具有改进耐受性的免疫原组合物中的疏水性蛋白调配物的制作方法

专利名称：具有改进耐受性的免疫原组合物中的疏水性蛋白调配物的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于诱导对于疏水性膜蛋白(例如孔蛋白(porin))之免疫反应的不引起疼痛或引起较少疼痛的免疫原性和医药组合物。这些组合物用于预防或治疗哺乳动物疾病，例如脑膜炎或淋病。
背景技术：
大部分以蛋白为主的医药品或者不含有去污剂或者含有相对温和的去污剂，例如TWEEN80(聚山梨醇酯80)或TWEEN20。然而，这些温和去污剂通常不能够溶解某些疏水性膜蛋白。当疏水性膜蛋白从膜上分离时，其所暴露的疏水性区域互相作用，引起蛋白分子聚结并且从水溶液中沉淀出。这些蛋白可以通过对疏水性基团和水均有亲合力的去污剂来溶解。离子去污剂结合膜蛋白暴露的疏水性区域，以及结合水溶性蛋白的疏水性核心。由于其电荷，因此这些去污剂通常通过破坏离子键和氢键来变性蛋白。举例来说，高浓度的十二烷基硫酸钠完全变性蛋白。相反，高浓度的非离子去污剂通过形成去污剂、磷脂和疏水性膜蛋白的混合胶束来溶解生物膜。然而，变性蛋白和混合胶束中的蛋白通常不是最适宜用作免疫原组合物。低浓度的这些去污剂可能不溶解疏水性膜蛋白。已经显示两性离子去污剂有效地溶解从天然膜中提取的疏水性膜蛋白，并且当这些蛋白重组产生时促进这些蛋白的再折叠。参看Matsuka，Y.V.等人，J.ProteinChemistry 17(7)719-728(1998)。如下文所述，目前需要包含膜蛋白的有效免疫原组合物，例如来自病原体脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)和淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)。
脑膜炎双球菌脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)是格兰氏阴性的包膜双球菌，其是专性人类病原体并且是流行性乙型脑炎的病因体，所述流行性乙型脑炎是脑膜炎的一种最具破坏性形式。这些细菌遍布全世界，并且可以引起突发性和流行性疾病。脑膜炎奈瑟菌的人对人转移主要是通过空气途径进行，并且是人与人近距离接触场所的一个显著问题，例如监狱、军营、宿舍、学校教室和日托中心。在任何时候，2与10％之间的人口无症状地携带此生物体(Greenfield等人，J.Infec.Dis.1971，12367-73；Moore等人，Scientific American 1994，38-45；Romero等人，Clinicai Microbiology Review1994，7559-575)。因为所述的高携带率，因此一直存在爆发或流行的威胁或潜能。
由血清组指定，脑膜炎奈瑟菌的血清学分类是基于特定菌株的荚膜多糖组合物。在脑膜炎球菌中至少存在13个不同血清组A、B、C、29-E、H、I、X、L、W135、X、Y和Z。这些血清组中A、B、C和W135是最常见的疾病起因。血清组A、C和W135中荚膜的性质引起抗这些血清组的可用免疫原组合物的形成。然而，认为血清组B荚膜多糖不适于用于人类。因为需要抗血清组B的免疫原组合物，因此致力于表征各种膜蛋白(例如孔蛋白)的抗原性和免疫原性。一些主要的蛋白抗原包括外部膜蛋白(OMP)，例如1类(Por A，一种阳离子特异性孔蛋白)、2或3类(Por B，一种阴离子特异性孔蛋白)以及较次要的4类、5类OMP(Rmp，和Ope与Opa不透明相关性蛋白)和载脂表面蛋白。
淋病奈瑟菌淋病是目前全世界一种最广泛的性病，每年仅美国就发生数百例。所述疾病的病原体是淋球菌淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)，其是一种贯穿其历史发展出对于传统抗生素治疗和在某种程度上对于正常人类血清的杀菌活性的抗性的细菌。无力通过传统手段控制感染引起对于可以有效预防感染的免疫原组合物的需要。
开发用于淋病的免疫原组合物领域的研究最为集中于外部膜蛋白。已经描述使用淋球菌膜部分的许多免疫原组合物，例如美国专利第4,203,971号、第4,288,557号和第4,681,761号。然而，大部分这些组合物含有蛋白与额外细胞物质的混合物，所述混合物的存在通常引起伴随所需免疫反应的不利炎症或生理反应。因此，需要更纯形式细菌抗原的免疫原组合物。
一个淋病免疫原组合物的候选是已知为蛋白I或Por的特异性外部膜蛋白。Por是疏水性膜蛋白，并且是淋病奈瑟菌的主要外部膜蛋白，其充当孔蛋白。认为孔蛋白通过导引小分子量物质穿越疏水性脂质外部膜而在细胞内运作。Por存在许多特征以使其成为可用于免疫原组合物的一种令人感兴趣的候选。首先，其至少部分负责奈瑟菌中的血清型特异性。其次，其展现为以其自然状态暴露于表面，并且诱导调理素的产生，所述调理素是结合于感染生物体表面的抗体以有助于巨噬细胞吞噬生物体。
在淋球菌中已经证实两种不同主要类型的Por分子，基于肽作图和对蛋白质水解的感受性而分为PorA(也已知为PIA)和PorB(也已知为PIB)。参看Barrera等人，Infect.Immun.1984，44565-568；Blake等人，Infect.Immun.1981，33212-222。发现此划分与血清组模式和发病机理有关系。表达PorA的淋球菌最可能与全身性感染相关，而表达PorB的淋球菌通常与局部感染相关。参看Buchanan等人，Infect.Immun.1981，32985-994；Hildebrandt等人，Infect.Immun.1978，20267-273。美国专利第5,736,361号中描述编码PIA的实质上经纯化的核酸分子。美国专利第6,068,992号中描述编码PIB的实质上经纯化的核酸分子。
因为疏水性膜蛋白，尤其是Por蛋白的潜在有益免疫原作用，因此仍然存在尚未实现的对于有效、可耐受次单位免疫原组合物和其制备方法的需要。更具体来说，需要由脑膜炎球菌或淋球菌疏水性膜蛋白组成的免疫原组合物，其制备简单、安全、不引起疼痛或引起较少疼痛，并且有效治疗和/或预防感染。

发明内容
本发明的一个实施例提供适于人类注射的疏水性蛋白的不引起疼痛组合物，所述不引起疼痛组合物包含(a)疏水性蛋白；(b)少于溶解蛋白所需量的一定量两性离子去污剂；和(c)有效维持蛋白在医药学可接受载剂中溶解性的一定量医药学可接受的非离子去污剂。本发明的实施例也提供对人类进行免疫化的方法，所述方法包含非经肠投与组合物，其中所述传染媒介物是人类病原体。
在本发明的另一个实施例中，提供一种制备适于投与哺乳动物的医药学可接受载剂中的疏水性蛋白的引起较少疼痛免疫原组合物的方法。所述方法包含以下步骤(a)用两性离子去污剂溶解所述疏水性蛋白以制得第一组合物；(b)改变所述第一组合物，以使得与所述第一组合物相比，所述经改变的组合物产生较少疼痛。在本发明的其他实施例中，提供改变包含疏水性蛋白和两性离子去污剂的组合物的方法，所述方法包括(i)稀释两性离子去污剂，(ii)用不引发疼痛的非离子去污剂替换两性离子去污剂，和(iii)加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持两性离子去污剂的浓度恒定。在另一个实施例中，改变步骤是稀释所述两性离子去污剂，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
在本发明的另一个实施例中，提供一种减少与向哺乳动物投与包含疏水性蛋白和两性离子去污剂的免疫原组合物相关疼痛的方法。所述方法包含改变所述组合物，以使得经改变的组合物与未经改变的组合物相比引起较少疼痛，以及投与所述免疫原组合物。在本发明的其他实施例中，提供多种改变包含疏水性蛋白和两性离子去污剂的组合物的方法，所述方法包括(i)稀释两性离子去污剂，(ii)用不引发疼痛的非离子去污剂替换两性离子去污剂，和(iii)加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持两性离子去污剂的浓度恒定。在另一个实施例中，改变步骤是稀释所述两性离子去污剂，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
在一个特定实施例中，所述两性离子去污剂是终浓度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸且所述非离子去污剂是终浓度高于其临界胶束浓度(CMC)的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
在本发明的另一个实施例中，在所述非离子去污剂中维持疏水性蛋白的溶解性。在本发明的一替代实施例中，改变步骤是稀释所述两性离子去污剂，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
在本发明的某些实施例中，在大鼠足垫模型中测量疼痛。在其他实施例中，如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，经改变的组合物产生至少约50％的疼痛减少。
在本发明的另一个实施例中，提供一种减少与向哺乳动物投与包含疏水性蛋白和两性离子去污剂的免疫原组合物相关疼痛的方法。所述方法包含改变所述组合物，以使得如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，经改变的组合物产生疼痛减少；和投与所述免疫原组合物，其中如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，所述经改变的组合物产生至少约50％的疼痛减少。
本发明的其他实施例提供一种在免疫原组合物中维持疏水性蛋白溶解性的方法，所述方法包含在不引发疼痛的非离子去污剂中溶解疏水性蛋白，其中不引发疼痛的非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
本发明的一个特定实施例提供一种用含有疏水性膜蛋白的组合物对人类进行免疫化而不引发疼痛的方法，所述方法包含选择Triton X-100作为医药学可接受去污剂用以维持疏水性蛋白在最终调配物中的溶解性；其中Triton X-100的浓度高于CMC。
在本发明的某些实施例中，两性离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组正辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。在本发明的一个特定实施例中，两性离子去污剂是正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸。
在本发明的其他实施例中，非离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。在本发明的一个特定实施例中，非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
在本发明的一个特定实施例中，所述两性离子去污剂是终浓度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸和终浓度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
在本发明的特定实施例中，疏水性蛋白是膜内在蛋白。在本发明的其他实施例中，所述膜内在蛋白源自选自由以下各物质组成群组的传染媒介物细菌、病毒、寄生虫和朊病毒(prion)。在一个实施例中，所述传染媒介物是细菌，且所述膜内在蛋白是孔蛋白。在一个特定实施例中，所述膜内在蛋白是淋球菌孔蛋白或脑膜炎球菌孔蛋白。
在本发明的一个实施例中，通过稀释去污剂、替换去污剂或添加不引发疼痛的去污剂来改变疼痛引发组合物的去污剂组份，以产生经改变但不引发疼痛的组合物。在本发明的一个特定实施例中，如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，经改变的组合物产生至少50％的疼痛减少。在本发明的一个特定实施例中，如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，经改变的组合物产生至少约75％的疼痛减少。在本发明的另一个实施例中，如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，经稀释或经替换的组合物产生至少约90％的疼痛减少。


