专利名称：用于鉴定fc受体多态性的核酸分析方法
技术领域：
本发明一般涉及基因分型领域。具体地说，本发明涉及用于精确而有效地确定个体FcγRIII基因型的核酸分析方法。
背景技术：
IgG受体(FcγR)是在中性粒细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞(NK)和其他类型的细胞表面表达的膜结合糖蛋白。例如，现已证实FcγRIIIHA(CD16)参与各种生理过程，如吞噬作用、内吞作用、抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)、炎症介质的释放以及抗原呈递的增强。Van de Winkel等，(1993)Immunol Today 14(5)215-21。与NK细胞表面表达的低亲和性FcγRIIIA受体结合的IgG被认为是导致ADCC的基本机制。见Clynes等，(2000)Nature Med.6443-446；Cooper等，(2001)Trends Immunol.22633-640；Leibson(1997)Immunity 6655-661；Roitt等，(2001)Immunology(第6版，Mosby，Edinburgh，UK)。
两个FcγRIII基因，FcγRIIIa(A基因)和FcγRIIIb(B基因)已被鉴定出来。Ravetch和Perussia(1989)J.Exp Med 170481。FcγRIII受体已被定位于1号染色体的长臂。Van de Winkel等，(1993)Immunol Today 14(5)215-21。另外，现已确定FcγRIIIA有多种功能多态性，其中包括FcγRIIIa的双等位基因功能多态性(559位核苷酸由G→T)，这预示着在158位氨基酸上缬氨酸(V)替代成苯丙氨酸(F)。Koene等，(1997)Blood901109-1114。试验证明FcγRIIIA 158V等位基因与人IgG1的结合要优于158F等位基因，158V等位基因结合能力的升高可增强效应细胞的活化，产生更强的ADCC。Shields等，(2001)J.Biol.Chem.1766591-6604；Vance等，(1993)J.Immunol.1516429-6439。试验证实，治疗效果也受158V/F多态性的影响-FcγRIIIa 158F/F纯合子对治疗性抗体如ritubimab的反应性下降。Cartron等，(2002)Blood99754-758；Weng和Levy(2003)J.Clin.Oncol.211-8。
由于FcγRIIIA 158V/F多态性具有功能及临床方面的潜在应用价值，因此，已有多个研究小组设计出对特定个体进行基因分型的PCR方法。见Koene等，(1997)Blood90(3)1109-1114；Lepperts等，(2000)J.Immuno Methods 242127-132；Jiang等，(1996)J.Immunol.Methods 19955-59；Morgan等，(2003)Rheumatology 42528-533；Dall′Ozzo等，(2003)J.Immunol.Methods 277185-192；以及美国专利Nos.5,830,652和5,985,561。然而，现有的分析方法在确定多态性时误差率至少也有10％，另外，也不能有效地或精确地区分FcγRIIIA(A基因)和FcγRIIIB(B基因)。
因此，现在依然需要开发出能用于精确而有效地确定受试者FcγIII基因型的组合物和方法。
发明概述本发明的基础在于开发出灵敏而可靠的核酸检测方法来确定任何样品的FcγRIII基因型。
在本发明的一个方面，本发明包括分离的寡核苷酸，该寡核苷酸包含长度为10到60个核苷酸的核苷酸序列，其中的核苷酸序列包含(a)选自SEQ ID NO1-19的序列；(b)与(a)的核苷酸序列有80％序列相同性的核苷酸序列；或(c)(a)和(b)的互补序列。本文所描述的任何分离的核苷酸还可以含有可检测标记，如荧光标记(如6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和/或2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET))。
