小分子或肽模拟物。本发明的抗病毒多肽(和其片段)和抗病毒肽模拟物/小分子模拟物分别在下文部分A.1和A.2阐述。1.CCL5多肽和其片段在某些实施例中，本发明的抗病毒分子是CCL5多肽，经化学修饰的CCL5多肽或经遗传修饰的CCL5多肽。在一个特定实施例中，CCL5多肽在其NH2-末端经修饰。在其他实施例中，本发明的抗病毒分子是NH2-末端CCL5肽片段、经化学修饰的NH2-末端CCL5肽片段或经遗传修饰的NH2-末端CCL5肽片段，其中所述肽片段包含抑制哺乳动物细胞的副粘病毒感染的CCL5多肽的NH2-末端部分。如下文所定义，全长CCL5多肽具有约7.8kDa的分子量，并且包含SEQIDNO1氨基酸序列。在某些实施例中，SEQIDNO1的全长CCL5多肽是合成多肽或重组表达CCL5多肽。本发明的全长CCL5多肽包含与SEQIDNO1氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，其中所述多肽抑制或预防哺乳动物细胞的副粘病毒感染。因此，CCL5多肽涵盖包含以下物质的多肽(a)SEQIDNO1所示的氨基酸序列，(b)SEQIDNO1多肽的天然发生等位变体，(c)从除人类之外的生物体分离的多肽(例如，CCL5多肽的直系同源物)和(d)SEQIDNO1的NH2-末端经修饰的CCL5多肽。根据本发明CCL5多肽的等位变体涵盖以下情况的多肽(1)从人类细胞分离，和(2)含有与SEQIDNO1人类CCL5多肽的实质同源性。CCL5多肽的等位变体是维持抑制或预防哺乳动物细胞的副粘病毒感染的CCL5多肽的天然发生氨基酸序列变体。因此，将CCL5多肽的等位变体定义为“功能性变体”。功能性变体仅含有SEQIDNO1的一个或一个以上氨基酸的保守性置换，或者多肽非关键区内非关键残基的置换、缺失或插入。举例来说，观察到NH2-末端CCL5肽片段(SEQIDNO2)抑制哺乳动物上皮细胞的副粘病毒感染(实例4)。此外，HIV-1感染的CCL5抑制的结构和功能研究进一步揭示氨基酸残基Phe12、Tyr14和Ile15对于抗HIV-1活性是至关重要的(Nardese等人，2001)。因此，在某些优选实施例中，全长CCL5多肽的等位变体包含实质上与SEQIDNO1的人类多肽同源的多肽，其中所述多肽不包含氨基酸Phe12、Tyr14和Ile15的置换或缺失。本发明进一步提供CCL5多肽的非人类直系同源物。CCL5多肽的直系同源物是从非人类哺乳动物类有机物分离的多肽，并且拥有CCL5多肽的抗病毒特性。可轻易地鉴别出CCL5多肽的直系同源物包含与SEQIDNO1实质上同源的氨基酸序列。例如BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool；Altschul等人，1990)、AACompIdent和AACompSim(Wilkens等人，1998)的程序是在SwissInstituteofBioinformatics(SIB)的ExPASy(ExpertProteinAnalysisSystem)蛋白组学服务器上公开可用的，并且尤其可用于鉴别公开数据库中的同源多肽，这些公开数据库例如GenBank、ProteinDataBank(PDB)、SwissProt、ProteinInformationResource(PIR)和ProteinResearchFoundation(PRF)。如先前所阐述，趋化因子(也称为趋化细胞因子)是在指引或募集细胞(例如单核细胞)朝向受伤或感染部位运动中起重要作用的小分子量(例如，约8-10kDa)多肽。在某些实施例中，CCL5多肽(或其片段)是经化学修饰的CCL5多肽或经遗传修饰的CCL5多肽，使得经修饰的CCL5多肽在哺乳动物受检者中是作为无生物活性的趋化因子促效剂。举例来说，CCL5修饰削弱、降低或钝化CCL5多肽作为趋化因子促效剂的生物活性，其中经修饰的CCL5多肽保留其抑制副粘病毒感染的能力。如文中所定义，“趋化因子促效剂”或“趋化因子或趋化因子促效剂的生物活性”是指趋化因子多肽(例如CCL5)诱导或刺激趋化性、钙流动、炎症和类似过程的能力。通过例如钙流动测定、趋化性测定、N-乙酰基-β-D-氨基葡糖苷酶测定和类似测定的方法检测或测量本发明趋化因子多肽的促效剂活性(Proudfoot等人，1996；Simmons等人，1997；Gong和Clark-Lewis，1995；Fincham，1988)(例如，参看实例6)。在某些实施例中，CCL5多肽在其NH2-末端经遗传和/或化学修饰，其中NH2-末端修饰使CCL5失去作为趋化因子促效剂的活性。所属
技术领域：
已经描述一些CCL5NH2-末端修饰使CCL5趋化因子失去活性。举例来说，当保留CCL5(RANTES)的起始甲硫氨酸(Met)时，所得Met-CCL5(Met-RANTES)多肽(1)失去作为趋化因子促效剂的活性(例如，Met-CCL5不刺激或诱导Ca2+流动或趋化性)，(2)对抗CCR5受体处由CCL5和CCL3(MIP-1α)所诱导的“趋化因子”作用(Proudfoot等人，1996)和(3)抑制主要人类巨嗜细胞培养物的HIV-1感染(Simmons等人，997)。如下文所定义，“Met-CCL5”或“Met-RANTES”多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列，并且进一步包含SEQIDNO1位置1处丝氨酸残基的甲硫氨酸氨基酸NH2-末端。也已经描述使CCL5趋化因子失去活性的截短型NH2-末端CCL5多肽。举例来说，Arenzana-Seisdedos等人(1996)合成了一种其中前8个氨基酸被去除(命名为RANTES(9-68))的截短型CCL5多肽(下文称为“CCL5(Δ1-8)”)和一种其中前2个氨基酸被去除(命名为RANTES(3-68))的截短型CCL5多肽(下文称为“CCL5(Δ1-2)”)，其中截短型多肽缺乏趋化性和白细胞活化特性并且抑制HIV-1感染。如下文所定义，“CCL5(Δ1-8)”多肽包含SEQIDNOI的氨基酸残基9至68。如下文所定义，“CCL5(Δ1-2)”多肽包含SEQIDNO1的氨基酸残基3至68。也已经描述使CCL5趋化因子失去活性的CCL5多肽的化学修饰。所述修饰包括向CCL5的NH2-末端丝氨酸残基添加氨氧基戊烷基团(称为“AOP-RANTES”或“AOP-CCL5”)(Simmons等人，1997)，和向CCL5的NH2-末端丝氨酸残基添加Nα-壬酰基基团(称为“Nα-壬酰基-RANTES”、“NNY-RANTES”和“NNY-CCL5”)(Mosier等人，1999)。如下文所定义，AOP-CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列，并且进一步包含共价连接于SEQIDNO1第一个丝氨酸残基的氨氧基戊烷基团。如下文所定义，NNY-CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列，并且进一步包含共价连接于SEQIDNO1第一个丝氨酸残基的Nα-壬酰基。或者，Ser1残基经另一个氨基酸(例如Gly1)置换，其中位置1处的经置换氨基酸包含经共价连接的AOP或NNY。因此，在某些实施例中，在本发明CCL5多肽的一级序列中进行修饰和改变以使CCL5失去作为趋化因子促效剂的活性，其中经修饰的CCL5保留其抗副粘病毒特性。举例来说，通过在一级、二级和三级结构水平上的复杂互作来确定多肽的功能和/或生物活性，并且因此可以在多肽序列(或其潜在的DNA编码序列)中进行某些氨基酸序列置换，且获得具有相似特性(例如抗病毒特性)的多肽。在进行这些改变时，应考虑氨基酸的水疗法指数(例如，参看图10A和10B)。所属
技术领域：
通常应了解赋予多肽交互性生物功能的水疗法氨基酸指数的重要性(例如，Kyte和Doolittle，1982；Eisenberg等人，1984；Hopp和Woods，1981)。已知某些氨基酸被具有相似水疗法指数或分值的其他氨基酸所置换，并且仍然得到具有相似生物活性的多肽。举例来说，氨基酸残基的相对水疗法特征影响所得多肽的二级和三级结构，这又界定多肽与，例如，酶、底物、受体、抗体、抗原和类似分子的其他分子的互作。如上文所略述，氨基酸置换通常是基于氨基酸侧链置换基的相对相似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等等。考虑在内的许多前述特征的示范性置换是所属领域技术人员所熟知的，并列于表1中。表1氨基酸置换原初示范性残基残基置换在某些实施例中，CCL5多肽在其NH2-末端经修饰，其中NH2-末端修饰使CCL5失去作为趋化因子促效剂的活性。因此，在某些所述实施例中，使用位点特异性突变发生在CCL5多肽的NH2-末端对其修饰(例如，CCL5Δ1-8，Arenzana-Seisdedos等人，1996)。或者，通过所属
技术领域：
已知的化学和合成修饰在CCL5多肽(或其片段)的NH2-末端对其修饰(例如，AOP-CCL5，Simmons等人，1997；NNY-CCL5，Mosier等人，1999)。位点特异性突变发生也可用于通过优先DNA的特异突变发生来制备第二代CCL5多肽(例如，趋化活性降低的抗病毒多肽(或其片段)和/或抗病毒特性增加的CCL5多肽(或其片段))。位点特异突性变发生允许通过使用编码所需突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列以及足够数目的相邻核苷酸来产生突变体，而提供足够大小和序列复杂性的引物序列，以在经横断的缺失连接处的两侧均形成稳定双链(duplex)。通常约17至25个核苷酸长度的引物为优选，其中在经改变的序列的连接处的两侧均有约5至10个残基。位点特异性突变发生技术是所属
技术领域：
所熟知的，并且通常采用可以单链和双链形式存在的噬菌体载体(例如，参看美国专利第5,556,747号；美国专利第5,789,166号和美国专利第6,391,548号；各专利案全文均以引用的方式并入本文)。在特定实施例中，本发明针对CCL5多肽片段。如本文所使用术语“多肽片段”、“肽片段”和“蛋白片段”可交替使用。如下文所定义，CCL5肽片段是具有与全长和成熟CCL5氨基酸序列的部分(但非全部)完全相同的氨基酸序列的CCL5多肽。因此，多肽片段包含，例如，SEQIDNO1的CCL5多肽的至少7个或7个以上(例如，8、10、12、14、16、18、20或更多)的相邻氨基酸。通过重组表达方法、合成肽化学或通过全长CCL5多肽的化学剪切或酶剪切生产或产生CCL5肽片段。片段是“独立的(freestanding)”，并且包含于更大的多肽中，所述片段形成所述更大多肽的一部分或区域，最优选是单一的连续区域。在一个实施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO1的全长CCL5多肽的约10至20个相邻氨基酸(例如，10聚体、11聚体、12聚体、13聚体、14聚体、15聚体等)。如实例4所描述，产生一系列9个重叠CCL5肽片段(15聚体)(参看下表2)，并且通过活体外和活体内RSV感染测定来进行测试。在这些测定中观察到代表CCL5前15个NH2-末端氨基酸(即SEQIDNO1的氨基酸1-15)的1号肽(SEQIDNO2)是9个经测试的重叠CCL5肽中最具抑制性的。所属
技术领域：