图1此图是在对大鼠足垫注射之后，与引起疼痛两性离子去污剂(Zwittergent3-12)和不引起疼痛非离子去污剂(TritonX-100)的各种免疫原组合物相关联的疼痛的图形表示。保持引起疼痛两性离子去污剂的浓度恒定，并且加入增加量的第二不引起疼痛非离子去污剂。
具体实施例方式
本发明的实施例提供疏水性蛋白(例如疏水性膜蛋白)的组合物，尤其是具有可接受耐受性的免疫原组合物。本发明的实施例也提供制备所述组合物的方法。
尽管先前已经揭示了制备其中抗原是疏水性蛋白的免疫原组合物的方法，所述组合物或者含有已经发现在注射后引起哺乳动物疼痛的用于纯化的去污剂，或者含有温和去污剂，例如TWEEN80(聚山梨醇酯80)或TWEEN20，其不能够溶解某些疏水性蛋白。举例来说，已经用两性离子去污剂从细胞膜分离并纯化难以溶解的疏水性蛋白，例如膜内在蛋白。然而，本发明的一个发现在于这些免疫原组合物中两性离子去污剂的存在引起人类和哺乳动物注射后的疼痛，并且显著地降低所得免疫原组合物的耐受性至不可接受的水平。
本发明的实施例涉及出乎意外的发现，其在于以包含低于临界胶束浓度的非离子去污剂或两性离子去污剂的溶液投与的包含疏水性蛋白的免疫原组合物对受检者具有良好的耐受性。在本发明的另一个实施例中，加入引发较少疼痛或不引起疼痛的去污剂至高于临界胶束浓度的水平，而保持疼痛引发去污剂的浓度恒定，并且当投与受检者时所得组合物具有改进的耐受性。如本文所使用，具有“改进耐受性”的免疫原组合物是指包含疏水性膜蛋白和去污剂的免疫原组合物，与其中疏水性蛋白在作为唯一去污剂组份的0.05％ Zwittergent 3-14中投与的免疫原组合物相比，当注射至受检者时所述“改进耐受性”的免疫原组合物产生实质上较少的疼痛。
人类临床研究测试作为保护性免疫原组合物候选的重组淋球菌PorB(“rPorB”)。免疫原组合物含有0.5ml体积的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)和0.03％(w/v)Zwittergent(“Zw”)3-14(后者是溶解孔蛋白的两性离子去污剂)中的50μg重组淋球菌孔蛋白(“GC rPorB”)。然而，注射此组合物通过在注射处诱导不可接受水平的疼痛而显示较差的耐受性。接受GC rPorB的8名接受者中的每一名在注射之后随即感受到疼痛(3名严重，5名中度)而不考虑佐剂，其中2名接受各以下佐剂3-O-脱酰化单磷酰基脂质A(MPL)(Corixa，Hamilton，MT)、磷酸铝、MPL加磷酸铝，或无佐剂。注射之后20分钟内此疼痛消除。
在某种程度上，本发明的实施例起因于阐述重组次单位免疫原组合物中疼痛来源的努力。注射后的疼痛是影响非经肠免疫原组合物耐受性的严重的临床问题。因为上述疼痛发生在所有GC rPorB免疫原组合物群组中，而与佐剂无关，因此其不可能归因于特定佐剂或佐剂与免疫原组合物的相互作用。必须确定疼痛是否归因于孔蛋白自身、去污剂或两者的组合。在新西兰(New Zealand)白兔中所进行的GC rPorB免疫原组合物的研究未发现明显的毒性迹象和血液学、化学或病理学数据中的任何临床显著异常。接种处组织病理学评分未揭示归因于GC rPorB蛋白的任何显著不利反应。注射处的偶发和温和反应(浮肿和红斑)持续时间短暂，并且不与任何特异性抗原或佐剂相关。必须采用动物模型来确定疼痛的起因，以制备可耐受GC rPorB免疫原组合物。在某种程度上，本发明的实施例是基于本研究的结果。
使用先前用于检测与抗生素注射相关疼痛的动物模型，大鼠舔爪(paw-lick)(足垫)模型(Celozzi等人，J.Pharmacol.Methods，1980，4285-189；Comerski等人，Fundamental and Appl.Toxicology，1986，6335-338)。此模型监控大鼠举起、舔舐和咬住注射爪的所耗时间。此模型证明用于溶解GC rPorB的去污剂(Zwittergent3-12或Zwittergent3-14)造成注射后的疼痛。相似的研究已经显示去污剂辛基-糖苷与CHAPS(3-((胆酰胺基丙基)-二甲基铵基)-1-丙烷磺酸)也在注射后引发相当大的疼痛(如果存在的话)。
所属领域技术人员应该了解其他活体内疼痛模型或活体外相关疼痛可以用于确定疼痛引发免疫原组合物被改变为不引发疼痛免疫原组合物的时间。
然而，仅仅鉴别问题的起因并不预示着解决问题。本发明的方法和组合物起因于以强非离子去污剂稀释或替换两性离子去污剂产生注射后不引发不可接受疼痛反应的可耐受调配物的进一步发现。
本发明的实施例提供用两性离子去污剂纯化疏水性蛋白，随后降低两性离子去污剂的浓度以改进所得免疫原组合物的耐受性的方法。具体来说，本发明的实施例针对制备用于注射至受检者的含有疏水性膜蛋白的引起较少疼痛或不引起疼痛水平次单位的免疫原组合物。
在本发明的一个特定实施例中，疏水性蛋白溶解于两性离子去污剂，例如正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸(Zwittergent3-14)。术语“两性离子去污剂”是指总体电中性，但具有正电荷部分和负电荷部分，并且通常用于溶解疏水性蛋白的去污剂。所属领域技术人员应该了解本发明的一个实施例也可以接近起始溶解于其他两性离子去污剂或溶解于尿素中的疏水性蛋白的免疫原组合物。两性离子去污剂的非限制性实例包括正辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-8；正癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-10；正十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-12；正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-14；3-(N，N-正十六十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸，Zwittergent3-16；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸，CHAPS；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸，CHAPSO；正十二基-N，N-二甲基甘氨酸，EMPIGEN BB；和其他能够引发大鼠足垫模型疼痛的两性离子去污剂。

所属领域技术人员应该了解也可以用两性离子去污剂的组合来在重组表达之后从细胞膜或从包涵体中溶解或再折叠本发明的疏水性蛋白。
在本发明的一个特定实施例中，组合物中的两性离子去污剂经非离子去污剂稀释或替换。术语“表面活性剂”是指当以极低浓度使用时可以极大降低水表面张力的表面活性试剂。术语“去污剂”是指一类具有非极性、疏水性部分和极性、亲水性部分的两性分子的表面活性剂。术语“去污剂”和“表面活性剂”可以交替使用。去污剂通过插入至磷脂双层内并且溶解脂质和蛋白来破坏膜。去污剂分子的疏水性部分被碳氢化合物吸引，而亲水性部分强烈地被水吸引。一些去污剂为天然产物，但大部分为开发用于清洁和分散油水混合物的合成分子。去污剂的极性(亲水性)末端可以带电荷(离子)，如十二烷基硫酸钠(SDS)；或者不带电荷(非离子)，如Triton去污剂；或者可以具有正电荷部分和负电荷部分，如两性离子去污剂。
术语“非离子去污剂”是指充当不带电荷去污剂的分子。亲水性基团是由一些其他极具水溶性的部分组成，例如短、水溶性聚合物链，而不是带电荷种类。非离子去污剂传统上使用聚(氧化乙烯)链作为亲水性基团。聚(氧化乙烯)是水溶性聚合物；非离子去污剂中所用的聚合物通常为10至100单体单元长。用聚(氧化乙烯)链作为其亲水性基团的两类普通去污剂是醇乙氧基化物和烷基酚乙氧基化物。所属领域技术人员应该了解本发明的一个实施例可以接近经其他非离子去污剂稀释或替换的组合物。非离子去污剂的非限制性实例包括N，N-双(3-D-葡萄糖-酰胺基丙基)胆酰胺，BigCHAP；α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，TritonX-100；聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯，TWEEN20TM；聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯，TWEEN 80；聚氧乙烯(35)月桂基醚，BRIJ35；乙基酚聚(乙二醇醚)11，Nonidet P40，NP40；正辛基-b-D-葡萄哌喃糖苷，OG；和其他能够溶解疏水性蛋白的非离子去污剂。所属领域技术人员应该了解非离子去污剂的组合也可以用于溶解疏水性蛋白且减少与投与免疫原组合物中的所述蛋白相关的疼痛。