在另一个方面，本发明描述的是确定受试者FcγRIII基因型的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)利用包含至少一种本文所述寡核苷酸(如SEQ ID NO1-19)的至少第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸；以及(c)检测利用每一种寡核苷酸组合扩增后是否存在扩增的核酸，其中是否存在扩增的寡核苷酸预示着受试者的FcγRIII的基因型。在某些实施方式中，至少有一种寡核苷酸是FcγRIII多态性特异性的。另外，在其他的实施方式中，至少有一种寡核苷酸对于至少一种FcγRIII多态性是通用的。在本文所描述的所有方法中，寡核苷酸的其他组合都可用于从样品中扩增核酸，如利用再一种其它寡核苷酸引物组合通过重复进行步骤(b)和(c)来扩增。在某些实施方式中，寡核苷酸的第一和第二组合都包含一种通用引物。
在本文所描述的所有方法中，FcγRIIIa第158V/F位的基因型都可以确定。因此在某些实施方式中，寡核苷酸引物的第一组合包含SEQ ID NO5和SEQ ID NO2，寡核苷酸引物的第二组合包含SEQ ID NO5和SEQ ED NO1。在利用这些引物组合的方法中，利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增存在扩增产物但是利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增不存在扩增产物说明是158VV基因型；利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增不存在扩增产物但是利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增存在扩增产物说明是158FF基因型；以及利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增存在扩增产物并且利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增也存在扩增产物说明是158FV基因型。
另外，在本文所描述的所有方法中，受试者其他核苷酸位置上的FcRIII基因型也可以被确定，例如选自位置121、153、179、207、313及其组合的核苷酸位置。
本文所描述的所有方法还可以包含对扩增核酸产物测序的步骤。在某些实施方式中，所用的测序引物包括本文所描述的一种或多种寡核苷酸。
在另一个方面，本发明提供了确定受试者FcγRIII基因型的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)扩增分离的核酸；(c)利用包含至少一种本文所述寡核苷酸(如SEQ ID NO1-19)的至少一种合适的寡核苷酸组合作为测序引物对扩增出的核酸产物进行测序，；以及(d)确定一种或多种FcγRIII多态性上的核苷酸残基，从而确定受试者的FcγRIII基因型。在某些实施方式中，扩增(步骤(b))至少利用包含至少一种本文所述寡核苷酸作为正义和反义引物的寡核苷酸的第一和第二组合进行。在本文所描述的任何测序方法中，例如通过确定207位的核苷酸可以确定FcγRIIIa第158V/F位的基因型(例如，207位上只有核苷酸G说明是158VV基因型，207位上只有核苷酸T说明是158FF基因型；以及207位上有核苷酸G和T说明是158FV基因型)。
另一方面，本发明提供了区分FcγRIIIa和FcγRIIIb的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)利用包含至少一种本文所述寡核苷酸(如SEQ ID NO1-19)的寡核苷酸的至少第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸，其中每一组合中的至少一种寡核苷酸引物是FcγRIIIa或FcγRIIIb特异性的；以及(c)检测利用每一种寡核苷酸组合扩增后是否存在扩增的核酸，其中扩增的寡核苷酸是否存在是FcγRIIIa和FcγRIIIb的区别。
在另一方面，本发明提供了区分FcγRIIIa和FcγRIIIb的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)扩增分离的核酸；(c)利用权利要求1-4中任一项所述寡核苷酸的至少一个合适的组合作为测序引物对扩增出的核酸进行测序；以及(d)确定121、153、179和313位上的核苷酸，从而区分FcγRIIIa和FcγRIIIb。在某些实施方式中，其中的步骤(b)包括利用本文所描述的寡核苷酸的至少第一和第二组合扩增分离的核酸，所述的组合至少包含一种本文所描述的寡核苷酸作为正义和反义引物。
在另一方面，本发明包括用于FcγRIIIa基因分型的试剂盒，该试剂盒包含一对或多对包含至少一种本文所述寡核苷酸的引物寡核苷酸；以及对生物样品进行FcγRIIIa基因分型的文字说明书。在某些实施方式中，试剂盒还包含测序引物，如本文所描述的一种或多种寡核苷酸。
在某些实施方式中，该方法包括利用本文所描述的多对寡核苷酸引物确定单体型。