中也已知NH2-末端CCL5肽片段抑制淋巴细胞的HIV-1感染。举例来说，Nardese等人(2001)设计出一系列包含形成CCL5上的疏水性片的NH2-环与β1-链残基的合成12聚体肽(例如，见下文A.2部分和表5A)，跨越NH2-环与β1-链芳烃簇的19聚体和跨越Cysll-Cys43的环状24聚体。所述肽在下文所指示的氨基酸位置处经乙酰化(Ac)和氨基化(NH2)。在急性感染测定中，跨越NH2-环与β1-链芳烃簇的19聚体(Ac-Cys11-Tyr29-NH2；SEQIDNO16)的抗HIV-1效力显着高于NH2-环衍生的十二聚体Ac-Cys11-Ala22-NH2(SEQIDNO13)的抗HIV-1效力(平均ID50＝8.9+/-3.8μM对51.5+/-6.3μM；P＜0.0001)。缺少β1-链芳烃簇的两个较短肽(Cysll-Lys25与Cys11-Glu26)的有效性较低(分别为平均ID50＝48.1+/-6.8μM与44.7+/-3.3μM)，这证明所述芳烃簇对HIV-1抗病毒活性的重要性。跨越第二与第三半胱氨酸之间整个区域的环状24聚体(环-Cysll-Cys34；SEQIDNO17)比原初的十二聚体(SEQIDNO13)抑制HIV-1更有效(ID50＝29.8+/-1.6μM)，但比19聚体(SEQIDNO16)的低。未观察到用来源于CXCR4配体SDF-1的共线性对照环肽的作用。这些发现证明CCL5的β1-链内的芳烃簇对于抗HIV-1活性是关键的，证明此区域连同NH2-环包含在CCR5受体界面内。对抑制RSV感染(表2；1号肽)和HIV感染(表3)的CCL5肽片段进行比对，并展示于下表4中。表4中(粗体文字)也显示包含SEQIDNO18氨基酸序列的一致CCL5肽片段(17号肽)。表2重叠CCL5合成肽十五聚体(15聚体)的氨基酸序列表3抗HIVCCL5十二聚体(12聚体)、CCL5十九聚体(19聚体)和环24聚体的氨基酸序列表4抗RSV与抗HIV-1CCL5片段的氨基酸序列比对和一致氨基酸序列因此，在某些实施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列，其代表全长CCL5多肽的NH2-末端15个残基。在其他实施例中，SEQIDNO2的CCL5肽在其一个或一个以上的NH2-末端氨基酸残基处经修饰。在其他实施例中，CCL5肽片段包含SEQIDNO18氨基酸序列或其NH2-末端经修饰的片段。在某些其他实施例中，SEQIDNO2、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17或SEQIDNO18的CCL5肽片段的一级和二级序列用于设计下文A.2部分中所阐述的肽模拟物或有机小分子模拟物。在本发明某些实施例中预期通过化学剪切或酶剪切将CCL5多肽剪切成片段。这通过用蛋白水解酶(即蛋白酶)处理经纯化的CCL5多肽实现，蛋白水解酶包括(但不限于)丝氨酸蛋白酶(例如，胰凝乳蛋白酶、胰岛素、胞浆素、弹性蛋白酶、凝血酶、substilin)、金属蛋白酶(例如，羧肽酶A、羧肽酶B、亮氨酸氨基肽酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶)、硫醇蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、链球菌(Streptococcal)蛋白酶、梭菌蛋白酶)和/或酸性蛋白酶(例如，胃蛋白酶、胃亚蛋白酶、胰蛋白酶原)。用化学手段也产生多肽片段，例如用溴化氰(CNBr)、2-硝基-5-硫氰基苯甲酸、异苯甲酸、BNPA-粪臭素、羟胺或稀酸溶液处理多肽。在其他实施例中，本发明的CCL5多肽片段通过所属领域已知的肽合成技术重组表达和制备(Barany等人，1997；Simmons等人，1997；Proudfoot等人，1996；Proudfoot等人，1999；美国专利第5,258,454号)，并且在实例1中描述。2.肽模拟物和有机小分子模拟物关于药物设计的普通方法包括检查与特定疾病相关的蛋白-蛋白互作，然后设计可以模拟或结合于一个互作蛋白的小分子。生物活性通常来源于由二级结构单元所产生的蛋白表面的仅一小局部区，二级结构单元例如α-螺旋、β-片层、β-转角、γ-转角、β-链、环结构和类似结构单元。因此，通常设计有机小分子模拟物和肽模拟物，以通过模拟蛋白折叠表面(即三级结构)的这些局部结构单元(即二级结构)来发挥其生物活性。“肽模拟物”或“拟肽”是指各种类型和类别的分子，只要所得分子模拟或类似所需多肽二级(或局部三级)结构单元。举例来说，肽模拟物是通过使用酰胺键等排体和/或天然肽骨架的修饰(包括链延长或杂原子并入)来模拟肽二级结构的寡聚体；其实例包括氮杂肽、寡氨基甲酸盐、寡脲、β-肽、γ-肽、寡(亚苯基乙炔撑)、乙烯类似(vinylogous)磺酰肽、聚-N-取代甘氨酸(类肽)和类似物(例如，参看Gellman，1998；Kirshenbaum等人，1999；Barron和Zuckermann，1999)。所属领域技术人员熟知设计和合成肽模拟物的方法。在某些实施例中，预期肽模拟物用于克服蛋白酶敏感性、稳定二级结构和/或相对于天然发生的CCL5肽类似物改进生物利用率。在某些实施例中，本发明的肽模拟物是回折模拟物，例如β-转角模拟物、单环β-转角模拟物、双环β-转角模拟物、γ-转角模拟物或单环γ-转角模拟物。通常认为β-链二级结构是随机构型，但最近认为其是许多生物分子受体所识别的蛋白结构的基本与离散单元。举例来说，已经令人信服地证明，所有蛋白水解酶以经延长的β-链结构与其抑制剂/底物结合，其中肽骨架或等同非肽分子呈线性构型排列(Tyndall和Fairlie，1999；Fairlie等人，2000；Bode和Huber，1992)。β-转角是多肽结构中多肽链反向的部位。这些转角为极性，且主要位于蛋白分子的表面上(即溶剂所暴露)，并且因此充当受体结合、抗体识别和肽模拟物设计的理想部位。因此，在某些实施例中，抑制或预防哺乳动物受检者内的副粘病毒感染的分子是肽模拟物或有机小分子模拟物(下文“小分子”或“小分子模拟物”)。本发明的肽模拟物或小分子模拟物被设计成模拟或类似于下文所述CCL5多肽或其经修饰的CCL5多肽(例如Met-CCL5；AOP-CCL5)的某些二级或三级结构单元。通过二维和三维NMR已经分解出CCL5的三维溶液结构(Skelton等人，1995)。所获NMR数据用于产生20成员总体的能量最低的CCL5结构，其以1RTN登记名存放在BrookhavenProteinDataBank中。也存放了用20个CCL5结构通过2000步计算机模拟(insilico)能量最低化计算出的平均CCL5结构(PDB登记名1RTO)。最近，已经化学合成了AOP-CCL5，且分解出了它的高解析度(1.6A)晶体结构，并且以PDB登记名1B3A存放(Wilken等人，1999)，其后不久分解出Met-CCL5的高解析度(1.6A)晶体结构，其以DB登记名lEQT存放(Hoover等人，2000)。CCL5的多肽折叠与其他CC和CXC多肽的折叠相似，形成三链、反平行的β-片层，其侧翼为COOH-末端α-螺旋。下表5A和表5B中分别列出由NMR(PDB1RTO；Skelton等人，1995)和X射线结晶学(PDB1B3A；Wilken等人，1999)所确定的CCL5和AOP-CCL5的二级结构单元。表5ACCL5二级结构表5BAOP-CCL5二级结构CCL5二聚体的NMR溶液结构(Skelton等人，1995)展示部分杂乱的NH2-末端区，接着是指向标记二-半胱氨酸基序的短链(β0)，以310转角结束的延长区(NH2-环)、由环所连接的三条反平行β-链(β1-β3)和COOH-末端α-螺旋。趋化因子二聚体的生理相关性仍然存在争论，但是最近的研究指出CCL5的生物学功能依赖于二聚结构(Nardese等人，2001)。根据两位点趋化因子模型，趋化因子的两个截然不同的区域参与与趋化因子受体的互作对受体活化而言关键性的NH2-末端，和负责主要对接事件(dockingevent)的另一域，有人提出其包括NH2-环区域(Clark-Lewis，1994；Schraufstatter，1995；Lowman等人，1996；Pakianathan等人，1997；Crump等人，1997Hemmerich等人，1999；Laurence等人，2000)。因为趋化因子所介导的HIV-1阻断和HIV-1共受体功能均不需要趋化因子受体的信号传递活性，因此相信NH2-环在HIV-1感染的生理学中起枢纽作用(Nardese等人，2001)。CCL5的功能作图(描述于上文A.1部分)符合NMR溶液结构(Nardese等人，2001)。CCL5二聚体的表面静电势的分析表明，对于HIV-1抗病毒活性关键的NH2-环残基(Phe12、Tyr14和Ile15)显示于分子表面上，在那里它们有助于大(1802)疏水性溶剂暴露片的形成。此结构特征与作为受体对接位点的潜在作用一致。举例来说，Phe12在相关CC趋化因子MCP-1中结构上与Tyr13等同，所述Tyr13与CCR2结合有关，并且与其他NH2-环残基一起促使形成疏水性表面槽。类似地，MIP-1β中的等同残基Phe13对于CCR5结合与趋化因子二聚化起关键作用。然而，CCL5上的疏水性片也涵盖位于展示HIV-1抗病毒活性的β1-链肽的中心的芳香烃残基簇(Tyr27-Tyr29)(例如，参看上文部分A.1)。因此，Nardese等人的结构分析揭示NH2-环与β1-链残基均有助于假定的CCR5受体界面的形成。令人感兴趣的是，CCL5的β1-链残基并非是抑制哺乳动物上皮细胞的RSV感染所需的，这暗示了RSV感染的CCL5抑制的替代机制(或替代结构单元)的可能性(即相对于HIV-1感染)。具有倒转氨基酸手性的肽模拟物(即天然发生L-氨基酸立体异构体的D-氨基酸立体异构体)本能地抵抗蛋白酶所介导的消化，并且因此代表用于治疗应用的合适候选者。Nardese等人(2001)合成具有反向肽键以阻止原初侧链局部化学的NH2-环/β1-链19聚体的倒转模拟物。逆转肽(Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2；SEQIDNO19)有效抑制HIV-1包膜所介导的细胞融合，其效力(平均ID50＝13.3+/-2.7μM)与其L-氨基酸对应物(SEQIDNO16)可比，并且其对抗趋化现象。相反，用具有相似氨基酸组成和疏水性值的对照逆转肽未发现产生作用。这些生物学活性证实逆转引起肽侧边侧链的原初空间定向的保存的预测。因此，在某些实施例中，本发明针对从SEQIDNO1约氨基酸残基1至约氨基酸残基30的CCL5多肽的肽模拟物，其中肽模拟物抑制哺乳动物受检者的副粘病毒感染。在一个特定实施例中，肽模拟物基于如SEQIDNO2所示的SEQIDNO1的NH2-末端CCL5肽片段的氨基酸残基1至15，并且展示抑制RSV感染(实例4)。在另一个实施例中，肽模拟物基于SEQIDNO1的氨基酸残基1至22。在另一个实施例中，肽模拟物基于SEQIDNO1的氨基酸残基1至29。在另一个实施例中，肽模拟物是包含以如下反向顺序的SEQIDNO1氨基酸残基11至29的逆转肽Ac-YFYEKIHARPLPRAIYAFC-NH2(SEQIDNO19)，下文表示为“Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2”。在另一个实施例中，肽模拟物是包含以如下反向顺序的SEQIDNO1氨基酸残基1至34的逆转肽Ac-CKGSTYFYEKIHARPLRPAIYAFCCPTTDSSYPS-NH2(SEQIDNO20)，下文表示为“Ac-D-Cys34-D-Ser1-NH2”。在另一个实施例中，肽模拟物是包含以如下反向顺序的SEQIDNO1氨基酸残基1至15的逆转肽Ac-IYAFCCPTTDSSYPS-NH2(SEQIDNO21)，下文表示为“Ac-D-Iso15-D-Ser1-NH2”。