如本文所使用术语“疏水性”是指某些物质抵制水的倾向，或着倾向于不与水结合或不能够溶于水。如本文所使用术语“亲水性”是指某些物质被水吸引或溶于水的倾向。术语“疏水性蛋白”是指不可溶或仅轻微可溶于水的蛋白。疏水性蛋白通常显示与水和水溶性离子化合物最小的相关性，其实际上相互之间或与水相外部的其他脂质相关。
术语“组合物”是指用于对媒质或溶液进行保存或投放或同时保存与投放的含水媒质或溶液，其优选直接投与受检者。本发明一个实施例的组合物可以包含蛋白、两性离子去污剂和非离子去污剂。组合物的特征可在于其功能，例如免疫原性、治疗性或诊断性组合物。
术语“免疫原组合物”广泛是指可以投放以引出对存在于组合物中抗原的免疫原反应的任何组合物。本发明一个实施例的免疫原组合物可以包含抗原蛋白或多肽、两性离子去污剂、非离子去污剂和离子去污剂。免疫原组合物可以在接受者中用作预防剂或用作治疗。免疫原组合物通常包含免疫有效剂量的免疫原(例如传染媒介物的抗原)和医药学可接受载剂和视情况的佐剂。
如本文所定义“分离”意谓蛋白或多肽从特定来源获得和分离。举例来说，“从脑膜炎奈瑟菌分离”意谓蛋白或多肽从脑膜炎奈瑟菌获得和分离。经分离的物质可以(但不需要)经纯化。
如本文所定义“经纯化”是指令人感兴趣的蛋白或多肽已经实质上从天然与多肽发生的各种其他蛋白、脂质、核酸和碳水化合物组份分离。所存在的外源组份的残余量无论多少均不干扰免疫原组合物中经纯化物质的用途或作为抗原。术语“经纯化”并不预期排除保留其合成矫作物的合成多肽制剂；或者所述术语不意谓排除包括一些杂质的制剂，只要制剂展示可重现蛋白或多肽的特征数据即可，例如分子量、糖残余含量、色谱反应和免疫原行为。所述特征可以通过色谱、凝胶电泳、免疫测定、组合物分析、质谱分析或生物测定和其他所属领域已知的方法来评价。
纯化方法为所属领域所熟知。举例来说，多肽和蛋白可以通过各种方法来纯化，其包括(但不限于)制备性圆盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、倒相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分溶色谱法、沉淀和盐析色谱法、萃取和逆流分布法。因此，优选在重组系统中制备蛋白或多肽，所述重组系统中所表达的蛋白或多肽含有有助于纯化的附加序列标签，例如但不限于聚组氨酸序列或特异性结合抗体的序列，例如FLAG和GST。随后可以通过在适当固相基质上进行色谱以从宿主细胞的粗溶解液中纯化出蛋白或多肽。或者，抗蛋白或抗其所衍生的多肽而产生的抗体可以用作纯化试剂。通过各种技术纯化细胞，其包括离心、基质分离(例如尼龙羊毛分离)、淘筛和其他免疫选择技术、消耗(例如污染细胞的补足消耗)和细胞分选(例如荧光活化细胞分选[FACS])。其他纯化方法是可能的。经纯化的物质可以含有少于约50％，优选少于约75％，且最优选少于约90％的其最初相关的细胞组份。术语“实质上纯”指示最大程度的纯度，其可以通过使用所属技术领域已知的常规纯化技术完成。
如本文所使用术语“约”或“大约”意谓在50％的所给定值以内，优选为所给定值的20％以内，更加优选为10％以内，更加优选为5％以内，且最优选为1％以内。或者，术语“约”或“大约”意谓一个数值可能在此数值类型的科学可接受误差范围内，此取决于可用工具给出条件下如何进行测量的性质。“约”或“大约”定义围绕平均值的分布。除非另外说明，否则所有值均为近似的，并且固有地是在误差范围以内。
改变去污剂组合物本发明的实施例提供制备和投放包含疏水性蛋白的免疫原组合物的方法。所述方法涉及用两性离子去污剂溶液溶解或再折叠疏水性蛋白。本发明的某些实施例提供用非离子去污剂改变疏水性蛋白的去污剂组合物，因此如在大鼠足垫模型中所测量，与未经改变的组合物相比，经改变的组合物产生疼痛减少。如本文所使用“改变”是指通过一种以下的方法改进免疫原组合物耐受性的过程(i)稀释两性离子去污剂，(ii)用不引发疼痛的非离子去污剂替换两性离子去污剂，或者(iii)加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持两性离子去污剂的浓度恒定。
本发明的一个实施例提供制备包含疏水性蛋白的免疫原组合物的方法。在本发明的一个实施例中，所述方法包含用两性离子去污剂溶解蛋白，随后用非离子去污剂稀释两性离子去污剂以降低两性离子去污剂的浓度。在本发明的一个实施例中，至少以约2的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至约0.025％。在本发明的另一个实施例中，至少以约4的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至约0.02％。在本发明的另一个实施例中，至少以约5的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至约0.01％。在本发明的一个特定实施例中，至少以约7.5的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至0.067％。在本发明的一个实施例中，至少以约10的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至约0.005％。在本发明的另一个实施例中，至少以约15的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至约0.03％。在本发明的一个实施例中，至少以约20的因子稀释所述两性离子去污剂，例如约0.05％至约0.0025％。所属领域技术人员应该了解随着稀释因子的增加，稀释的过程开始变为替换过程。因为两性离子去污剂注射后可以引发疼痛，因此降低所述去污剂的浓度尤其至低于其临界胶束浓度的水平产生注射后引起较少疼痛的组合物。所属领域技术人员应该了解包含疏水性蛋白，尤其是疏水性膜蛋白(例如孔蛋白)的不引起疼痛或引起较少疼痛免疫原组合物的优势。
在本发明的一个实施例中，加入引发较少疼痛或不引起疼痛的去污剂至足以维持疏水性蛋白的溶解性而同时保持疼痛引发去污剂的浓度恒定的水平。在本发明的另一个实施例中，加入引发较少疼痛或不引起疼痛的去污剂至高于临界胶束浓度的水平，而保持疼痛引发去污剂的浓度恒定。尽管并不倾向于由任何特定理论所支持，相信向疼痛引发去污剂中加入不引起疼痛去污剂产生疼痛引发去污剂和不引发疼痛的去污剂的混合胶束，并且使得注射后所诱发的疼痛(改进的耐受性)减少或消除。参看实例8。
本发明一个实施例的制备免疫原组合物的替代方法涉及用两性离子去污剂溶解蛋白，随后将两性离子去污剂替换成非离子去污剂。替换去污剂的方法为所属技术领域已知。一种这样的技术是离子交换色谱法。在离子交换色谱中，蛋白首先溶解在含有两性离子去污剂的溶液中。随后将所溶解的蛋白负载于离子交换管柱上，例如已经用相同缓冲液平衡的Q-SepharoseTM管柱(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)。用含有可接受的非离子去污剂的溶液洗涤所结合的蛋白。用含有非离子去污剂的线性梯度盐水溶液溶离蛋白。随后透析所溶离的物质，并使其通过0.22μm滤膜，并且确定经过滤物质的蛋白浓度。所属领域技术人员应该了解可以使用所属技术领域已知的其他交换技术来将疼痛引发去污剂替换成不引发疼痛的去污剂。举例来说，所述技术包括膜透析和凝胶过滤色谱。
在本发明的一个实施例中，两性离子去污剂是ZWITTERGENT去污剂，例如ZWITTERGENT3-8ZWITTERGENT3-10ZWITTERGENT3-12ZWITTERGENT3-14或ZWITTERGENT3-16去污剂。
在本发明的一个特定实施例中，溶于两性离子去污剂中的蛋白经非离子去污剂聚乙二醇叔辛基苯基醚(TRITONX-100)稀释或替换。所属领域技术人员应该了解本发明的一个实施例也可以接近溶解于两性离子去污剂中的疏水性蛋白的免疫原组合物，这些疏水性蛋白经另一种非离子去污剂稀释或替换。在一个特定实施例中，聚乙二醇叔辛基苯基醚的终浓度为约0.01％至约0.2％。在另一个实施例中，聚乙二醇叔辛基苯基醚的终浓度为约0.05％。
本发明的一个实施例提供含有经稀释或替换以减少终浓度的两性离子去污剂的组合物，产生与未经稀释或未经替换的组合物相比可以引发较少疼痛的组合物。可以通过大鼠足垫疼痛测试来确定疼痛的减少。在本发明的一个特定实施例中，如通过大鼠足垫疼痛测试所测量，疼痛减少至少50％。在本发明的另一个特定实施例中，两性离子去污剂的浓度降低至低于其临界胶束浓度。
本文中所用术语“疼痛”是指不适的感觉。疼痛与由于炎症、局部缺血、机械或其他刺激所引起的实际或潜在的损伤或组织损坏相关。神经系统从许多感觉受体接受输入。感觉神经元和运动神经元回路包含于周缘神经系统内。这些回路向中枢神经系统(CNS)发送信息并从其接收信息，中枢神经系统包含脑和脊髓，并且主要包含中间神经元。对特异性环境刺激产生反应的高度专门感觉受体细胞直接向脑发送其输出(例如味觉和嗅觉受体)，或者向周缘感觉神经元发送其输出(例如疼痛和伸展受体)。如本文所使用术语“伤痛刺激”是指赖以探测有害刺激的神经机制。伤痛刺激包含两个步骤通过周缘神经末梢转导有害刺激，并且将这些信号传输至中枢神经系统的疼痛敏感(有疼痛反应)神经元。
本文中所用术语“大鼠足垫疼痛”或“大鼠舔爪”测试或模型是指用于确定由注射后的特异性调配物所诱发疼痛的测试或模型。所述测试是由给相同种类和大约相同重量的大鼠足垫均一注射待作为疼痛引发剂来评估的组合物和已知引发注射处疼痛的组合物以及已知不引起注射处疼痛的组合物组成。对于每个测试和对照调配物均使用统计学上显著数量的动物。注射之后，将动物置于有镜子的笼中，并且随后由技术人员(优选为对免疫原组合物的特性缺乏判断)观察退缩、举起、舔舐或咬住经注射的爪子长达20至30分钟。用秒表记录这些疼痛反应行为所耗时间，并且合计达10分钟时段。
本文中所用术语“较少疼痛”是指与通过大鼠足垫疼痛测试所测量的未经改变的组合物相比，组合物中引起疼痛反应的时间长度或强度或者两者减少的改变。本文中所用术语“50％疼痛减少”是指当比较以相等注射体积通过相同手段投与并且观察相同长度时间的经改变与未经改变的免疫原组合物时，通过大鼠足垫疼痛测试所测量的疼痛反应所耗时间的量减少50％。每组中动物的数目为统计学显著数目。不同注射组的观察优选是由相同技术人员进行，且其缺乏对组合物特性的判断。
本文中所用术语“临界胶束浓度(CMC)”是指特异性去污剂的浓度，高于此浓度去污剂分子单体即丛集形成胶束。浓度单位通常给定为任一毫克分子的百分比(V/V)。参看Charles Tanford John wiley和Sons New York的The Hydrophobic EffectFormation Of Micelles And Biological Membranes(第2版，1980)。在极低浓度下，去污剂在纯水中溶解为分离分子。随着浓度的增加，由于疏水性作用，分子开始形成胶束。其为小球状聚结体，其中分子的亲水性部分面向外部，而疏水性部分丛集在中心。胶束形成时的CMC是每种去污剂的特征，并且与其疏水性和亲水性部分的结构密切相关。所属领域技术人员应该了解，通常将CMC值阐述为一定范围的值，这是因为所述值依赖于温度、压力等。一些已知的临界胶束浓度列示如下