在本文所描述的所有方法中，扩增包括PCR、RT-PCR、转录介导的扩增(TMA)、TaqManTM或上述方法的组合。
在其他实施方式中，本发明涉及用于FcγRIIIa基因分型的试剂盒，该试剂盒包含本文所描述的一对或多对引物寡核苷酸；以及对生物样品进行FcγRIIIa基因分型的文字说明书。测序引物和测序说明书也可包含在本文所描述的试剂盒中，或者用另外一个试剂盒装测序试剂和说明书。在其他实施方式中，试剂盒还可以包含聚合酶和缓冲液。在某些实施方式中，试剂盒还包含本文所描述的一对或多对测序寡核苷酸一旦参考下面的详细描述和附图就会清楚地了解本发明的这些方面及其他方面。另外，本文所涉及的参考文献更详细地描述了某些过程或组合物，因此被完整纳入本文作为参考。
附图简述
图1A和B分别描述了FcγRIIIa和FcγRIIIb基因的核苷酸序列的比对。图1A排列对比了FcγRIIIa(上行，标记的HSFCGR31，也称为B基因)和FcγRIIIb(下行，标记的HSFCGR32，也称为A基因)的部分cDNA序列。图1A中用方框显示的是A基因或B基因的位置(位置473、531和641)以及预示V→F取代的位置559上的单核苷酸多态性(只发生在A基因上)。图1B排列对比了A基因和B基因的外显子4，显示了两个基因之间的各种核苷酸差异，其中包括313位置上高度特异性的核苷酸变异，其位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的。
图2描述的是指定为SEQ ID NO1到5的示例性寡核苷酸序列的定位及其相对于HSFCGR31(B基因)和HSFCGR32(A基因)的排列对比。
图3描述的是本文所述的扩增引物和测序引物的定位。示例性扩增(PCR)引物用粗黑箭头指示。天然序列上发生的多态性用黑筐指示(位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的)。示例性的测序引物用细箭头指示。命名为313(A/C)的多态性的编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的。
图4描述的是本文所述的各种引物(SEQ ID NO6-19)的定位，其位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的。
图5A-D是凝胶图的重现，显示了各种引物组合(SEQ ED NO1-5)所产生的PCR扩增产物。各道表示不同的引物组合。各图从左到右分别是1道显示的是利用引物SEQ ID NO4和1进行PCR扩增所得到的产物；2道显示的是利用引物SEQ ID NO4和2进行PCR扩增所得到的产物；3道显示的是利用引物SEQ ID NO3和1进行PCR扩增所得到的产物；4道显示的是利用引物SEQ ID NO3和2进行PCR扩增所得到的产物；5道显示的是利用引物SEQ ID NO5和1进行PCR扩增所得到的产物；以及6道显示的是利用引物SEQ ID NO5和2进行PCR扩增所得到的产物。5道存在扩增产物但6道不存在扩增产物(供体1360，图5A；供体U03-313，图5D)说明受试者的基因型是158FF。5道不存在扩增产物但6道存在扩增产物(供体1714，图5B)说明受试者的基因型是158VV。5道和6道都存在扩增产物(供体1210，图5C)说明受试者的基因型是158FV。
图6描述的是本文所述的80个样品的基因分型结果(如，PCR然后测序)。每个表的中间一栏显示的是利用本文所述的PCR-测序试验所得到的基因分型结果。每个表的右边一列(标记为“Koene”)显示的是利用本领域所描述的方法所得到的基因分型结果。
图7描述的是本文所述的示例性寡核苷酸的序列。
图8描述的是本文所述的其他示例性寡核苷酸序列。
图9是进行PCR的96孔板的示意图，6种不同的引物组合，其中每一种组合占2列，每列8孔。
图10是另一个96孔板基因分型试验的示意图，所用的培养板见图9的描述。利用3个对照和13个患者样品筛选6种不同的引物组合。
图10描述的是用于PCR-测序试验的参考序列。
发明详述除非特别说明，本发明的实现将依赖于本领域技术人员所熟知的化学、生物化学、重组DNA技术和病毒学的常规方法。这些技术在文献中有详细解释。参见A.L.Lehninger，《生物化学》(Biochemistry)(Worth Publishers，Inc.，current addition)；Sambrook等，《分子克隆实验室手册》(Molecular CloningA Laboratory Manual)(第2版，1989)；《酶学方法》(Methods In Enzymology)(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis)(N.Gait编，1984)；《分子克隆试验指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning)(1984)。