在另一个实施例中，肽模拟物或小分子模拟物包含NH2-环氨基酸Phe12、Tyr14和Ile15的二级和三级结构单元。如下文所述，这些结构单元可通过计算机模拟分子模型化和选自由1EQT(Met-CCL5)、1B3A(AOP-CCL5)和1RTO(CCL5)组成的群组的BrookhavenProteinDataBank分子坐标登记文件的直观化而轻易地确定。在其他实施例中，CCL5(PDB1RTN；PDB1RTO)、Met-CCL5(PDB1EQT)和/或AOP-CCL5(PDB1B3A)的分子坐标用于产生(通过计算机模拟分子模型化)SEQIDNO1、SEQIDNO2、SEQIDNO18或其NH2-末端片段的第二代肽模拟物。如前文所述，CCL5的多肽折叠与其他CC和CXC趋化因子(例如CCL3、CCL4)的多肽折叠相似。然而，本发明证明CCL5，而不是CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)抑制上皮细胞的RSV感染，这暗示RSV(与HIV-1相反)可能利用不同于CCR5的受体。为了进一步阐述CCL5所介导的RSV感染的抑制的序列和/或结构要求，通过氨基酸序列比对(表6)、水疗法曲线(图4A和图4B)和分子模型化/直观化(图11)来比较CCL5和CCL3多肽。如实例5所述，CCL5与CCL3(MIP-1α)序列的比较表明CCL5与CCL3共享32个一致氨基酸(即48％一致性)，并且具有约78％氨基酸序列相似性(表6)。表6CCL5与CCL3的BLAST比对全长CCL5与全长CCL3的水疗法曲线(Kyte和Doolittle，1982)的比较(图4A和图4B)表明，CCL5与CCL3间的最大水疗序列分歧发生在这些多肽的NH2-末端内(例如，参看实例5)。计算机模拟(SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer(Guex和Peitsch，1997))模型化CCL5(PBD1RTO)与CCL3(PBD1B53)的能量最低结构，并且三级结构(或折叠)叠加，NH2-末端氨基酸1至7(数据未显示)和COOH-末端氨基酸64至68除外。与CCL5/CCL3水疗法曲线相似(图4A)，CCL5与CCL3之间的最大结构序列分歧发生在NH2-末端氨基酸残基内。不希望由任何特定理论约束，预期HIV-1感染的CCL5抑制与RSV抑制之间的差异可能部分上是由CCL5NH2-末端的前15个氨基酸调控。因此，在某些实施例中，本发明的肽模拟物或小分子模拟物模拟包含SEQIDNO2氨基酸序列的CCL5NH2-末端肽片段。在一个特定实施例中，如表7所阐述，肽模拟物基于CCL5、AOP-CCL5或Met-CCL5的前15个氨基酸的二面角。表7CCL5、MET-CCL5和AOP-CCL5的前15个NH2-末端氨基酸的二面角在本发明的其他实施例中，抗病毒分子是抑制或预防哺乳动物细胞的副粘病毒感染的非肽小分子模拟物(与肽模拟物相反)。与肽模拟物的设计类似，本发明的非肽小分子被设计成模拟SEQIDNO1的CCL5多肽的关键结构单元或氨基酸残基。在一个特定实施例中，小分子基于SEQIDNO2所示的SEQIDNO1的NH2-末端CCL5肽片段的氨基酸残基1至15。在另一个实施例中，小分子基于SEQIDNO13所示的SEQIDNO1的氨基酸残基11至22。在另一个实施例中，小分子基于SEQIDNO16所示的SEQIDNO1的氨基酸残基11至29。在另一个实施例中，小分子基于SEQIDNO18的逆转肽模拟物Ac-D-Tyr29-D-Cys11-NH2。在一个优选实施例中，本发明的小分子模拟由NH2-环的氨基酸残基Phe12、Ala13、Tyr14和He15所形成的CCL5疏水性片。在某些实施例中，小分子模拟物包含如功能性和折叠CCL5多肽中所发现的氨基酸Phe12、Tyr14和Ile15的三维分子排列，其中根据CCL5(PDB1RTO)分子坐标、AOP-CCL5(PDB1B3A)或Met-CCL5(PDB1EQT)分子坐标的二面角，Phe12、Tyr14和Ile15空间受束缚。在其他实施例中，如Nardese等人所描述(2001)，本发明的小分子模拟由NH2-环的氨基酸残基Phe12、Ala13、Tyr14和Ile15以及β-片层的残基Tyr27、Phe28和Tyr29所形成的CCL5疏水性片。在某些其他实施例中，CCL5(PDB1RTN；PDB1TRO)、Met-CCL5(PDB1EQT)和/或AOP-CCL5(PDB1B3A)的分子坐标用于产生(通过计算机模拟分子模型化和计算)模拟CCL5疏水性片的小分子。如上所述，本发明的某些数据表明CCR3是用于RSV进入哺乳动物上皮细胞的共受体。因此，在另一个实施例中，本发明针对与CCR3受体的小分子拮抗剂、CCR3受体的肽拮抗剂、CCR3受体模拟物或其组合结合投药的本发明抗病毒分子。在某些实施例中，CCR3拮抗剂是包含一个或一个以上的以下化学结构的分子在其他实施例中，本发明的抗病毒分子与CCR1受体的小分子拮抗剂结合投药。在某些实施例中，CCR1拮抗剂是包含一个或一个以上的以下化学结构的分子在其他实施例中，本发明的抗病毒分子与CCR5受体的小分子拮抗剂结合投药。在某些实施例中，CCR5拮抗剂是包含一个或一个以上的以下化学结构的分子B.编码趋化因子的多核苷酸、重组表达载体和宿主细胞在某些实施例中，趋化因子多肽(例如CCL5、CCL3)、截短型趋化因子多肽(例如CCL5A1-8)、趋化因子片段(例如SEQIDNO2的CCL5)等重组表达。在一个优选实施例中，编码趋化因子多肽的多核苷酸包含于质粒载体中，并且在原核宿主细胞中表达。编码本发明全长CCL5多肽的多核苷酸序列如SEQIDNO23所述。当将趋化因子多核苷酸用于趋化因子多肽、其片段或其截短物的重组产生时，所述多核苷酸包括所述多肽的编码序列或读码框中多肽的编码序列和其他编码序列，例如编码前导或分泌序列、前体蛋白(pre-protein)序列、蛋白原(pro-protein)序列、前蛋白原(prepro-protein)序列或其他融合肽部分的序列。举例来说，有助于经融合多肽纯化的标记序列可以与编码序列连接(参看Gentz等人，1989，其全文以引用的方式并入本文)。因此，本发明预期制备出允许表达产物的His标签纯化的融合多肽的多核苷酸。多核苷酸也可以含有非编码5’和3’序列，例如转录、非转录序列，拼接和聚腺苷酸化信号。如本文中所使用，术语“载体”是指能够转运其所连接的另一核酸的核酸分子。本发明的载体包括所属
技术领域：
已知的载体，例如质粒载体、病毒载体和类似载体。原核生物中蛋白的表达最通常是在大肠杆菌(E.coli)中用含有针对融合蛋白或非融合蛋白表达的组成型或可诱导启动子的载体进行。融合载体向其中所编码的蛋白、向重组蛋白的氨基或羧基末端加入若干氨基酸。所述融合载体通常用于三种目的1)增加重组蛋白的表达；2)增加重组蛋白的溶解性；和3)通过充当亲合纯化中的配体来辅助重组蛋白的纯化。在融合表达载体中，通常在融合部分与重组蛋白的连接位点处引入蛋白水解裂解位点，以能够在融合蛋白纯化之后将重组蛋白从融合部分分离出来。所述酶和其相关识别序列包括因子Xa、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括分别将谷胱甘肽S转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合于目标重组蛋白的pGEX(PharmaciaBiotechInc；Smith和Johnson，1988)、pMAL(NewEnglandBiolabs，Beverly；MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)。合适的可诱导的非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amann等人，1988)和pETIld(Studier等人，1990)。在某些实施例中，将重组表达载体引入至“宿主细胞”内，其中表达趋化因子多肽。本文可交替使用“经遗传工程改造的宿主细胞”和“重组宿主细胞”。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。举例来说，趋化因子多肽在细菌细胞(例如大肠杆菌、卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis))、昆虫细胞(例如Sf9或Sf21细胞)、酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))或哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、NIH3T3、PER.C6、NSO或COS细胞)中表达。其他合适宿主细胞为所属领域技术人员所知。通过常用转化、侵染或转染技术将载体DNA引入至原核或真核细胞内。如本文所使用，术语“转化”、“侵染”和“转染”意指多种用于将外源核酸(例如DNA)引入至宿主细胞内的所属领域所公认的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-右旋糖所介导的转染、脂质体转染(lipofection)、侵染或电穿孔。转化、侵染或转染宿主细胞的合适方法可参看Sambrook等人(″MolecularCloningALaboratoryManual″第2版，ColdSpringHarborLaboratory，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，1989)和其他实验室手册。本发明宿主细胞，例如培养物中原核或真核宿主细胞，也可以用于生产(即表达)大量的所需趋化因子多肽。因此，本发明进一步提供用本发明的宿主细胞生产趋化因子多肽的方法。在一个实施例中，所述方法包含在合适培养基中培养本发明的宿主细胞(向其中引入编码多肽的重组表达载体)直至趋化因子多肽产生。在另一个实施例中，所述方法进一步包含将趋化因子多肽从培养基或宿主细胞中分离出来。本发明的表达载体可用作制备大量自身编码趋化因子多肽的DNA的手段，并且可用作制备编码多肽的手段。预期当本发明的趋化因子多肽通过重组手段制备时，可采用原核或真核表达载体作为穿梭系统。C.抗病毒医药组合物在某些优选实施例中，本发明提供包含本发明抗病毒分子和医药学可接受的载剂的医药组合物。将抗病毒分子并入适于投用与例如人类的哺乳动物受检者的医药组合物中。所述组合物通常包含“活性”成分(即抗病毒分子)和“医药学可接受的载剂”。如下文所使用，术语“医药学可接受的载剂”意欲包括与医药投药相容的任何和所有溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂和类似物质。所属
技术领域：