因为将两性分子联合进胶束中的驱动力为非特异性，并且因为所产生的胶束具有液体样核心，因此含有去污剂混合物的混合胶束可以容易地形成。如本文所使用“混合胶束”是指含有不同去污剂分子混合物的胶束，例如Zw 3-12与TX-100混合胶束。
蛋白与抗原术语“抗原”是指可以由免疫系统所识别，并且在所述识别后可以引起特异性免疫反应，通常是引起特异性抗体和细胞免疫性产生的任何物质。尽管术语抗原可以包括全部的细菌或病毒，但是免疫原组合物通常含有次单位抗原，例如来自病原体的蛋白或肽。次单位抗原可以来源于任何类型的传染媒介物，例如细菌、病毒、寄生虫、真菌或肿瘤细胞。
包括大肠杆菌(E.coli)在内的许多细菌具有围绕其原生质膜的外部膜。外部膜由各种形成孔的孔蛋白所穿透，其允许高至600道尔顿的所选亲水性溶质扩散穿过外部脂质双层。孔蛋白是穿越脂质双层并且具有β-桶类型蛋白结构的形成孔的跨膜蛋白。一些多通道跨膜蛋白的跨膜节段安置成为封闭β-片层(β-桶)，而非α-螺旋。所述桶由16股反向平行的β-片层形成，其足够弯曲以卷入圆柱体结构中。极性侧链敷盖内部的水通道，而非极性测量从桶的外部凸出以与脂质双层的疏水性核心相互作用。所述蛋白的最佳研究实例是孔蛋白，其是在许多细菌的外部膜中发现的。其为完全原子结构已经由X光结晶学解析的极少数跨膜蛋白中者。
本发明的一个例示性实施例提供其中抗原为孔蛋白的免疫原组合物。所属领域技术人员应该了解某些孔蛋白被视为良好的免疫原组合物候选。举例来说，孔蛋白(Por)A是在自然感染后诱导抗体形成的B组脑膜炎奈瑟菌的荚膜下蛋白抗原(Lehmann，A.K.等人，Infect.Immun.，1999，672552)，并且被视为良好的脑膜炎球菌免疫原组合物候选(van der Voort，E.R.等人，Vaccine，2000，181334)。由于Por蛋白在脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌的细菌细胞表面上的存在，其相对守恒的性质和其在外部膜中的充足量，因此Por蛋白被注意到是潜在的免疫原组合物候选抗原。参看Heckels，J.E.等人.，Vaccine，8225-230(1990)。分子流行病研究揭示在天然感染期间内发展的Por特异性抗体可以提供抗相同Pot血清型的淋球菌再感染的部分保护(Plummet，F.A.等人，J.Clin.Invest，1989，831472-1476)。根据结构和免疫化学特征，已经识别出两种主要亚类型的Por蛋白，命名为PorA和PorB，其由互斥等位基因编码。所属领域技术人员了解制备包含疏水性膜蛋白的不引起疼痛和较少疼痛免疫原组合物是重要的，包括待投与哺乳动物的淋球菌和脑膜炎球菌孔蛋白。
Northern Regional Research Laboratory(NRRL)以入藏登记号NRRL #B-18263在1987年11月13日存放了导入含有PIA基因的质粒pUNC7的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。American Type Culture Collection以入藏登记号67775存放了导入含有PIB基因的质粒pUNCH25的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。
“膜蛋白”是与膜相关的蛋白。不同的膜蛋白以不同的方式与膜相关。许多膜蛋白延伸穿过脂质双层，其蛋白块部分位于两侧。与其脂质邻居相同，所述跨膜蛋白是具有疏水性区域和亲水性其他区域的两性分子。其疏水性区域穿过膜，并且与双层内脂质分子的疏水性尾相互作用。其亲水性区域在膜的一侧或另一侧暴露于水中。一些所述膜蛋白的疏水性随着插入脂质双层的膜小叶内的脂肪酸链的共价结合而增加。其他膜蛋白完全位于胞液中，或位于周缘原生质空间内，并且仅借助一个或一个以上共价结合的脂肪酸链或其他类型脂质链而与双层相关。其他膜蛋白完全暴露在真核细胞的外部细胞表面，或格兰阴性细菌细胞的外部膜，其仅通过共价键与双层连接。
完全不延伸至脂质双层的疏水性内部中的一些蛋白通过与其他膜蛋白的非共价相互作用结合于膜的一个或其他面。通过相对温和的提取过程将许多所述蛋白从膜中释放，例如暴露于干扰蛋白-蛋白互作但保留脂质双层完整的极高或极低离子强度或极端pH的溶液中；所述蛋白实际上称作“周缘膜蛋白”。相反，跨膜蛋白、通过脂质基团固持在双层中的许多蛋白和一些其他紧密结合蛋白不可能以所述方式释放，并且因此被称为“膜内在蛋白”。总体来说，跨膜蛋白(和一些其他紧密结合膜蛋白)仅可由中断疏水性相关性并破坏脂质双层的试剂溶解，例如两性离子去污剂。
所属领域技术人员应该了解本发明的疏水性蛋白可以通过重组DNA方法产生，并且用所属领域已知的方法在细菌或真核细胞中表达。也应该了解疏水性蛋白起始可以用尿素或胍溶解单独蛋白分子以从包涵体中回收。随后通过替换或稀释于含有两性离子去污剂或两性离子去污剂组合或两性离子去污剂与其他去污剂的组合的溶液来再折叠所溶解(但已变性)的蛋白。
治疗的组合物与方法本发明的实施例提供投与动物用于免疫疗法或免疫预防，或者用于其他治疗或诊断目的的免疫原组合物。可以通过注射或不引起不可接受疼痛反应的其他投放途径来投与所述组合物。免疫原组合物可以包括佐剂和/或载剂。本发明的实施例也提供用于投放以预防或治疗特异性疾病的免疫学有效剂量的组合物。举例来说，可以投与组合物来预防或治疗淋病或脑膜炎或任何格兰阴性细菌疾病。
在本发明的一个实施例中，将免疫原组合物投与哺乳动物。如本文所使用术语“哺乳动物”被定义为哺乳动物纲中的种类组。哺乳动物的非限制性实例是农业动物，例如绵羊、猪和牛，啮齿动物，例如大鼠和小鼠，和灵长类，例如猴、猿和人类。
术语“免疫学有效量”是指足以引起所需免疫反应的化合物或组合物的量。总体来说，本发明实施例的免疫原组合物的适当免疫学有效量或剂量的选择也应该基于所用的特定免疫原组合物，以及受检者的身体情况，尤其包括经免疫化受检者的健康状况和体重。所述选择和有效剂量的上调和下调是在所属领域技术范围内。诱导免疫反应而无显著不利副作用所需的活性组份量取决于所用组合物而不同。
在某些实施例种，免疫原组合物应该包含一种或一种以上的佐剂。如本文所使用“佐剂”是用于增强本发明特定实施例的免疫原组合物的免疫性的物质。
已经显示许多细胞因子或淋巴因子具有免疫调节活性，并且因此可以用作佐剂，其包括(但不限于)介白素1-α、1-β、2、4、5、6、7、8、10、12(参看，例如美国专利第5,723,127号)、13、14、15、16、17和18(和其突变形式)、干扰素-α、β和γ、粒性白细胞-巨噬细胞群落刺激因子(参看，例如美国专利第5,078,996号和ATCC入藏登记号39900)、巨噬细胞群落刺激因子、粒性白细胞群落刺激因子、GSF和肿瘤坏死因子α和β。可用于本发明特定实施例的其他佐剂包括趋化因子，包括(但不限于)MCP-1、MIP-1α、MIP-1β和RANTES。黏附分子，例如选择素，例如L-选择素、P-选择素和E-选择素也可以用作佐剂。其他可用佐剂包括(但不限于)粘蛋白样分子，例如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整合素家族成员，例如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族成员，例如PECAM、ICAM，例如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3、CD2和LFA-3，共刺激分子，例如CD40和CD40L，生长因子，包括脉管生长因子、神经生长因子、纤维原细胞生长因子、外皮生长因子、B7.2、PDGF、BL-1和脉管内皮生长因子、受体分子，包括Fas、TNF受体、Fit、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2和DR6。另一种佐剂分子包括卡斯蛋白酶(ICE)。也参看国际专利公开案第WO 98/17799号和第WO 99/43839号，所述揭示案全文以引用的方式并入本文。
用于增强免疫反应的合适佐剂进一步包括(但不限于)MPL(3-O-脱酰化单磷酰基脂质A；Corixa，Hamilton，MT)，其描述于美国专利第4,912,094号，其以引用的方式并入本文。也适用的佐剂是可购自Corixa(Hamilton，MT)的合成脂质A类似物或葡糖胺磷酸氨基烷酯化合物(AGP)，或其衍生物或类似物，其描述于美国专利第6,113,918号，所述专利以引用的方式并入本文。一种所述AGP是2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基氨基]乙基2-脱氧基-4-O-膦酰基-3-O-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基]-2-[(R)-3-十四酰氧基十四酰基-氨基]-b-D-葡萄哌喃糖苷，其也已知为529(先前已知为RC529)。所述529佐剂经调配成水性形式或稳定乳液。
其他佐剂包括矿物油和水乳液、铝盐(明矾)，例如氢氧化铝、磷酸铝等、Amphigen、Avridine、L121/鲨烯、D-交酯-聚交酯/糖苷、普流尼克(pluronic)多元醇、胞壁酰基二肽、杀死博德氏菌(Bordetella)、皂角苷，例如StimulonQS-21(Antigenics，Framingham，MA.)，描述于美国专利第5,057,540号，所述专利以引用的方式并入本文，和由其产生的粒子，例如ISCOMS(免疫刺激复合物)、结核杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)、细菌脂质多糖、合成聚核苷酸，例如含有CpG基序的寡核苷酸(美国专利第6,207,646号，其以引用的方式并入本文)，百日咳毒素(PT)和大肠杆菌热不稳定毒素(LT)，尤其是LT-K63、LT-R72、PT-K9/G129；参看，例如国际专利公开案第WO 93/13302号和第WO 92/19265号，其以引用的方式并入本文。
霍乱毒素和其突变体也可以用作佐剂，其包括描述于已公开的国际专利申请第WO00/18434号者(其中氨基酸29位置处的谷氨酸被另一种氨基酸(除天冬氨酸之外)置换，优选为组氨酸)。相似的CT毒素或突变体描述于已公开的国际专利申请第WO02/098368号中(其中氨基酸位置16处的异亮氨酸被另一个氨基酸置换，或者同时发生氨基酸位置68处的丝氨酸被另一个氨基酸置换；和/或其中氨基酸位置72处的缬氨酸被另一个氨基酸置换)。其他CT毒素描述于已公开的国际专利申请第WO 02/098369号中(其中氨基酸位置25处的精氨酸被另一个氨基酸置换；和/或氨基酸位置49处插入一个氨基酸；和/或氨基酸位置35和36处插入两个氨基酸)。