本文引用的所有出版物、专利和专利申请，无论上文引用的还是下文引用的，都已完整纳入本文作为参考。
必须要强调的是，除非其内容清楚地指示出之外，本说明书及其附属权利要求所使用的单数形式的“一个”、“一种”和“这种”也包括其复数形式。因此，如“一个寡核苷酸”也包括两个或多个寡核苷酸的混合物，等等。
下面的氨基酸缩写用于全文中丙氨酸Ala(A)精氨酸Arg(R)天冬酰胺Asn(N) 天冬氨酸Asp(D)半胱氨酸Cys(C) 谷氨酰胺Gln(Q)谷氨酸Glu(E)甘氨酸Gly(G)组氨酸His(H)异亮安酸Ile(I)亮氨酸Leu(L)赖氨酸Lys(K)蛋氨酸Met(M)丙氨酸Phe(F)脯氨酸Pro(P)丝氨酸Ser(S)苏氨酸Thr(T)色氨酸Trp(W)酪氨酸Tyr(Y)缬氨酸Val(V)I.定义在描述本发明时将用到下列术语，现将这些术语定义如下。
术语“基因分型”、“单体型”和“DNA分型”可交互使用，是指一个个体的某个特定染色体或染色体某个部分上的等位基因的确定。
“分离的”用于指多肽时是指分离自整个有机体的指示分子，在天然状态下该分子存在于该有机体内，或者以基本不存在其他相同类型的生物大分子的状态存在。术语“分离的”用于指多聚核苷酸时是指全部或部分缺失在天然状态下与其相结合的序列的核酸分子；或者是指自然界中存在的但却含有与之相关的异源序列的序列；或者是指从染色体中分离的分子。
本文所用的术语“多聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括任意长度的核苷酸的多聚形式，无论是核糖核苷酸还是脱氧核糖核苷酸。这个术语只代表分子的一级结构。因此，该术语包括三链、双链和单链DNA，以及三链、双链和单链RNA。它还包括多聚核苷酸的修饰形式，如通过甲基化和/或加帽修饰，及其未修饰的形式。更特别的是，术语“多聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多聚核糖核苷酸(含有D-核糖)、其嘌呤和嘧啶碱基为N-或C-糖苷的任何类型的多聚核苷酸、以及含非核苷酸骨架的其他聚合物，例如聚酰胺(如肽核酸(PNA))和多吗啉代(polymorpholino)(购自Anti-Virals，Inc.，Corvallis，Oregon，名为Neugene)聚合物，以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，只要其构型中含有的nucleobases能进行碱基配对和碱基堆砌就可以，如DNA和RNA所发生的。术语“多聚核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”之间无长度差异的意思，这些术语可交互使用。这些术语仅仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括3′-脱氧-2′，5′-DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3’，P5′磷酰胺、2′-O-烷基-取代RNA、双链和单链DNA以及双链和单链RNA、DNARNA杂合子、以及PNA和DNA或RNA之间的杂合子，还包括已知类型的修饰，如本领域熟知的标记、甲基化、“加帽”、用一个类似物替代一个或多个天然核苷酸、内部核苷酸修饰，如用不带电荷的连接(如甲基碳磷酸盐、磷酸三酯、磷酰胺、氨基甲羧酯等)、带负电荷的连接(如磷硫酰、二硫代硫酸酯等)以及带正电荷的连接(如氨基烷基磷酰胺、氨基烷基磷酸三酯等)进行的修饰，那些含垂挂基序的分子，如蛋白(包括核酶、毒素、抗体、单链肽、多聚-L-赖氨酸等)、那些含鳌合剂(如金属、放射性均能数、硼、氧化金属等)的分子、那些含烷基化剂(alkylator)的分子、那些含修饰连接(如α异头核酸等)的分子、以及多聚核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。DNA特指脱氧核糖核酸。
多聚核苷酸“来源于”或“特异于”指定序列是指该多聚核苷酸序列包含一段至少含约6个核苷酸、优选至少约8个核苷酸、更优选至少约10-12个核苷酸、至少约15-20个核苷酸的连续序列相应于、即一致于或互补于指定核苷酸序列的一个区域。衍生的多聚核苷酸不一定是从目的核苷酸序列中生理性地衍生的，而是可以任何方式产生，其中包括而不限于化学合成、复制、反转录或转录，转录和反转录是指根据某区域上碱基序列所提供的信息从该区域衍生多聚核苷酸序列。因此，它代表了起始多聚核苷酸的正义方向或反义方向。