熟知所述介质和试剂用于医药活性物质的使用方法。只要任何常用介质或试剂与活性化合物相容，那么所述介质就可用于本发明的组合物中。组合物中也可以并入补充性活性化合物。本发明的医药组合物被调配成适合其预期投药途径。投药途径的实例包括非经肠(例如静脉内、真皮内、皮下、肌肉内、腹膜内)、粘膜(例如口服、直肠、鼻内、面颊、阴道、呼吸道)和透皮(局部)。用于非经肠、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组份无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲脂；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张性的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱调节pH值，例如盐酸或氢氧化钠。非经肠制剂可密封于安瓿、一次性注射器或者由玻璃或塑料制成的多剂量瓶内。适于可注射使用的医药组合物包括无菌含水溶液(其中水可溶)或分散液，和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内投药来说，合适载剂包括生理盐水、细菌抑制水、CremophorELTM(BASF，Parsippany，NJ)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情形下，组合物必须为无菌，并且应为一定程度的流体以易于注射。组合物在生产和储存条件下应该稳定，并且应针对免受微生物(例如细菌和真菌)污染行为而保存。载剂是含有(例如)水、乙醇、多元醇(甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和其合适混合物的溶剂或分散介质。举例来说，通过使用例如卵磷脂的涂层，通过维持分散液情形下的所需粒子大小和通过使用表面活性剂来维持适当的流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂来防止微生物行为，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸和类似试剂。在许多情形下，组合物中优选包括等渗剂，例如，糖、多元醇，例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，来产生可注射组合物的延长吸收。通过在具有一种上述所列的成分或上述成分的组合的适当溶剂中并入所需量的活性化合物来制备无菌可注射溶液，随后如果需要则进行过滤灭菌。通常通过将活性化合物并入至含有碱性分散介质和上文所列的所需其他成分的无菌媒剂中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情形下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥，从而由先前无菌过滤溶液产生活性成分和任何其他所需成分的粉末。口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用载剂。其可以密封于明胶胶囊内或压制成片剂。为了达到口服治疗投药的目的，在活性化合物中并入赋形剂，并且以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。也可以用流体载剂制备口服组合物以用作漱口水，其中流体载剂中的化合物口服并漱口，并且吐出或咽下。医药学相容粘合剂和/或佐剂物质也可以作为组合物的部分包括在内。片剂、药丸、胶囊、锭剂和类似剂型可以含有任何以下的成分或相似性质的化合物粘合剂，例如微晶纤维素、黄芪胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖；崩解剂，例如褐藻酸、羟基乙酸淀粉钠(Primogel)或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或Sterotes；助流剂，例如胶状二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；或者调味剂，例如薄荷油、水杨酸甲酯或橘子香料。对于吸入投药来说，以来自加压容器或含有例如气体(例如二氧化碳)的合适推进剂的配出器或喷雾器的气溶胶喷雾形式传递化合物。也可以通过粘膜或透皮手段来全身性投药。对于粘膜或透皮投药来说，调配物中使用对于待渗透屏障适当的渗透剂。所述渗透剂通常是所属
技术领域：
已知的，并且对于粘膜投药来说包括(例如)去污剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。通过使用鼻喷雾器或栓剂来完成粘膜投药。对于透皮投药来说，将活性化合物调配成所属
技术领域：
通常已知的药膏、软膏、胶或乳膏。对于直肠传递来说，也以栓剂(例如用常用栓剂基，例如可可油和其他甘油酯)或延迟灌肠剂的形式制备化合物。在一个实施例中，用可以保护化合物以免从身体快速消除的载剂制备活性化合物，例如受控释放调配物，其包括植入体和微胶囊传递系统。可以使用生物可降解的、生物可相容的聚合物，例如乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(ethylenevinylacetate)、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原质、聚原酸酯和聚乳酸。制备所述调配物的方法对于所属领域技术人员将是显而易见的。所述物质也可商业购自AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals，Inc。脂质体悬浮液(包括靶向具有抗病毒抗原的单克隆抗体的受染细胞的脂质体)也用作医药学可接受的载剂。根据所属
技术领域：
已知方法制备所述物质，例如如美国专利第4,522,811号所描述的方法，其以引用的方式并入本文。将口服或非经肠组合物调配成易于投药且剂量均一的剂量单位形式是尤其有利的。下文所用的剂量单位形式是指适合作为待治疗的受检者的一元剂量的物理离散单位；各单位含有经计算与所需医药载剂结合产生所需治疗作用的预定量的活性化合物。本发明剂量单位形式的具体情况受支配于或直接依赖于活性化合物的独特特征和待达到的特定治疗作用以及复合所述活性化合物以治疗个体的
技术领域：
的固有限制。应了解，医药学可接受的媒剂是指进入医药组合物中不引起副作用，且(例如)可能有助于活性化合物投药，增加医药组合物体内寿命和/或效力，增加医药组合物在溶液中的溶解性或增强医药组合物的保存的化合物或化合物组合。这些医药学可接受的媒剂是众所周知的，并且可以由所属领域技术人员根据所选活性化合物的性质和投药模式来调整。本发明的组合物通常以含有标准的、熟知的无毒生理可接受的载剂、佐剂和媒剂(如果需要)的剂量单位调配物非经肠投药。下文所用术语非经肠包括静脉内、皮下、真皮内、肌肉内、动脉内注射或输液技术。根据已知技术，使用合适分散剂或湿润剂和悬浮剂来调配可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂也可以是无毒非经肠可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如1，3-丁二醇溶液。在这些可接受的媒剂和溶剂中，可以使用水、林格(Ringer)溶液和等渗氯化钠溶液。此外，习惯上将无菌、固定油用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和固定油，包括合成单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可以用于制备可注射制剂。优选载剂包括用磷酸盐、乳酸盐、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和类似物缓冲的中性盐水溶液。当投用病毒载体时，载体经充分纯化以使其基本上无不良污染物，例如缺陷干扰腺病毒颗粒或内毒素和其他热原质，因此其不在接受载体构建体的个体中引起任何不适当的反应。纯化载体的优选手段包括使用浮力密度梯度，例如氯化铯梯度离心。载剂可以是脂质体。用脂质体作为传递媒剂的手段在所属
技术领域：
中是熟知的。本文所引用的所有专利和公开案均以引用的方式并入本文。D.实例除另有详细描述外，均使用所属领域技术人员熟知和常规的标准技术来进行以下实例。以下实例仅为说明性的目的，而不应理解为以任何方式限制本发明的保护范围。实例1材料与方法趋化因子与试剂。除另有说明外，所有重组(r)人类趋化因子和抗人类趋化因子受体抗体均购自R&DSystemsInc.(Minneapolis，MN)。重组人类CCL5和基质细胞衍生因子(SDF)-1α(CXCL12)分别自BiosourceInternational(Camarillo，CA)和Wyeth(Andover，MA)获得。所述研究中使用抗CC趋化因子受体(CCR)的单克隆抗体和多克隆抗体。单克隆抗体(mAb)针对人类CCR3(目录号MAB155)或CCR5(目录号MAB182)。针对来自CCR1(目录号sc-7934)、CCR3(目录号sc-7897)、CCR4(目录号sc-6126)或CCR5(目录号sc-8283)的肽序列而培育的经亲合纯化的多克隆抗体是购自SantaCruzBiotechnology(SantaCruz，CA)。抗人类CX3CR1多克隆抗体(目录号TP502AF)是购自TorreyPinesBiolabs(Houston，TX)。CCL5的一系列9个重叠合成肽(表1)(Schall等人，1988)是购自Sigma-Genosys(TheWoodlands，TX)，或用标准肽化学方法合成。根据厂商说明(Pierce；Rockford，IL)用EZ-LINKTMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺生物素)化学标记所述肽。对于活体外和活体内实验，分别将冻干肽溶解于补充有5％(V/V)FBS(Hyclone；Logan，UT)、2mML-谷氨酰胺和2％青霉素(penicillin)/链霉素(streptomycin)(GibcoBRL)的Dulbecco最小基本培养基(Dulbecco’sMinimumEssentialMedia)(DMEM，GibcoBRL；GrandIsland，NY)中；或者重构于PBS中，并且在指定浓度下使用。所述肽纯度均大于90％。抗融合抑制剂RFI-641(Raznikov等人，2001)在PBS中稀释，并且以25微克/剂量活体内投放。病毒备料。如上所述(Hancock等人，1996)，在完全培养基(补充有2mML-谷氨酰胺、2％青霉素/链霉素和10％(V/V)FBS的DMEM，37℃、5％CO2)中培养的HEp-2细胞(ATCCCCL23)中繁殖野生型RSV菌株A2与B1(Wright等人，1973)和缺失SH与G基因(核苷酸4064-5462)的突变体RSV菌株cpts248/404(Ackerlind等人，1988)、rA2cpts248/404ASH(Crowe等人，1994)和cp32/D1(Karron等人，1997))。使用上文所述用于cp52的方法从B1菌株分离cp32/D1突变体(Crowe等人，1996；Karron等人，1997)。在所述研究中也使用在G蛋白的氨基酸117处用遗传工程方法截短的重组RSV(rA2cpΔG118)。所有病毒备料均通过4℃下15分钟低速(200g)离心净化从细胞溶菌产物中制备。病毒感染性活体外抑制。使HEp-2细胞单层在含有完全培养基的96孔组织培养板(Falcon，BectonDicksonandCo.；FranklinLakes，NJ)中生长。在一式三份含有指定量重组趋化因子或抗趋化因子受体抗体的孔中，在4℃或37℃下预处理所述单层1小时。在移去趋化因子或抗体之后，在相同温度下用所示野生型或突变型RSV菌株侵染单层1小时，并且随后覆盖上2％葡聚糖(Sephadex)(AmershamBiosciences；Piscataway，NJ)。也在细胞受侵染之后1小时，或者在将单层同时暴露于病毒与指定剂量的趋化因子或CCL5肽的1∶1混合物之后评估抗病毒活性。