可以使用各种投放途径。当然，所选特定模式可以取决于所选特定免疫原组合物，所治疗的特定病症和治疗功效所需剂量。大体来说，本发明某些实施例的方法可以使用任何医学可接受的投放模式实施，意谓产生有效水平的免疫反应而不引起临床不可接受不利作用的任何模式。投放途径的实例包括(但不限于)非经肠(例如静脉内、动脉内、皮内、经皮肤、肌肉内、皮下、腹膜内)、跨粘膜(例如口服、经直肠、鼻内、经阴道、经呼吸)和经皮肤(局部)。
免疫原组合物的优选投放方法是非经肠投放。用于非经肠投放的溶液或悬浮液包括以下组份无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲液，例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张力的试剂，例如氯化钠或右旋糖。可以用酸或碱调节pH，例如盐酸或氢氧化钠。可以将非经肠制剂封于安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制得的多剂量瓶中。
术语“医药学可接受”是指当投与个体时，分子实体和组合物为生理可耐受，并且通常不产生过敏或相似不适当反应(例如胃部不适、眩晕和类似情形)。优选且尤其当免疫原组合物用于人类时，术语“医药学可接受”可以意谓由管理机构(例如U.S.Foodand Drug Agency)批准，或在用于人类或动物的通常公认的药典中所列出(例如美国药典(U.S.Pharmacopeia))。
术语“载剂”是指与化合物一起投放的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。无菌水或盐水溶液和含水右旋糖和甘油溶液优选用作载剂，尤其是用于可注射溶液。例示性合适医药学载剂由E.W.Martin描述于“Reminington’s Pharmaceutical Sciences”中。适当载剂为所属领域技术人员显而易见的，并且很大程度上取决于投放途径。
可以通过标准医药学过程确定化合物的毒性与治疗功效，例如在细胞培养测定中，或使用实验动物确定LD50和ED50。参数LD50和ED50是所属技术领域所熟知的，并且分别是指对50％群体致死和对50％群体有治疗作用的化合物剂量。毒性与治疗作用之间的剂量比是指治疗指数，并且可以表示为比率LD50/ED50。展示大治疗指数的化合物为优选。尽管可以使用展示毒性副作用的化合物，但是例如尤其优选的使用特异性使所述化合物靶向患病组织处的传输系统，以将其对其他细胞、组织或器官的潜在损害减到最小并且减少副作用。
实例本发明的实施例通过以下实例加以描述。然而，本说明书任何地方中的这些或其他实例的用途仅为说明性，并且不以任何方式限制本发明或任何例示术语的范畴和含义。同样，本发明并不限于本文所描述的任何特定实施例。事实上，本发明的许多修改和变更对于所属领域技术人员在读完本说明书之后可能是显而易见的，并且可以在不悖离其精神和范畴下进行修改和变更。
缩写以下缩写遍及实例使用Zw-Zwittergent 3-14；0.1×Zw＝0.005％Zw 3-14；1×Zw＝0.05％Zw 3-14。
TX-TRITON X-100；还原型TRITONX-100(“red TX”)GC PorB-重组淋球菌PorB(来自菌株FA1090)Mn PorA-重组脑膜炎球菌PorA(I类孔蛋白)0.1×PorB＝10μg/ml GC rPorB；1×PorB＝100μg/ml GC rPorB；实例1各种免疫原组合物注射的疼痛反应材料与方法免疫原组合物制备在大肠杆菌中用pET-17b表达载体(Novagen，Inc.，Madison，WI)制备重组淋球菌PorB(“GC rPorB”来自淋病奈瑟菌菌株FA1090)。将在包涵体中表达的所述重组蛋白溶解于尿素中，并且通过管柱色谱在Zwittergent(“Zw”)3-14中根据现行优良制造规范(cGMP)进行纯化。将批量浓缩物于-20℃下储存于10mM NaPO4(pH 7.4)、150mM NaCl和0.05％(w/v)Zw 3-14(Calbiochem，San Diego，CA；目录号693017)中。此物质的蛋白浓度为1.3mg/ml。
用注射用水(“WFI”)制备用于在大鼠足垫疼痛模型中测试的免疫原组合物的所有缓冲液，并且传经0.22μm滤膜。还原型TRITONX-100(“red TX”)购自Sigma(St.Louis，MO；目录号X-100R-PC)，福尔马林购自EM Sciences(Gibbstown，N.J；目录号FX0415-5)，并且包括TRITONX-100(“TX”)(目录号X198-05)在内的所有其他试剂购自J.T.Baker(Phillipsburg，NJ)。对于实例1所示的实验来说，不是无热原质的PBS购自Sigma(目录号P0261)。对于其余实例来说，制备无热原质的PBS。
以下临床级别免疫原组合物用于所述研究中1)含有0.05％(w/v)Zw 3-14的PBS(pH 7.2)中含有100μg/ml重组淋球菌孔蛋白的GC rPorB；2)非典型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)/卡他莫拉菌(Moraxellacatarrhalis)(“NTHi/Mcat”)免疫组合物，其含有以下成分各自50μg来源于流感嗜血杆菌的重组P4和重组P6蛋白，50μg天然UspA2(卡他莫拉菌)于含有0.04％(v/v)TX(含或不含250μg/ml铝，如AlPO4)、0.03％(w/v)Zw 3-12的PBS(pH 7.2)中。[所述免疫原组合物不与人类志愿者的注射后疼痛相关，猜想这是因为0.03％Zw 3-12低于此去污剂的临界胶束浓度。相反，0.04％ TX浓度高于TX的CMC。]和3)来自呼吸道合胞病毒(“PFP-2”)的100μg/ml经纯化F蛋白于含有100μg/ml STIMULONQS-21(Antigenics，Framingham)的PBS(pH 6.5)中，其与人类志愿者的注射后即时的疼痛相关。
疼痛对照也将福尔马林(甲醛100μl)用作阳性疼痛对照，因为注射5％福尔马林溶液引起两阶段的疼痛反应，一个为即时而另一个为延迟。
通过在分层流动净化罩中，用适当缓冲液，含有所指的Zw 3-14、TX或还原型TX的PBS(pH 7.2)或10mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl(“TBS”)无菌稀释蛋白来制备用于大鼠足垫研究的实验免疫原组合物。所述实验的阳性对照是PBS(pH 7.2)中5％(v/v)福尔马林。将免疫原组合物分散于2ml 1型玻璃瓶中，其是用West无乳胶塞和铝封条密封。所有的免疫原组合物均储存于2-8℃下。
大鼠足垫疼痛测试在投与动物之前，将免疫原组合物样品移至室温下。由不涉及监控疼痛反应的技术人员注射动物。用来自Charles River Laboratories Inc.(Kingston，NY)的雄性Sprague Dawley大鼠(CrlCD(SD)IGS BR，取得时50-100g)进行所有研究。在开始研究之前，使大鼠适应研究设备大约1周，此时其称重为100-150g。在注射之前检查注射爪以确认有无任何受伤。随后将动物限制在技术人员的手臂内，以使后腿向前伸。在踝关节上方抓住右后腿，并且施加压力以使爪笔直外伸，其脚底(底部)向上。对每只动物使用新23号针，操作人员将斜边向上插入爪中心，与爪表面平行，直至针位于衬垫的中心。随后注射物质，并且在拔针之前使针在适当位置停留3-5秒，以将注射处的渗漏减至最少。注射体积为0.1ml。
随后将动物置于有3个镜子(邻接侧面和地面)的笼中，并且由不同的技术人员(对免疫原组合物的特性缺乏判断)观察退缩、举起、舔舐或咬住受感染的爪子30分钟。用秒表记录这些疼痛反应行为所耗时间，并且总计10分钟时期。每组有6只动物。
统计学分析用调节用于多重比较的ANOVA方法分析结果，多重比较是将每个处理组与仅接受缓冲液(PBS或TBS)的对照组进行比较。这是一种保守方法，因为这些研究中组间测量的方差差异极大。此外，常态假设并不令人满意。由于这些原因，在用ANOVA方法之前对数据进行秩转换。
用Wilcoxon秩检验进行比较个体免疫原组合物的二级分析。当适当时，进行Bonferroni多重比较调节。这些二级分析包括以下比较(a)GC rPorB/Zw 3-14稀释于含有TX或还原型TX的缓冲液中，(b)10μg/ml或100μg/ml GC rPorB于0.05％Zw3-14中，(c)10μg/ml或100μg/ml GC rPorB于含有NTHi/Mcat免疫原组合物的0.05％Zw 3-14中和(d)含有0.05％或0.005％Zw 3-14的PBS。
在关于与阴性对照免疫原组合物比较的初级分析中每个研究使用0.05α-水平的显著性，并且在考虑二级分析下的每个研究使用另一0.05α-水平的显著性。多重比较使用Bonferroni调节。
结果表1总结在相继10分钟间隔内，对各种免疫原组合物的0.1ml注射的疼痛反应所耗时间的量。PBS和非典型流感嗜血杆菌/卡他莫拉菌(NTHi/Mcat)用作阴性对照。PBS+Zw 3-14、来自呼吸道合胞病毒的PFP+QS-21佐剂(Antigenics，New York，NY)、GC rPorB于PBS+0.05％Zw 3-14中为测试组。5％福尔马林用作注射后疼痛的阳性对照。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物群组给定中值、平均值和范围。每组有6只动物。表2总结了表1结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。
如表1和2所示，在所测试的组合物中，福尔马林明显地诱导最高疼痛反应。本研究数据的解释较为复杂，这是因为用作此研究中缓冲液对照的PBS(购自Sigma)不是无热原质，并且因此很可能引起大于预期疼痛反应的疼痛反应。尽管差异并不是统计学显著，但是所述数据揭示在免疫化后的前10分钟内由100μg/ml GC rPorB、0.05％Zw3-14于PBS中或PFP-2+QS-21所诱导的疼痛反应大于NTHi/Mcat免疫原组合物。
表1 对各种免疫原组合物的0.1ml注射的疼痛反应