“同源性”是指两个多聚核苷酸或两个多肽基序之间的百分相同性。两个多聚核苷酸或两个多肽序列是彼此“基本同源的”是指在分子的给定长度上两个序列至少有约50％、优选至少约75％、更优选的至少约80％-85％、至少约90％、最优选的至少约95％-98％的序列相同性。如本文所使用的，基本同源也指序列与特定的多聚核苷酸或多肽序列完全一致。
一般来说，“相同性”是指两个多聚核苷酸或多肽序列分别达到正确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸相符。百分相同性可通过将两个分子排列在一起直接比较序列的信息、计算两个排列在一起的序列之间完全匹配的残基数目、除以短序列的长度、结果再乘以100而确定。
现有的计算机程序可用于帮助分析同源性和相同性，如ALIGN，Dayhoff，M.O.，见M.O.Dayhoff编的《蛋白质序列和结构图谱》(Atlas of Protein Sequence andStructure)，增刊5，3353-358，National biomedical Research Foundation，Washington，DC，该程序采用Smith和Waterman在Advances in Appl.Math.2482-489，1981中所描述的局部同源性算法进行肽序列分析。确定核苷酸序列同源性的程序见于Wisconsin Sequence Analysis Package，Version 8(可从Genetics Computer Group，Madison，WI获得)，例如，BESTFIT、FASTA和GAP程序，这些程序也依赖于Smith和Waterman算法。利用厂家推荐的以及上述Wisconsin Sequence Analysis Package所描述的默认参数可以很容易地使用这些程序。例如，特定核苷酸序列与参考序列的百分相同性可利用Smith和Waterman的同源性算法确定，使用默认的计分表和6核苷酸位置的间隙补偿。
在本发明的内容中确定百分同源性的另外一种方法是利用MPSRCH包中的程序，该程序包的版权为爱丁堡大学所有，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，由IntelliGenetics，Inc.(Mountain View，CA)发布。这套程序包使用了Smith-Waterman算法，其中的默认参数可用于计分表(如间隙开放补偿为12、间隙延伸补偿为1和间隙为6)中。从得到的数据中可得到“匹配”值，该值反映了“序列同源性”。其他适于计算序列之间百分相同性或相似性的程序都是本领域所熟知的，例如，另一种算法程序是使用默认参数的BLAST。例如，BLASTN和BLASTP可用下列默认参数genetic code＝standard；filter＝none；strand＝both；cutoff＝60；expect＝10；Matrix＝BLOSUM62；Descriptions＝50 sequences；sort by＝HIGH SCORE；Databases＝non-redundant，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swissprotein+Spupdate+PIR。这些程序的详细描述可见于下列网址http//www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST。
另外，通过在两个同源区之间能形成稳定双螺旋的条件下进行多聚核苷酸的杂交、然后用单链特异性核酶消化、再确定消化片段的大小来确定同源性。基本同源的DNA序列可通过严格条件下的Southern杂交试验来确定，其中的杂交条件根据特定的系统来确定。确定合适的杂交条件是本领域技术人员所熟知的。见Sambrook等，同上；《DNA克隆》(DNA Cloning)，同上；《核酸杂交》(Nucleid Acid Hybridization)，同上。
本文用于描述核酸分子的术语“重组子”是指基因组、cDNA、病毒的、半合成的或合成的多聚核苷酸，合成的或半合成的多聚核苷酸是指根据其起源或操作不再与其天然相关的多聚核苷酸的全部或部分序列相关的多聚核苷酸。术语“重组子”用于指蛋白或多肽时是指通过重组多聚核苷酸表达而制备的多肽。一般来说，方法为克隆目的基因，然后在转化的有机体内表达，如将在下文中进一步描述的。宿主有机体表达外源基因，在表达条件下生产蛋白质。
“依赖于DNA的DNA聚合酶”是指能从DNA模板开始合成互补的DNA拷贝的酶。例子有大肠杆菌来源的DNA聚合酶I和噬菌体T7DNA聚合酶。所有已知的依赖于DNA的DNA聚合酶都需要一个互补的引物来起始合成。在适当的条件下，依赖于DNA的DNA聚合酶可从RNA模板开始合成互补的DNA拷贝。