单独或组合测试5至100μg/ml培养基剂量范围内的抗趋化因子受体抗体的抑制特性。病毒感染性活体内抑制。在以RSV的A2菌株(约2×106pfu)的1∶1混合物攻毒之前1小时或之后1小时或与其同时对雌性BALB/c小鼠(8-10周龄，CharlesRiverLaboratories；Wilmington，ME)投与肽(125微克至500微克/剂量)。所有投药均为鼻内(0.05ml)，并且在注射麻醉下进行(60mg克他命(ketamine)/千克和2.5mg赛拉嗪(xylazine)/千克(TheButlerCo.；DublinOH))。四天之后移去肺，匀质化，并通过低速离心净化，骤冷，并储存于-70℃下直至用HEp-2细胞单层进行菌斑测定(Hancock等人，1996)。所有动物均在美国实验动物管理认证协会(AmericanAssociationforAccreditationofLaboratoryAnimalCare)许可的设施中圈养。菌斑测定。用抗F蛋白(L4)mAb如上文所述(Hancock等人，1996)显现病毒菌斑(Paradiso等人，1991；Walsh和Hruska，1983)。其后，用blotto封闭剂(PBS，5％奶粉)冲洗细胞，并且用辣根过氧化物酶共扼山羊抗小鼠IgG((KirkegaardandPerryLaboratories，Inc.；Gaithersburg，MD)培养。用含有在PBS中的0.1％H2O2的0.05％4-氯-1-萘酚检测结合抗体。菌斑计数之后，相对于仅暴露于培养基中病毒而无趋化因子或抗趋化因子受体抗体的单层，计算平均感染百分比(一式三份孔的±标准偏差)。CCL5肽与HEp-2细胞的相互作用。使用ELISA评估合成肽与HEp-2细胞单层的相对结合。简单来说，以每孔0.2ml完全培养基中3×104HEp-2细胞接种96孔板(Falcon)。过夜培养(37℃，5％CO2)之后，在冰上冷却单层大约15分钟。向二份重复孔中加入从0.49μg至500μg/mlDMEM(补充有1％FBS、2％青霉素/链霉素和2mML-谷氨酰胺)的上升剂量的经生物素标记的肽，并且在4℃下培养1小时。随后用80％甲醇(JTBaker；Phillipsburg，NJ)固定(室温下20分钟)单层。用PBS洗涤之后，用0.3％(V/V)H2O2(Sigma；St.LouisMO)培养单层(室温下30分钟)，再次洗涤并且用经生物素标记的抗人类CCL5mAb(R&Dsystems)探查(4℃下30分钟)。其后，用抗生蛋白链菌素-HRP(Zymed；SanFrancisco，CA)培养单层(室温下1小时)。用TMB一步底物溶液(TMBOne-StepSubstrateSolution)(DAKO；Carpinteria，CA)显影孔。用MolecularDevicesVersamax酶标仪(microplatereader)(Sunnyvale，CA)测定(450nm，参照为550nm)光密度。流式细胞术。为了确定CCR的表达，用细胞刮取器将A549和HEp-2细胞从6孔板(Falcon)小心地移出，并且用抗CCR1(目录号FAB182F)、CCR3(目录号FAB145P)或CCR5(目录号FAB155P)的经生物素标记的mAb培养，接着用抗生蛋白链菌素-藻红蛋白培养。用标准流式细胞计数技术分析细胞(FACSort，BeetonDickinson；MountainView，CA)。所有试剂均购自R&Dsystems。检测CCL5。根据厂商(R&DSystems)说明用ELISA检测RSV感染24小时后HEp-2和A549上皮细胞的培养物上清液中所分泌的CCL5。用MolecularDevicesVersamax酶标仪测定(450nm，参照为550nm)光密度。为了确定感染之后CCL5mRNA复制体数目和RSV基因组数目，开发出定量聚合酶链反应(qPCR)测定法。用RNeasy小量试剂盒(MiniKit)(Qiagen；Valencia，CA)和QiaShredders(Qiagen)从细胞单层分离出总细胞RNA。在加入RiboGreenRNA定量试剂(QuantitationReagent)(MolecularProbes；Eugene，OR.)之后，在CytoFluor4000荧光读板仪(AppliedBiosystems)上测量RNA浓度。根据厂商说明用TaqMan反转录酶试剂盒(AppliedBiosystems)反转录1微克的总细胞RNA。用与RSVA2的L基因的一个区域互补的DNA引物-探针组来测定所得eDNA中RSV基因组的存在与否。此外，根据厂商说明，用含有引物-探针组的人类RANTESTaqManPre-Developed测定试剂(PDAR)(AppliedBiosystems；FosterCity，California)来检测CCL5eDNA。在ABIPrism7700序列检测器(Perkin-Elmer；Pittsburgh，PA)上进行PCR、荧光检测和数据分析。统计分析。使用JMP统计软件(SASInstituteInc.；Cary，NC)，通过Tukey-KramerHSD多重比较或学生t-测验来确定对数转化后的显着差异(p＜0.05)。数据表示为±1标准偏差。在单独研究中所有数据均证明相似的结果。实例2CCL5抑制上皮细胞受RSV感染在本实例中，活体外证明，人类气道上皮细胞响应于RSV感染而产生CCL5多肽。表8和表9展示分别检测RSV感染对mRNA复制体数目的数量增加和对A549与HEp-2细胞单层分泌CCL5的影响的实验的代表性结果。在A549单层中，CCL5mRNA复制体数在感染之后2天(7倍)和3天(20倍)增加。所述数据进一步表明，随着RSV复制的进行，CCL5转录本的数目相对于RSV基因组复制体数显着增加(表8)。CCL5mRNA比RSV基因组复制体数的比率在培养第一天与第三天之间增加16倍。早在感染之后24小时即在培养物上清液中检测到CCL5蛋白(表9)。因此，响应于RSV感染，所分泌的单层增加CCL5多肽的量。表8人类肺上皮细胞系受RSV感染后诱导CCL5a的表达a.A549细胞经RSVA2(RSV)感染(MOI＝0.09)或仅在培养基中培养(对照)，并且在其后1至3天通过定量实时RCR对总细胞RNA测定CCL5mRNA复制体数和负链RSV基因组复制体数。b.表示每纳克总RNA的CCL5mRNA复制体数。c.表示CCL5mRNA复制体数比RSV基因组复制体数的比率。表9人类上皮细胞系受RSV感染后增加培养基中所分泌的CCL5的量aa.A549和HEp-2细胞经RSVA2(RSV)感染(MOI＝0.09)或仅在培养基中培养(对照)。其后1-3天收集培养物上清液，并且通过ELISA分析所分泌的CCL5。b.数目表示每毫升培养基的CCL5皮克数。c.ND表示未测。进一步调查CCL5抑制上皮细胞受RSV感染的潜能。表10和表11描述单独实验，其中HEp-2细胞单层预先暴露(1小时)于递升量的人类rCCL5减少感染。在最大测试剂量(10μgrCCL5/ml)下，相对于仅在培养基中培养的对照单层，感染率降低至大约30％(表10)和20％(表11)。抑制作用等同于726nm的中值抑制浓度(IC50)。抑制性取决于剂量，如1μg和5μg的抑制性低于10μgrCCL5/ml培养基的抑制性。HEp-2细胞预先暴露于(1小时)相似浓度的重组MIP-1α/CCL3、MIP-1β/CCL4、MCP-2/CCL8或嗜酸性粒细胞趋化因子/CCL11(表10和表11)或重组MIP-1δ/CCL15或SDF-1α/CXCL12(表12)不减弱感染性。数据进一步表明，感染性的抑制需要在将病毒加入单层之前(表12)或在将病毒加入单层的同时(表13)，将细胞单层经rCCL5(10μg/ml)处理。当在病毒吸收1小时之后(表12)或在热变性之后(表13)投放时，rCCL5不减少活体外感染性。A549单层经rCCL5预先处理也抑制RSV感染(数据未显示)。表10CCL5抑制人类上皮细胞受RSV感染aa.HEp-2细胞单层暴露于1、5或10μg/ml的CCL5(RANTES)、CCL3(MlP-1α)、CCL8(MCP-2)或CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)1小时。其后，用培养基冲洗单层3次，并且用RSV的A2菌株感染1小时。培养3天后，计数菌斑以确定病毒感染程度。将数据表示为相对于仅经培养基中病毒培养而未暴露于趋化因子的对照孔(100％感染率)的感染百分比(±1标准偏差)。表11CCL5抑制人类上皮细胞受RSV感染aa.HEp-2细胞单层暴露于1、5或10μg/ml的CCL5(RANTES)、CCL3(MlP-1α)或CCL4(MIP-1β)1小时。其后，用培养基冲洗单层3次，并且用RSV的A2菌株感染1小时。培养3天后，计数菌斑以确定病毒感染程度。将数据表示为相对于仅经培养基中病毒培养而未暴露于趋化因子的对照孔(100％感染率)的感染百分比(±1标准偏差)。表12RSV感染的抑制依赖于CCL5的预先投放aa.在感染(PRE)前1小时或在移除RSVA2(POST)后小时，HEp-2细胞单层经10μg/mlCCL5、CCL3、CCL15(MIP-1δ)或CXCL12(SDF-1)处理。三天后，计数菌斑，并表示为相对于仅经培养基中病毒培养而未暴露于趋化因子的对照孔(100％感染率)的感染百分比(±1标准偏差)。表13感染的抑制依赖于CCL5的预先投药或与RSV同时投药，并且对热变性敏感aa.CCL5(10μg/ml)或/和等体积PBS在感染前(PRE)1小时投放，或者同时(SIM)与RSV混合投放至HEp-2细胞单层。其他组包括由热(HEAT)变性的CCL5。其后3天计数菌斑。实例3CCL5阻断上皮细胞与RSV融合(F)蛋白间的互作为了确定直接通过阻断病毒与细胞表面配体的互作，或者其次在配体-受体互作之后向外部传递信号途径中是否发生感染的抑制，用保留N-末端甲硫氨酸(met)-CCL5的rCCL5进行实验(Proudfoot等人，1996)。Met-CCL5保留起始甲硫氨酸，并且在受体结合后无生物活性(Simmons等人，2000)。在最大测试剂量(20μgmet-CCL5/ml)下，感染率大约为对照细胞的25％(图1)。met-CCL5的抑制特性也依赖于剂量。1.25μgmet-CCL5/ml的预先处理导致大约80％的感染率，而0.313或0.156μgmet-CCL5/ml剂量无抑制性。当在4℃下相继进行感染和rCCL5投放以阻止CCR聚集时，也测试对复制的抑制，这对于向外部传递信号是重要的(Blanpainetal.，2002)。4℃下经20μgrCCL5/ml预处理(1小时)后，感染率大约为对照组的14％，并且与当于37℃下相继经rCCL5处理并感染时所观察到的感染率相似(16％)(表14)。因此，数据表明，rCCL5能够在可能限制细胞内信号传递级联的条件下(4℃)抑制复制。表14人类上皮细胞系在4℃或37℃下经CCL5预先处理后抑制RSV感染aa.HEp-2细胞单层在4℃或37℃下经指定剂量的重组CCL5预处理1小时。RSVA2感染三天后，计数菌斑，并表示为相对于仅经培养基中病毒培养而未暴露于趋化因子的对照孔(100％感染率)的感染百分比。最近报导，活化支气管上皮细胞表达CCR3(Stellato等人，2001)。因为CCL5也是CCR1和CCR5的配体(Pakianathah等人，1997)，因此通过流式细胞术来检查上皮细胞以确定已知结合CCL5的受体。图2所示的结果证实，在HEp-2和A549上皮细胞表面上表达CCR3。未检测到CCR1和CCR5。因此，数据表明，CCL5阻断RSV与上皮细胞表面上CCR3之间的互作。