表2 表1的统计学分析(α-水平＝0.05/5＝0.01)

在下一个实例中，免疫原组合物的体积加倍为200μl注射体积，以试图增加所述方法的总体敏感性。
实例2注射体积对疼痛反应的作用材料与方法免疫原组合物制备如实例1所述制备免疫原组合物。为了增加所述模型的敏感性，评价所述模型的最大注射体积(0.2ml)。在本实例中，PBS为无热原质。
大鼠足垫疼痛测试如实例1所述进行大鼠足垫疼痛测试。在本实例中，每组为4至6只动物，并且使用0.1ml与0.2ml注射体积。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析。
结果表3总结注射体积(0.1ml与0.2ml比较)对疼痛反应的作用。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物组给定疼痛反应所耗时间的中值、平均值和范围。注意0.1×GCrPorB＝10μg/ml GC rPorB和1×GC rPorB＝100μg/ml GC rPorB。表4总结了表3结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。*指示Steel和Dwaas方法产生临界值1秩单位内(边界显著)的非显著统计量。
如表3和4所示，单独Zw 3-14和GC rPorB(100μg/ml)+Zw 3-14免疫原组合物所检测到的疼痛反应大于实例中所检测到的疼痛反应(其中仅使用0.1ml注射体积)。PBS阴性对照为良好耐受性(表3)，并且如所预期的产生最小疼痛行为(0-10和10-20分钟期间分别为0秒和3秒的中值)。0-10分钟期间内的疼痛反应分析证明含有0.05％Zw 3-14的样品与PBS缓冲液对照在统计学上有差异(通过秩转换ANOVA为p≤0.0009，与α-水平＝0.01比较)。参看表4。此外，在10-20分钟期间内，接受0.2mlGC rPorB临床调配物的动物与PBS相比仍然展示显著疼痛反应(p＝0.0002，与α-水平＝0.01比较)。用含有0.005％Zw 3-14的免疫原组合物注射的动物显著地展示最小疼痛反应，这与PBS阴性对照所诱导的反应极为相似。因为0.05％Zw 3-14显著高于其CMC(0.004％-0.015％)，因此这些结果揭示高于CMC的Zw 3-14的存在可能和注射后疼痛有关。
表3 注射体积对疼痛反应的作用


表4 经0.2ml免疫原组合物注射动物的表3数据的统计学分析(α-水平＝0.05/5＝0.01)

考虑到由注射200μl上述免疫原组合物所获得的增加敏感性，因此剩余实例将全部采用200μl注射体积的免疫原组合物，并且将保持福尔马林注射液为100μl。下一步研究评价包含PFP-2+QS-21作为阳性对照的免疫原组合物。
实例3免疫原组合物注射的疼痛反应材料与方法免疫原组合物制备如实例2所述制备免疫原组合物。用于人类志愿者注射后疼痛相关的PFP-2+QS-21免疫原组合物作为阳性对照。
大鼠足垫疼痛测试如实例1所述进行大鼠足垫疼痛测试。在本实例中，每组为8只动物，并且使用0.2ml注射体积。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析。此外，用秩转换ANOVA方法，以用于多重比较的Tukey-Kramer调节进行所有三组之间的比较。
结果进行所述研究以测试免疫原组合物PFP-2+QS-21是否可以充当阳性对照，因为其与人类志愿者注射后疼痛相关。除福尔马林之外的这些免疫原组合物是以0.2ml注射体积投放。表5总结与注射0.2ml PFP-2+QS-21相关的疼痛反应所耗时间的长度。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物组给定中值、平均值和范围。注意一只具有52秒反应的动物排除在数据外。表6总结了表5结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。
如表5所示，在前10分钟内，PFP-2+QS-21与GC rPorB免疫原组合物均产生疼痛反应。这些反应与由0.2ml PBS(阴性对照)所诱导的反应显著不同(p≤0.0002，与α-水平＝0.05相比)，其又得以良好耐受(参看表6)。
前三个实例的结果证明当注射0.2ml免疫原组合物时，与人类志愿者注射后疼痛相关的两种免疫原组合物制剂(GC rPorB+0.05％Zw 3-14；PFP-2+QS-21)也引发大鼠足垫(舔爪)模型中的疼痛。NTHi/Mcat免疫原组合物不与人类志愿者注射后疼痛相关，并且不引发大鼠足垫模型的疼痛(用0.1ml)。所述结果进一步揭示Zwittergent3-14是与GC rPorB免疫原组合物相关的一种主要的疼痛来源。相反，将Zw 3-14浓度降低至0.005％(低于CMC)表现为显著地降低疼痛反应。根据所述结果，制备并在所述大鼠模型中测试移除或减少Zw 3-14的替代性调配物。
表5 0.2ml PFP-2+QS-21注射的疼痛反应

表6 表5数据的统计学分析。(用Tukey-Kramer方法调节P-值用于多重比较)

在两个不同蛋白浓度下进行下一项研究，并且评价在保持疼痛引发免疫原组合物的蛋白组份恒定的同时稀释去污剂对大鼠足垫模型中疼痛诱导的作用。
实例4不同的ZWITTERGENT3-14或GC rPorB浓度对疼痛反应的作用材料与方法免疫原组合物制备 如实例3所述制备免疫原组合物。
大鼠足垫疼痛测试 如实例1所述进行大鼠足垫疼痛测试。在本实例中，注射后前20分钟内监控疼痛反应，这部分由于在起始实验的20-30分钟期间内所观察到的最小疼痛反应。用0.2ml注射体积测试所有的免疫原组合物(排除0.1ml的福尔马林阳性对照)。每组的动物数目增加到10。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析。
结果表7总结了不同Zw 3-14或GC rPorB浓度对使用0.2ml注射的疼痛反应所耗时间长度的作用。每组有10只动物(表7)。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物组给定中值、平均值和范围。表8总结了表7结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。
在本发明的一个实施例中，通过稀释疼痛引发去污剂并且保持蛋白组份恒定来赋予免疫原组合物更多耐受性。在这些条件下，蛋白可能为沉淀形式并且不可溶。表7显示测量由GC rPorB于0.005％Zw 3-14中所诱导的反应与相同蛋白剂量于0.05％Zw 3-14中比较的研究结果。0.005％的Zw 3-14低于CMC，且rPorin蛋白形成良好沉淀物。先前研究已经证明所述沉淀形式的蛋白仍然具有免疫原性(数据未显示)，并且因此这代表被认为是克服疼痛的一种可能方法的调配物选择。表7所示结果显示100μg/ml浓度的GC rPorB于0.005％Zw 3-14中不引发模型中的疼痛，反而相同浓度的GC rPorB于0.05％Zw 3-14中再次引发显著疼痛；NTHi/Mcat临床免疫原组合物再次不引发疼痛。统计学分析证明当与PBS组(表8)相比时，在GC rPorB于0.005％Zw 3-14中或NTHi/Mcat免疫原组合物所诱导的反应之间无显著差异。在0-10分钟期间内，含有0.05％Zw 3-14的免疫原组合物所诱导的疼痛反应显著高于PBS(p＜0.0001，与α-水平＝0.00625相比；表8)。
表7 不同Zwittergent 3-14或GC rPorB浓度对疼痛反应的作用

表8 表7数据的统计学分析(α-水平＝0.05/8＝0.00625)