测试其他已知与CCR3结合的重组趋化因子(Baggiolini，2001)以确定其是否降低感染率。用递升量的重组嗜酸性粒细胞趋化因子/CCL11、MCP-2/CCL8或MIP-1δ/CCL15来预先处理HEp-2细胞单层并不减弱RSV的感染性(表10和表12)。因为CXCR4也功能性地表达在活化支气管上皮细胞上(Eddleston等人，2002)，因此也测试重组SDF-1α/CXCL12，但不减弱感染(表12)。在多克隆或单克隆抗趋化因子受体抗体存在下，HEp-2细胞单层的预培养或侵染不降低RSV感染性(数据未显示)。通过检查rCCL5抑制缺失位于病毒包膜中3个糖蛋白(F、G和SH蛋白)中一或两个的RSV菌株的感染的能力来进一步研究抑制机制。用缺失SH蛋白(rA2cpts248/404ΔSH)或G蛋白C-末端的外部域在氨基酸118处截短(rA2cpGΔ118)的经遗传修饰的菌株来进行一系列研究。表15证明，相对于仅以培养基中病毒培养的对照细胞，经10μg/mlrCCL5或met-CCL5预处理降低rA2cpGΔ118和rA2cpts248/404ΔSH病毒的感染性。用rCCL5(10μg/ml)预先处理也降低由突变型cp32/D1(缺少SH和G蛋白)和RSV的亲代B1菌株的感染(表8)。因此，rCCL5抑制缺失G和/或SH蛋白的病毒的感染。总体来说，数据表明，rCCL5阻断发生在包膜内F蛋白与上皮细胞表面之间的互作。表15CCL5抑制缺失SH和/或G包膜糖蛋白的突变型RSV菌株感染HEP-2细胞aa.HEp-2细胞单层经10μg/ml重组CCL5或met-CCL5处理1小时。移除CCL5之后，单层经指定RSV菌株感染。实验1和实验2表示2个独立研究的结果。3(A2)或5天(rA2cpΔ118、248/404、248/404ΔSH、B1和cp32/D1)培养之后观察菌斑。将数据表示为相对于仅经培养基中病毒培养而未暴露于趋化因子的对照孔(100％感染率)的感染百分比。b.ND表示未完成。实例4由CCL5的合成N-末端肽活体内抑制RSV感染CCL5可以通过阻断包膜内F蛋白与上皮细胞表面上趋化因子受体(例如CCR3)或负电荷葡糖胺聚糖(GAG)之间的互作来抑制感染。F蛋白具有由正电荷氨基酸组成的肝磷脂结合(HBD)基序，所述基序对于气道上皮细胞的感染是重要的(Feldman等人，2000)。显示CCL5的C末端α-螺旋区对于抑制HIV-1感染有所作用(Burns等人，1998)。与同源受体或GAG互作的氨基酸残基分别位于CCL5的N-末端(Pakianathan等人，1997)和C-末端(Proudfoot等人，2001)区。为了检测这些可能性，合成了一系列代表CCL5所有68个氨基酸的肽(15聚体，由7个氨基酸重叠)(表2)。作为起始筛选，将肽以生物素标记并且评估与人类上皮细胞的结合。图3描述代表性实验，其中递增浓度的经生物素标记肽在4℃下用活HEp-2细胞培养。所得到的数据指示，rCCL5和代表CCL5N-末端15个残基的肽1(SEQIDNO2)容易与上皮细胞单层结合。含有RSVG蛋白(Feldman等人，1999)的一致HBD的合成肽(肽19)也与单层结合。代表CCL5的HBD的肽7-9不容易与单层结合。因此，数据表明发生了感染抑制，这是因为CCL5的N-末端区(肽1；SEQIDNO2)阻断包膜内F蛋白与上皮细胞表面之间的互作。为了进一步验证所述假设，在BALB/c小鼠模型中评估CCL5的相同肽对RSVA2菌株感染的抑制。表16和表17中所描述的结果是5个实验的代表。结果证实，当同时与病毒投与(表16和表17)或在感染之前1小时给药(表17)时，肽1(500微克/剂量，10mg/ml)活体内有抑制性。感染4天后未经处理的BALB/c小鼠的肺含有每克组织大约5log10PFU。相比较来说，经共投与肽1的小鼠肺部的RSV滴定度为1,000(表16和表17)至100倍(表16)以下。当肽1在感染之前1小时投放时，病毒负载量减少超过50倍，并且显着地少于未经处理小鼠中所观察的病毒负载量(表17)。在5个实验中与投与300μg或更多的肽1相关的病毒负载量的平均减少量为2.4log10。肽1的抑制特性依赖于剂量。共投与300-500μg肽1显着地降低病毒负载量。250μg或125μg剂量下未观察到此现象(表16)。与rCCL5活体外研究相似(表12)，当感染之后1小时投与时，肽1不抑制感染(表17)。数据揭示，代表CCL5的C-末端HBD(肽7-9)的肽(500微克/剂量，10mg/ml)抑制性较低。表16中所示的数据证实，共投与肽8或9与RSV降低感染性(大约10倍)。所有实验中与500微克/剂量的肽7-9相关的病毒负载量的平均减少量分别为1.1、1.0和1.4log10。所有实验中与500微克/剂量的肽2、4和6相关的病毒负载量的平均减少量分别为0.9、1.2和0.5log10(数据未显示)。代表氨基酸184-198的肽19、RSVG蛋白的HBD和医药化合物RFI-641(Razinkov等人，2001)抑制RSV感染。因此，在CCL5肽中，肽1活体外结合活上皮细胞，并且活体内最具抑制性。所有肽活体外的抑制仅在391至525μM的IC50值时发生(数据未显示)。表16CCL5的合成肽活体内抗病毒活性aa.对BALB/c小鼠同时投与等体积混合的RSVA2(约1×106PFU)和指定量(微克/剂量)的合成肽。其后4天，确定肺中几何平均传染性病毒滴定度(±1标准偏差)。测定的检测极限大约为1.5log10。每组有5只小鼠。b.向对照小鼠投与与指定量的肽#19(代表RSVG蛋白的肝磷脂结合域)、RFI-641和PBS混合的RSV。表17当在RSV感染之前而非之后给药时，CCL5的肽1活体内有抑制性a.对BALB/c小鼠在感染之前1小时(Pre)或之后1小时(Post)投与500μg指定CCL5肽1，或者以等体积混合并与RSVA2同时投与。向对照小鼠投与相当剂量(约1×106PFU)的与肽#7或PBS等体积混合的RSV。4天后，测定几何平均传染性病毒滴定度(±1标准偏差)。测定的检测极限大约为1.5log10。每组有5只小鼠。实例5CCL5与CCL3多肽序列的比较如实例2详述，趋化因子CCL5而非CCL3(MIP-1α)或CCL4(MIP-1β)抑制上皮细胞RSV感染。这表明RSV利用不同于CCR5的受体。因此，为了进一步阐述CCL5所介导的RSV感染的抑制的序列和/或结构要求，通过氨基酸序列比对(表6)、水疗法曲线(图4A和图4B)和分子模型化/直观化(数据未显示)来比较CCL5和CCL3多肽。CCL5(SEQIDNO1)和CCL3(SEQIDNO21)的氨基酸序列首先通过有间隙的“BLAST2序列”比对算法(BLASTP版本2.2.6；缺省矩阵BLOSUM62)进行比较，这种算法是采用对于成对蛋白-蛋白(或DNA-DNA)序列比较的BLAST引擎并且通过使用动态程序设计来延伸重要比对残基对而产生有间隙的比对的交互式工具(Tatusova和Madden，1999)。CCL5氨基酸序列展现在BLASTP比对上方(加框残基)，并且CCL3氨基酸序列展现在比对下方(表6)。CCL5(氨基酸残基4-68)和CCL3(氨基酸残基3-69)的BLAST比对表明所述多肽共享32个一致氨基酸(即48％序列一致性)，并且具有约78％氨基酸序列相似性。比对包括CCL5(SEQIDNO1)的Tyr7与Tyr8之间的一个氨基酸间隙，CCL5前3个NH2-末端氨基酸的遗失(SEQIDNO1的Ser1-Tyr3)，CCL3前2个NH2-末端氨基酸的遗失(SEQIDNO21的Ser1-Leu2)和CCL3的COOH-末端氨基酸的遗失(SEQIDNO21的Ala69)。全长CCL5与全长CCL3的水疗法曲线(Kyte和Doolittle，1982)的比较(图4A和图4B)指示CCL5与CCL3之间的最大水疗序列分歧发生在这些多肽的NH2-末端内。举例来说，CCL5的前4个NH2-末端氨基酸(Ser1-Pro2-Tyr3-Ser4)为亲水性，而CCL3的前4个NH2-末端氨基酸(Ser1-Leu2-Ala3-Ala4)主要是疏水性(数据未显示)。CCL5和CCL3的前四个氨基酸的水疗法评分不能以滑动窗口尺寸9加以计算，且因此这些氨基酸在图4A和图4B中所展示的水疗法曲线中省略。CCL5的NH2-末端保持亲水性直至氨基酸8(Ser8)，随后接着是NH2-环结构的疏水性氨基酸Pro9-Cys10-Cys11-Phe12-Ala13-Tyr14-lso15-Ala16。令人感兴趣的是，CCL3的NH2-末端，直至约氨基酸30，与CCL5的水疗法特征具有倒转的关系(或镜像)。相反，从约氨基酸31至COOH-末端的结尾，这两个多肽的水疗法特征几乎一致(图4A)。用公开可用的(即通过ExPASy万维网服务器可得到的)软件包SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer(Guex和Peitsch，1997)模型化CCL5(PBD1RTO；Skelton等人，1995)与CCL3(PBD1B53；Czaplewski等人，1999)的能量最低结构。这两个蛋白的三级结构(或折叠)重叠，而NH2-末端氨基酸1至7和COOH-末端氨基酸64至68(数据未显示)除外。碳骨架的最佳拟合分析(SWISS-MODEL“MagicFit”)描绘(绘制带状图)全长CCL5多肽(SEQIDNO1的氨基酸Ser1至Ser68)和全长CCL3多肽(SEQIDNO22的氨基酸Ser1至Ala69)。与水疗法曲线相似，CCL5与CCL3之间的最大结构序列分歧发生在NH2-末端氨基酸残基内。最后，从结构上分析包含肽1片段(即氨基酸1至15)的CCL5蛋白的NH2-末端部分(数据未显示)，其被证明针对RSV感染是最具抑制性的。用BrookhavenProteinDataBank分子坐标(分别以1RTO、1EQT和1B3A名存放)通过计算机模拟(SWISS-MODEL和Swiss-PdbViewer)计算CCL5、Met-CCL5和AOP-CCL5的二面角(φ和ψ)。这些计算的结果展示于表7中。实例6趋化因子促效剂测定趋化因子测定。根据由Proudfoot等人(1996)修改的Gong和Clark-Lewis方法(1995)实现THP-1细胞趋化性(细胞迁移)。简单来说，将200μl培养基(含有0.01MHEPES、10％热灭活胎牛血清、2mML-谷氨酰胺和0.005％庆大霉素(gentamicin)的RPMI1640)中的5.6×105细胞置于安装有5-μm滤纸的96孔Boyden微腔(NeuroProbe；CabinJohn，MD)的上腔室中。随后，将含有配体和Met-CCL5适当稀释液的370μl上述培养基(减去胎牛血清)置于96孔Boyden微腔的下腔室中。在37℃、5％CO2下培养60分钟后，从上方孔中移出细胞，并且加入200μl含有20μMEDTA的磷酸盐缓冲盐水以分开粘附于滤纸上的细胞。在4℃下培养30分钟后，在1800×g下离心所述板10分钟，并且从下方孔中移除上清液。通过CellTiter96TM非放射性细胞增殖测定(Promega)来测量迁移细胞数目，此测定监控四唑蓝(tetrazoliumblue)转化成其甲(formazan)产物。如Fincham等人(1988)所述测量单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化性。简单来说，将50ml新鲜血液收集于含有0.1MEDTA、3％右旋糖和3％葡萄糖的15-ml溶液中以防止聚集。使所述混合物在37℃下沉淀1小时。通过将14ml血浆在7mlFicoll上分层并且将所述离心机解除制动而在15℃下296×g离心20分钟来分离PMN和淋巴细胞。淋巴细胞位于Ficoll与血浆的界面处，而PMN形成球粒(pellet)。通过低渗溶解从PMN移除污染的红血球(主要是嗜中性粒细胞)，并且洗涤残余白血球并以106个白血球/毫升的浓度重悬于RPMI1640培养基中。通过加入106个绵羊红血细胞/毫升并且在4℃下散开(rosetting)60分钟，接着再进行Ficoll梯度离心，而从淋巴细胞部分纯化大约40-50×106个单核细胞/毫升。在PBS缓冲液(140mMNaCl、3mMKCl、8mMNa2HPO4、1.5mMKH2PO4，pH7.4)中洗涤单核细胞，并且重悬于RPMI1640培养基中。用96孔Boyden微腔测定单核细胞和嗜中性粒细胞的趋化性。在培养基(含有2mML-谷氨酰胺、25mMHEPES和10％热灭活胎牛血清的RPMI1640)中制得受试抗病毒分子(例如，经修饰的NH2-末端CCL5肽片段)的连续稀释液。向测定孔的下方腔室中加入25μl趋化因子(chemoattractant)，并且用不含聚乙烯吡咯烷酮的聚碳酸酯膜覆盖，所述膜的孔隙大小对嗜中性粒细胞而言为3μm，而对单核细胞为5μm。向顶部孔中加入含有106个细胞/毫升的50μl溶液。对于嗜中性粒细胞，将测定板在37℃下培养20分钟，而对于单核细胞，培养30分钟。随后用PBS缓冲液洗涤膜的上表面，且将膜下侧的细胞固定于甲醇中。用Field’sA和B染剂的混合物(Bender和Hobein)对膜进行染色，并且风干。随后用ZeissAxiophot显微镜和VIDAS图像分析软件(KONTRONElectronics，Zurich，Switzerland)计数膜表面下的细胞。钙流动测定。用重组或合成CCL5和10-10M浓度范围的受试抗病毒分子来测量嗜中性粒细胞细胞内钙的流动。在37℃下，以2μMFura-2染料在KrebsRinger缓冲液(1.36mMNaCl、1.8mMKCl、1.2mMKH2PO4、1.2mMMgSO4、5mMNaHCO3、1.2mMCaCl2、0.21mMEGTA、5.5mMD-葡萄糖、20mMHEPES)中培养细胞30分钟。Fura-2染料在340nm下受激发，并且用荧光计在500nm下监控荧光发光。用等式[Ca]＝Kd(F-Fmin)/(Fmax-F)计算细胞内Ca2+，其中Kd是Ca2+结合染料的离解常数，且F是任意荧光单位。加入过量的10mMEGTA以螯合Ca2+并且计算Fmin。通过加入20mM三羟甲基氨基甲烷来调节pH值至8.5，并且用50μM毛地黄皂苷(digitonin)溶解细胞。由将所溶解细胞暴露于过量1mMCa2+后的荧光值计算Fmax。参考文献美国专利5,258,454美国专利5,556,747美国专利5,789,166美国专利6,391,548美国专利5,817,879Akerlind等人，″Respiratorysyncytialvirusheterogeneityofsubgroupstrains″，JGenVirol，692145-2154，1988。Altschul等人，″Basiclocalalignmentsearchtool″，J.Mol.Biol.，215403-410，1990。Appay和Rowland-Jones，″RANTESaversatileandcontroversialchemokine″，TrendsImmunol，2283-87，2001。Arenzana-Seisdedos等人，″HIVBlockedByChemokineAntagonist″，Nature，383400，1996。Baggiolini，″Chemokinesinpathologyandmedicine″，JInternMed，25091-104，2001。Barany等人，Int.J.PeptideProteinRes.30，705-739，1987。Barron和Zuckermann，″BioinspiredPolymericMaterialsIn-BetweenProteinsandPlastic″，Curr.Opin.Chem.Biol.，3681-687，1999。Bartz等人，″Respiratorysyncytialvirusdecreasesthecapacityofmyeloiddendriticcellstoinduceinterferon-gammainnaiveTcells″，Immunology，10949-57，2003。Beaulieu等人，″Expressionofafunctionaleotaxin(CCchemokineligand11)receptorCCR3byhumandendriticcells″，JImmunol，1692925-2936，2002。Becker等人，″RSVinfectionofhumanairwayepithelialcellscausesproductionofthebetachemokineRANTES″，Am.J.Physiol，272L512-520，1997。Berger等人，″ChemokinereceptorsasHIV-1coreceptorsRolesinviralentry，tropismanddisease″，AnnuRevImmunol，17657-700，1999。Blanpain等人，″MultipleactivestatesandoligomerizationofCCR5revealedbyfunctionalpropertiesofmonoclonalantibodies″，Mol.Biol.Cell，13723-737，2002。Bode和Huber，Eur.J.Biochem.204433-451，1992。Bonville等人，″Macrophageinflammatoryprotein-1-alphaandRANTESarepresentinnasalsecretionsduringongoingupperrespiratorytractinfection″，PedAllergyandImmunology，1039-44，1999。Bourgeois等人，″Heparin-likestructuresonrespiratorysyncytialvirusareinvolvedinitsinfectivityinvitro″，JVirol，727221-7227，1998。Burns等人，″Anewmonoclonalantibody，mAb4A12，identifiesarolefortheglycosaminoglycan(GAG)bindingdomainofRANTESintheantiviraleffectagainstHIV-1andintracellularCa2+signaling″，JExpMed，1881917-1927，1998。Chung等人，″TheThree-DimensionalSolutionStructureofRANTES″，Biochemistry，349307-9314，1995。Clark-Lewis等人，M.J.Biol.Chem.，26916075-16081，1994。Crowe等人，″Afurtherattenuatedderivativeofacold-passagedtemperature-sensitivemutantofhumanrespiratorysyncytialvirusretainsimmunogenicityandprotectiveefficacyagainstwild-typechallengeinseronegativechimpanzees″，Vaccine，12783-790，1994。Crowe等人，″LivesubgroupBrespiratorysyncytialvirusvaccinesthatareattenuated，geneticallystable，andimmunogenicinrodentsandnonhumanprimates″，JInfectDis，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TyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIle151015<210>3<211>15<212>PRT<213>智人<400>3ThrProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAla151015<210>4<211>15<212>PRT<213>智人<400>4IleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyr151015<210>5<211>15<212>PRT<213>智人<400>5AlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGlyLysCysSerAsn151015<210>6<211>15<212>PRT<213>智人<400>6TyrThrSerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPheValThr151015<210>7<211>14<212>PRT<213>智人<400>7ProAlaValValPheValThrArgLysAsnArgGlnValCys1510<210>8<211>15<212>PRT<213>智人<400>8ThrArgLysAsnArgGlnValCysAlaAsnProGluLysLysTrp151015<210>9<211>15<212>PRT<213>智人<400>9CysAlaAsnProGluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSer151015<210>10<211>15<212>PRT<213>智人<400>10GluLysLysTrpValArgGluTyrIleAsnSerLeuGluMetSer151015<210>11<211>12<212>PRT<213>智人<400>11ThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgPro1510<210>12<211>12<212>PRT<213>智人<400>12ProCysCysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuPro1510<210>13<211>12<212>PRT<213>智人<400>13CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAla1510<210>14<211>12<212>PRT<213>智人<400>14HisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGlyLysCys1510<210>15<211>12<212>PRT<213>智人<400>15SerGlyLysCysSerAsnProAlaValValPheVal1510<210>16<211>19<212>PRT<213>智人<400>16CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGlu151015TyrPheTyr<210>17<211>24<212>PRT<213>智人<400