本实例显示免疫原组合物的耐受性如何通过稀释疼痛引发去污剂且保持蛋白组份恒定而得以改进。下一个实例显示如何首先通过识别不引发疼痛去污剂，随后将疼痛引发去污剂替换成不引发疼痛去污剂而制备具有改进耐受性的免疫原组合物。本方法也显示如何维持蛋白组份的溶解性。
实倒5TRITONX-100对GC rPorB所诱导的疼痛反应的作用材料与方法免疫原组合物制备 如实例3所述制备免疫原组合物。
去污剂替换 通过离子交换色谱完成替代或替换与GC rPorB相关的去污剂(例如用TX替代Zw 3-14)。简单来说，将在10mM NaPO4(pH 7.4)、150mM NaCl、0.05％(w/v)Zw 3-14中的GC rPorB负载于Q-SepharoseTM(Amersham-Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)管柱上，其用相同缓冲液平衡。用大约900ml含有25nM NaCl的20mM Tris(pH 8)、0.03％(v/v)TX洗涤所结合的蛋白。用NaCl于20mM Tris(pH 8)、0.03％(v/v)TX中的线性梯度溶离蛋白。汇集含有GC PorB的溶离份，并且通过直接加入TX将TX浓度调节成0.06％(v/v)。随后将所汇集的物质相对于含有0.06％(v/v)TX的10mM NaPO4(pH 7.4)、150mM NaCl透析。将所透析的物质通过0.22μm滤膜，并且确定经过滤物质的蛋白浓度。
大鼠足垫疼痛测试如实例4所述进行大鼠足垫疼痛测试。在本实例中，每组有8只动物。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析。
结果因为NTHi/Mcat免疫原组合物含有低于CMC的Zwittergent3-12，并且也含有高于TX CMC的0.04％(v/v)的TX，因此令人感兴趣的将TX视作GC rPorB的替代性去污剂，这尤其是因为TX与Zw 3-12的混合物不与人类志愿者的注射后疼痛相关。
表9总结了TX对用0.2ml注射体积GC rPorB所诱导的疼痛反应所耗时间的作用。每组有8只动物。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物组给定中值、平均值和范围。注意Al凝胶＝250μg/ml，铝为AlPO4。表10总结了表9结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。*指示Steel和Dwaas方法产生临界值1秩单位内(边界显著)的非显著统计量。
经GC rPorB(100μg/ml)于0.06％TX中注射的动物事实上在0-10分钟和10-20分钟期间内不显示疼痛反应(分别为p＝0.98与0.55，与α-水平＝0.01相比)。这些反应与单独PBS所诱导的反应相似(表9和10)。这些数据证明用TX替换Zw 3-14导致疼痛反应的显著减少。
表9 Triton X-100对由GC rPorB所诱导的疼痛反应的作用

表10 表9的统计学分析(α-水平＝0.05/5＝0.01)

从实际观点来说，替换去污剂需要至少一个另外的步骤，其中可以丢失蛋白或者另外可以招致花费。因此，下一个实例教示如何设计解决疼痛问题的方法，其中用不引发疼痛的去污剂将疼痛引发去污剂稀释至不引起疼痛水平。
实例6将GC rPorB/ZW 3-14稀释于TRITONX-100缓冲液中的作用材料与方法通过稀释制备免疫原组合物作为去污剂替换的替代，调查了使用现有的批量浓缩物并且直接将所述物质稀释于含有0.05％TX的缓冲液中的可能性，其中所述物质是在含有0.05％Zw 3-14的PBS中。所述稀释产生具有改进耐受性的免疫原组合物，其含有低于CMC浓度的残余量Zw 3-14(~0.004％)。
大鼠足垫疼痛测试如实例4所述进行大鼠足垫疼痛测试。每组有10只动物。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析。
结果表11总结了用0.2ml注射体积将GC rPorB/Zw 3-14稀释于TX缓冲液中的作用。每组有10只动物。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物组给定疼痛反应所耗时间的中值、平均值和范围。表12总结了表11结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。**指示ANOVA与Steel和Dwaas方法之间有显著差异。
直接稀释于含有0.05％TX缓冲液中的免疫原组合物也产生不引起足垫模型中疼痛的制剂。这与对单独PBS、PBS与TX的结合和稀释于PBS与TX中的Zw 3-14的疼痛反应相似(参看表11和12)。在所述实例中，在TRITON中维持蛋白的溶解性。
表11 将GC rPorB/Zw 3-14稀释于Triton X-100缓冲液中的作用

表12 表11的统计学分析(α-水平＝0.05/6＝0.00833)

接着我们评价了其他缓冲液体系和其他非离子去污剂是否也可以用于产生具有改进耐受性的免疫原组合物。
实例7在含有TRITONX-100或还原型TRITONX-100的TRIS缓冲盐水中调配的GC rPorB的疼痛反应材料与方法免疫原组合物制各如实例6所述制备免疫原组合物。在还原型TX中稀释现有批量GC rPorB浓缩物。
大鼠足垫疼痛测试如实例4所述进行大鼠足垫疼痛测试。每组有10只动物。使用TBS代替PBS。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析。
结果表13总结了在含有TX或还原型TX的TBS中调配的0.2ml GC rPorB注射液的疼痛反应所耗时间长度。还原型TX是TX-100的类似物，其在280nm下吸收更少，因此使得其使用简单且更加可接受。对每个处理后观察期的每种免疫原组合物组给定中值、平均值和范围。每组有10只动物。表14总结了表13结果的统计学分析。所报导的p-值来自秩转换ANOVA方法。由Steel和Dwaas方法证明统计学测试。注意TBS＝10mM Tris(pH 7.5)、150mM NaCl。
当在TBS稀释液中使用0.05％TX或还原型TX时得到相似的结果，进行改变以使GCrPorB结合佐剂氢氧化铝(参看表13)。TX或还原型TX组合物的结果与缓冲液对照统计学上不可区分(参看表14)。
表13在含有Triton X-100或还原型Triton X-100的Tris缓冲盐水中调配的0.2ml GC rPorB注射液的疼痛反应。

表14 表13的统计学分析(α-水平＝0.05/6＝0.00833)

稀释疼痛引发去污剂的胶束至低于其临界胶束浓度的水平，并且加入不引发疼痛的去污剂至高于其CMC的水平产生高度耐受性免疫原组合物。在下一项实例中，评价了是否可以设计出疼痛问题的解决方法，其中疼痛引发去污剂维持在高于其CMC，但加入不引发疼痛的去污剂以制造混合胶束并减轻疼痛。
实例8通过加入TRITONX-100并且维持ZWITTERGENT3-12恒定以将疼痛免疫原组合物转换成不引起疼痛免疫原组合物材料与方法注射制剂在大鼠足垫模型中评价以下去污剂和去污剂组合的制备0.2％Zw 3-12于PBS中；0.2％Zw 3-12与0.002％TX；0.2％Zw 3-12与0.01％TX；0.2％Zw 3-12稀释于0.05％TX中；0.2％Zw 3-12稀释于0.2％TX中。
大鼠足垫疼痛测试如实例4所述进行大鼠足垫疼痛测试。每组有10只动物。
统计学分析如实例1所述进行统计学分析(数据未显示)。
结果图1显示与注射添加不同浓度TX的Zw 3-12比较时注射Zw 3-12诱导的所产生的疼痛。举例来说，如通过大鼠足垫模型所证实，未经稀释0.2％Zw 3-12和加入0.002％TX的0.2％Zw 3-12产生相对大量的疼痛。在这些调配物中，疼痛引发两性离子去污剂的浓度维持恒定于0.2％Zw 3-12，并且加入增加量的第二不引起疼痛非离子去污剂(TX)以产生混合胶束。如图1所示，当注射至大鼠足垫模型的大鼠中时，向0.2％Zw 3-12溶液中加入0.01％TX、0.05％TX或0.2％TX产生疼痛反应的显著降低。
如所述曲线显示，向0.2％Zwittergent 3-12溶液(终浓度)中加入Triton X-100产生疼痛反应的降低。当达到0.01％Triton X-100浓度时，所述作用变为明显；当加入Triton X-100达到0.2％终浓度时，疼痛调停继续。这些结果与预期相反。通常预期免疫原组合物中加入越多的去污剂，所述溶液越能够更充分地溶解细胞，并且应该诱导更多的疼痛。
数据的统计学分析展示0-10分钟时仅对具有最低Triton X-100的组与阴性对照(例如，单独0.05％Triton X-100)相比较进行非显著测试。相似地，在10-20分钟时相同比较为非显著，并且此外0.01％Triton X-100混合物与阴性对照无显著差异。
可以推断通过向0.2％Zwittergent 3-12溶液中加入0.01％Triton X-100，产生Zwittergent 3-12与Triton X-100的混合胶束，并且这些胶束具有溶液中的物理特性，其引起注射此溶液后的较少疼痛。
在下一个实例中，通过测量大鼠足垫模型中的疼痛诱导来评价各种去污剂的耐受性。
实例9各种去污剂的耐受性材料与方法注射制剂表15、16和17中所列的去污剂制备为高于每种去污剂CMC的所指浓度。所有注射液的体积均为200μl，除了100μl的福尔马林。
大鼠足垫疼痛测试如实例4所述进行大鼠足垫疼痛测试。每组有8只动物。
结果调查去污剂以确定当注射浓度高于去污剂的CMC时，哪种两性离子、非离子和离子去污剂引发疼痛，以及哪种不引发疼痛。结果显示当注射时，非离子去污剂TRITON X-100、还原型TRITON X-100、TWEEN 80和BRIJ为高度耐受性，并且不引发大鼠足垫模型中的显著疼痛。参看表15、16和17。相反，两性离子去污剂ZWITTERGENT 3-10、ZWITTERGENT3-12、ZWITTERGENT 3-14、CHAPS和EMIPGEN BB均引发大鼠足垫模型中的显著疼痛，并且可能不适于用作免疫原组合物。相似地，非离子去污剂十二烷基麦芽糖苷和辛基糖苷诱导大鼠足垫模型的疼痛。
表15 大鼠足垫模型中各种去污剂所诱导的疼痛调查

*NI-非离子；ZW-两性离子。
表16 大鼠足垫模型中各种去污剂所诱导的疼痛调查(续)

*NI-非离子；ZW-两性离子。
表17 大鼠足垫模型中各种去污剂所诱导的疼痛调查(续)