>17CysPheAlaTyrIleAlaArgProLeuProArgAlaHisIleLysGlu151015TyrPheTyrThrSerGlyLysCys20<210>18<211>34<212>PRT<213>智人<400>18SerProTyrSerSerAspThrThrProCysCysPheAlaTyrIleAla151015ArgProLeuProArgAlaHisIleLysGluTyrPheTyrThrSerGly202530LysCys<210>19<211>19<212>PRT<213>智人<400>19TyrPheTyrGluLysIleHisAlaArgProLeuProArgAlaIleTyr151015AlaPheCys<210>20<211>34<212>PRT<213>智人<400>20CysLysGlySerThrTyrPheTyrGluLysIleHisAlaArgProLeu151015ArgProAlaTleTyrAlaPheCysCysProThrThrAspSerSerTyr202530ProSer<210>21<211>15<212>PRT<213>智人<400>21IleTyrAlaPheCysCysProThrThrAspSerSerTyrProSer151015<210>22<211>69<212>PRT<213>智人<400>22SerLeuAlaAlaAspThrProThrAlaCysCysPheSerTyrThrSer151015ArgGlnIleProGlnAsnPheIleAlaAlaTyrPheGluThrSerser202530GlnCysSerLysProGlyValIlePheLeuThrLysArgSerArgGln354045ValCysAlaAspProSerGluGluTrpValGlnLysTyrValSerAsp505560LeuGluLeuSerAla6权利要求1.一种包含CCL5多肽的抗病毒组合物，其中所述CCL5多肽抑制哺乳动物受检者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述副粘病毒是呼吸道合胞病毒(RSV)。3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述CCL5多肽通过阻断RSV融合(F)蛋白与哺乳动物上皮细胞之间的互作来抑制RSV感染。4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CCL5多肽是合成CCL5多肽或经重组表达的CCL5多肽。5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述CCL5多肽在哺乳动物受检者中作为趋化因子是无生物活性的。6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述哺乳动物受检者是人类。7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述哺乳动物受检者是经驯养的非人类哺乳动物，其选自由牛、马、猪、狗、猫、山羊和绵羊组成的群组。8.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列。9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CCL5多肽是NH2-末端经修饰的CCL5多肽。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述NH2-末端经修饰的CCL5多肽是选自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬酰基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5组成的群组。11.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含一个或一个以上的CCL5肽片段，其中所述片段包含SEQIDNO1的CCL5多肽的约10至20个相邻氨基酸。12.根据权利要求11所述的组合物，其中所述一个或一个以上的CCL5肽片段是选自由SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18组成的群组。13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述CCL5肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列。14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述SEQIDNO2肽片段进一步被定义为SEQIDNO1的NH2-末端肽。15.根据权利要求1所述的组合物，其中所述CCL5多肽进一步被定义为人类CCL5多肽。16.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆转CCL5多肽。18.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含结合CCR3趋化因子受体的有机分子。19.根据权利要求18所述的组合物，其中所述有机分子是CCR3受体拮抗剂。20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述有机分子包含一个或一个以上的式I、II或III的化学结构。21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是通过鼻内投药或非经肠投药而投与哺乳动物受检者。22.根据权利要求1所述的组合物，其进一步包含为CCR1拮抗剂或CCR5拮抗剂的有机分子。23.一种重组表达载体，其包含编码根据权利要求1所述的CCL5多肽的多核苷酸序列。24.一种经根据权利要求23所述的载体转染、转化或侵染的宿主细胞。25.一种包含CCL5多肽的NH2-末端肽片段的抗病毒组合物，其中所述片段包含CCL5多肽的NH2-末端的约10至20个相邻氨基酸，其中所述片段抑制哺乳动物受检者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。26.根据权利要求25所述的组合物，其中所述副粘病毒是RSV。27.根据权利要求25所述的组合物，其中所述CCL5多肽包含SEQIDNO1氨基酸序列。28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述NH2-末端肽片段包含选自由以下序列组成的群组的氨基酸序列SEQIDNO2、SEQIDNO3、SEQIDNO4、SEQIDNO5、SEQIDNO6、SEQIDNO7、SEQIDNO8、SEQIDNO9、SEQIDNO10、SEQIDNO11、SEQIDNO12、SEQIDNO13、SEQIDNO14、SEQIDNO15、SEQIDNO16、SEQIDNO17和SEQIDNO18。29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述NH2-末端肽片段包含SEQIDNO2氨基酸序列。30.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物在哺乳动物受检者中作为趋化因子是无生物活性的。31.根据权利要求25所述的组合物，其中所述组合物是通过鼻内投药或非经肠投药而投与哺乳动物受检者。32.根据权利要求25所述的组合物，其中所述NH2-末端CCL5肽片段通过阻断RSV融合(F)蛋白与哺乳动物上皮细胞之间的互作来抑制RSV感染。33.根据权利要求25所述的组合物，其进一步包含一个或一个以上选自由氨氧基戊烷-CCL5(AOP-CCL5)、Met-CCL5、Nα-壬酰基-CCL5(NNY-CCL5)、Δ1-2截短型CCL5和Δ1-8截短型CCL5组成的群组的NH2-末端经修饰的CCL5多肽。34.根据权利要求25所述的组合物，其进一步包含SEQIDNO1的CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物。35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物是包含SEQIDNO19、SEQIDNO20或SEQIDNO21氨基酸序列的逆转CCL5多肽。36.根据权利要求25所述的组合物，其进一步包含为CCR1受体、CCR3受体或CCR5受体的拮抗剂的有机分子。37.一种重组表达载体，其包含编码根据权利要求25所述的NH2-末端CCL5肽片段的多核苷酸序列。38.一种经根据权利要求37所述的载体转染、转化或侵染的宿主细胞。39.一种有机小分子模拟物，其是通过使用SEQIDNO1的前15个CCL5NH2-末端氨基酸的原子X、Y、Z坐标的基于计算机的分子模型化设计而成，其中所述X、Y、Z坐标见于选自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A组成的群组的BrookhavenProteinDataBank文件中。40.一种包含根据权利要求39所述的有机分子的抗病毒组合物。41.一种CCL5多肽的NH2-末端的肽模拟物，其中所述肽模拟物抑制哺乳动物受检者受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒的感染。42.根据权利要求41所述的肽模拟物，其中所述模拟物是通过使用SEQIDNO1的前15个CCL5NH2-末端氨基酸的原子X、Y、Z坐标的基于计算机的分子模型化设计而成，其中所述X、Y、Z坐标被包含于选自由1RTN、1RTO、1EQT和1B3A组成的群组的BrookhavenProteinDataBank文件中。43.根据权利要求41所述的肽模拟物，其中所述模拟物是回折模拟物。44.根据权利要求43所述的肽模拟物，其中所述回折模拟物是β-转角模拟物、单环β-转角模拟物、双环β-转角模拟物、γ-转角模拟物或单环γ-转角模拟物。45.一种包含根据权利要求41所述的肽模拟物的抗病毒组合物。46.一种用于预防或抑制哺乳动物宿主受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，所述方法包含对所述宿主投与医药学有效量的根据权利要求1所述的组合物。47.一种用于预防或抑制哺乳动物宿主中副粘病毒感染的方法，所述方法包含对所述宿主投与医药学有效量的根据权利要求25所述的组合物。48.一种用于预防或抑制哺乳动物宿主中副粘病毒感染的方法，所述方法包含对所述宿主投与医药学有效量的根据权利要求39所述的组合物。49.一种用于预防或抑制哺乳动物宿主受副粘液病毒科(副粘病毒)病毒感染的方法，其中所述方法包含对所述宿主投与医药学有效量的根据权利要求41所述的组合物。全文摘要本发明针对用于投与易受副粘病毒感染，尤其是呼吸道合胞病毒(RSV)感染的哺乳动物宿主(例如人类)的抗病毒素。在某些实施例中，本发明的抗病毒分子是多肽、趋化因子多肽、趋化因子多肽片段、有机小分子或肽模拟物，其中所述抗病毒分子抑制或预防哺乳动物细胞的副粘病毒感染。文档编号A61P31/14GK1902223SQ200480039227公开日2007年1月24日申请日期2004年12月28日优先权日2003年12月30日发明者杰拉尔德·欧文·汉考克,保罗·威廉·特比申请人:惠氏公司