*NI-非离子；ZW-两性离子；I-离子。
在下一个实例中，我们寻找检验显示与淋球菌PorB相同耐受性模式的其他疏水性蛋白。
实例10注射含有重组脑膜炎球菌PORA(I类孔蛋白)的免疫原组合物的疼痛反应。
材料与方法免疫原组合物制备 如实例2所述制备免疫原组合物。
大鼠足垫疼痛测试 如实例1所述进行大鼠足垫疼痛测试。在本实例中，每组为10只动物，并且使用0.2ml注射体积。
结果进行本研究以测试重组孔蛋白脑膜炎球菌PorA(I类孔蛋白)是否显示与先前实例中淋球菌PorB的相同耐受性模式。
结果指出当与ZWITTERGENT 3-14和TRITON X-100结合于免疫原组合物，并且评估于大鼠足垫模型中时，脑膜炎球菌PorA显示与淋球菌PorB相同耐受性模式。参看表18。包含脑膜炎球菌PorA和ZWITTERGENT 3-14的免疫原组合物诱导大鼠足垫模型中的疼痛，而包含脑膜炎球菌PorA和TRITON X-100的免疫原组合物耐受性更强，这是由于其在大鼠足垫模型中所诱导的疼痛比脑膜炎球菌PorA和ZWITTERGENT 3-14所诱导的疼痛少。
表18的数据也显示加入佐剂AlOH对于所诱导疼痛的水平无积极或消极的影响，并且因此对免疫原组合物的耐受性无积极或消极的影响。参看表18。
表18其中脑膜炎球菌孔蛋白Por A作为疏水性蛋白的免疫原组合物所诱导的疼痛

* * * * *本发明的范畴并不受本文所描述的特定实施例限制。事实上，根据先前描述和附图，除本文所描述的修改之外的本发明各种修改对所属领域技术人员是显而易见的。所述修改倾向于在附加申请专利范围的范畴内。
进一步了解所有值均为近似的，并且用于描述。
贯穿本申请案中引用专利、专利申请案、公开案、产品描述和实验方法，为达所有目的，因此所述揭示的内容全文以引用的方式并入本文。
权利要求
1.一种适于注射至人类的疏水性蛋白的不引起疼痛组合物，其包含(a)疏水性蛋白；(b)低于溶解所述蛋白所需量的一定量的两性离子去污剂；和(c)一定量的医药学可接受的非离子去污剂，其有效维持所述蛋白在医药学可接受载剂中的溶解性。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述两性离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组正辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述两性离子去污剂是正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸。
4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述非离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述两性离子去污剂是终浓度低于其临界胶束浓度(CMC)的正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸且所述非离子去污剂是终浓度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述疏水性蛋白是膜内在蛋白(integralmembrane protein)。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述膜内在蛋白源自选自由以下各物质组成群组的传染媒介物细菌、病毒、寄生虫和朊病毒(prion)。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述传染媒介物是细菌。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述膜内在蛋白是孔蛋白。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中所述膜内在蛋白是淋球菌孔蛋白。
12.根据权利要求9所述的组合物，其中所述膜内在蛋白是脑膜炎球菌孔蛋白。
13.一种对人类进行免疫的方法，所述方法包含非经肠投与根据权利要求8所述的组合物，其中所述传染媒介物是人类病原体。
14.一种用于制备适于投与哺乳动物的医药学可接受载剂中的疏水性蛋白的引起较少疼痛的免疫原组合物的方法，所述方法包含以下步骤(a)用两性离子去污剂溶解所述疏水性蛋白以制得第一组合物；(b)改变所述第一组合物，以使得与所述第一组合物相比，所述经改变的组合物引起较少疼痛。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述改变步骤(b)是选自由以下操作组成的群组(i)稀释所述两性离子去污剂，(ii)用不引发疼痛的非离子去污剂替换所述两性离子去污剂，和(iii)加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持所述两性离子去污剂的浓度恒定。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述改变步骤(b)是用不引发疼痛的非离子去污剂稀释所述两性离子去污剂。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述改变步骤(b)是用不引发疼痛的非离子去污剂替换所述两性离子去污剂。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述改变步骤(b)是加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持所述两性离子去污剂的浓度恒定。
19.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组正辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
20.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸。
21.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
22.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
23.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是终浓度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸且所述非离子去污剂是终浓度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
24.根据权利要求14所述的方法，其中所述改变步骤(b)是稀释所述两性离子去污剂，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
25.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白是膜内在蛋白，所述膜蛋白源自选自由以下各物质组成群组的传染媒介物细菌、病毒、寄生虫和朊病毒。
26.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述传染媒介物是细菌。
27.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白是孔蛋白。
28.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂被稀释至低于临界胶束浓度。
29.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白是淋球菌孔蛋白。
30.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白是脑膜炎球菌孔蛋白。
31.根据权利要求16、17或18中任一权利要求所述的方法，其中如在大鼠足垫模型中所测量，所述疼痛减少至少约50％。
32.一种减少与向哺乳动物投与包含疏水性蛋白和两性离子去污剂的免疫原组合物相关疼痛的方法，所述方法包含(a)改变所述组合物，以使得与未经改变组合物相比，所述经改变的组合物引起较少疼痛；和(b)投与所述免疫原组合物。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述改变步骤(a)是选自由以下操作组成的群组(i)稀释所述两性离子去污剂，(ii)用不引发疼痛的非离子去污剂替换所述两性离子去污剂，和(iii)加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持所述两性离子去污剂的浓度恒定。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述改变步骤(a)是用不引发疼痛的非离子去污剂稀释所述两性离子去污剂。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述改变步骤(a)是用不引发疼痛的非离子去污剂替换所述两性离子去污剂。
36.根据权利要求33所述的方法，其中所述改变步骤(a)是加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持所述两性离子去污剂的浓度恒定。
37.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组正辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
38.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸。
39.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
40.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
41.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是终浓度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸和所述非离子去污剂是终浓度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
42.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白是膜内在蛋白。
43.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白源自选自由以下各物质组成群组的传染媒介物细菌、病毒、寄生虫和朊病毒。
44.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述传染媒介物是细菌。
45.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白是孔蛋白。
46.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白是淋球菌孔蛋白。
47.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白是脑膜炎球菌孔蛋白。
48.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白的溶解性是维持在所述非离子去污剂中。
49.根据权利要求33所述的方法，其中所述改变步骤(a)是稀释所述两性离子去污剂，并且其中所述疏水性蛋白是沉淀形式。
50.根据权利要求34、35和36中任一权利要求所述的方法，其中所述疼痛是在大鼠足垫模型中测量。
51.根据权利要求50所述的方法，其中与未经改变的组合物相比，所述经改变的组合物如在大鼠足垫模型中测量产生至少约50％的疼痛减少。
52.一种减少与向哺乳动物投与包含疏水性蛋白和两性离子去污剂的免疫原组合物相关疼痛的方法，所述方法包含(a)改变所述组合物，以使得与未经改变的组合物相比，所述经改变的组合物如在大鼠足垫模型中测量产生疼痛减少，和(b)投与所述免疫原组合物，其中与未经改变的组合物相比，所述经改变的组合物产生如在大鼠足垫模型中所测量的至少约50％的疼痛减少。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述改变步骤(a)是选自由以下操作组成的群组(i)用不引发疼痛的非离子去污剂稀释所述两性离子去污剂，(ii)用不引发疼痛的非离子去污剂替换所述两性离子去污剂，和(iii)加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持所述两性离子去污剂的浓度恒定。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述改变步骤(a)是用不引发疼痛的非离子去污剂稀释所述两性离子去污剂。
55.根据权利要求53所述的方法，其中所述改变步骤(a)是用不引发疼痛的非离子去污剂替换所述两性离子去污剂。
56.根据权利要求53所述的方法，其中所述改变步骤(a)是加入不引发疼痛的非离子去污剂但保持所述两性离子去污剂的浓度恒定。
57.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组正辛基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正癸基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十二基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-(N，N-正十六基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-1-丙烷磺酸；3-[(3-胆酰胺基丙基)二甲基铵基]-2-羟基-1-丙烷磺酸；和正十二基-N，N-二甲基甘氨酸。
58.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸。
59.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂是选自由以下各物质组成的群组α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯和聚氧乙烯(35)月桂基醚。
60.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
61.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述两性离子去污剂是终浓度低于其CMC的正十四基-N，N-二甲基-3-铵基-1-丙烷磺酸和所述非离子去污剂是终浓度高于其CMC的α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
62.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述疏水性蛋白是膜内在蛋白。
63.根据权利要求54、55和56中任一权利要求所述的方法，其中所述膜内在蛋白源自选自由以下各物质组成群组的传染媒介物细菌、病毒、寄生虫和朊病毒。
64.一种维持疏水性蛋白在免疫原组合物中溶解性的方法，所述方法包含在不引发疼痛的非离子去污剂中溶解疏水性蛋白，其中不引发疼痛的非离子去污剂是α-[4-(1，1，3，3-四甲基丁基)苯基]-ω-羟基聚(氧基-1，2-乙烷二基)。
65.一种用于使用含有疏水性膜蛋白的组合物对人类进行免疫而不引发疼痛的方法，所述方法包含选择Triton X-100作为医药学可接受去污剂以用于维持疏水性蛋白在最终调配物中的溶解性；其中Triton X-100的浓度高于CMC。
全文摘要
本发明提供一种制备引起较少疼痛的疏水性蛋白的免疫原组合物的方法，所述疏水性蛋白是在适于投与哺乳动物的医药学可接受载剂中，所述方法包含以下步骤(a)用两性离子去污剂溶解所述疏水性蛋白以制得第一组合物；(b)改变所述第一组合物，以使得与所述第一组合物相比，所述经改变的组合物产生如在大鼠足垫模型中所测量到的疼痛减少。
文档编号A61P43/00GK1901935SQ200480039228
公开日2007年1月24日 申请日期2004年12月28日 优先权日2003年12月30日
发明者苏珊·凯·霍塞思, 托马斯·纽厄尔·梅特卡夫三世, 尤里·弗拉基米罗维奇·马茨卡, 迈克尔·哈根 申请人:惠氏公司