“依赖于DNA的RNA聚合酶”或“转录酶”是指能从含启动子序列(通常是双链)的双链或部分双链DNA分子开始合成多个RNA拷贝的酶。RNA分子(“转录子”)按5’到3’方向合成，合成的起点正好位于启动子下游的某个特定位置。转录酶的例子有大肠杆菌以及噬菌体T7、T3和SP6来源的依赖于DNA的RNA聚合酶。
“依赖于RNA的DNA聚合酶”或“反转录酶”是指能从RNA模板开始合成互补的DNA拷贝的酶。所有已知的反转录酶也都能从DNA模板开始合成互补的DNA拷贝；因此，它们既是依赖于RNA的又是依赖于DNA的DNA聚合酶。用RNA模板和DNA模板起始合成都需要引物。
“RNA酶H”是能降解RNADNA双螺旋中RNA部分的酶。这些酶可以是内切酶，也可以是外切酶。大多数反转录酶除了具有聚合酶活性外一般都具有RNA酶H活性。然而，现在已有其他来源的无相关聚合酶活性的RNA酶H。降解可导致RNA从RNADNA复合物上分离出来。另外，RNA酶H可在任何部位单切RNA，如RNA消失的部分，或者允许酶到RNA的展开部分。
本文所用的术语“靶核酸区”或“靶核酸”是指含有被扩增“靶序列”的核酸分子。靶核酸可以是单链的，也可以是双链的，除了靶序列外还可以包含其他序列，这些序列不被扩增。术语“靶序列”是指被扩增靶核酸上的特定核苷酸序列。靶序列可包含探针杂交区，该区位于靶分子内，在适宜的条件下探针可与该区形成稳定的杂合子。“靶序列”还可以包含复合序列，寡核苷酸引物与其复合，以靶序列为模板进行延伸。如果靶核酸开始是单链的，那么术语“靶核酸”也指靶核酸内与“靶序列”互补的序列。如果“靶核酸”开始是双链的，那么术语“靶序列”既指正(+)链也指负(-)链。
本文所用的术语“引物”或“寡核苷酸引物”是指处于适当条件时能起始互补核酸链合成的寡核苷酸，其中所述的条件是指该条件可诱导引物延伸产物的合成，即，有核苷酸和多聚化诱导试剂如DNA或RNA聚合酶的存在以及适宜的温度、pH、金属离子浓度和盐浓度。优选的引物是单链的，以使扩增效率最优化，但是也可以是双链的。如果是双链的，引物在用于制备延伸产物前需要进行预处理以使其双链分开。这个变性步骤通常受加热的影响，但是也可用碱处理，然后进行中性化来完成。因此，“引物”是与模板互补的，通过氢键或与模板杂交复合形成引物/模板复合物，以便于聚合酶来起始合成过程，在DNA或RNA合成的过程中通过在引物的3’端添加共价结合且与模板互补的碱基来使引物延伸。
本文所用的术语“探针”或“寡核苷酸探针”是指由上述多聚核苷酸组成的结构，该结构含有与靶核酸分析物中存在的核酸序列互补的核酸序列。探针的多聚核苷酸区可以由DNA、和/或RNA、和/或合成的核苷酸类似物组成。当“寡核苷酸探针”被用于5’核酸酶分析如TaqManTM技术时，探针至少含有一个荧光分子和一个淬灭剂，后者可被反应中所用的聚合酶的5’内切酶活性所消化以检测任何扩增的寡核苷酸靶序列。在这种情况下，寡核苷酸探针会有足够数量的临近其5’端的磷酸二酯连接子，这样所用的5’到3’核酶活性可有效地降解结合的探针从而使荧光分子与淬灭剂分开。当寡核苷酸探针用于TMA技术时，探针应当被适当标记，如下文所描述的。
需要说明的是，杂交序列并不需要完全的互补来提供稳定的杂合子。在许多情况下，当约10％以下的碱基错配、无论形成4碱基或多碱基环时也可以形成稳定的杂合子。相应的，本文所用的术语“互补”是指寡核苷酸在试验条件下能与其“互补链”形成稳定的双螺旋，一般来说是指存在约90％或更高的同源性。
术语“杂交”是指具有足够的互补性能通过Watson-Crick碱基配对形成复合物的两个核苷酸序列形成复合物的过程。如果引物能与靶序列(模板)“杂交”，那么这种复合物(或杂合子)就是足够稳定的，能够行使DNA聚合酶启动DNA合成所需要的启动功能。
本文所用的术语“结合对”是指能彼此特异性结合的第一和第二分子，如能形成核酸双螺旋的互补多聚核苷酸对。结合对的第一成员与样品中结合对的第二成员“特异性结合”是指第一成员与第二成员或者第二成员与第一成员以高于样品中其他组分的亲和性和特异性进行结合。结合对成员之间的结合通常是非共价的。除非上下文清楚地说明，本文所用的术语“亲和分子”和“靶分析物”分别指结合对的第一和第二成员。
术语“特异性结合分子”和“亲和分子”在本文可交互使用，是指能通过化学或物理方式与样品中存在的可检测物质特异性结合的分子。“特异性结合”是指分子优先与目的靶分子结合，或者与靶分子结合的亲和性高于其他分子。例如，DNA分子可与实质互补的序列结合，但是不能与不相关序列结合。
双链DNA的“解链温度”或“Tm”被定义为由于加热或使碱基对之间的氢键断裂的其他处理如酸或碱处理等而导致DNA的双螺旋结构丢失一半时的温度。DNA分子的Tm与其长度及碱基组成有关。富含GC碱基对的DNA分子比富含AT碱基对的DNA分子具有更高的Tm。当温度低于Tm时，DNA分子分开的两条互补链可以从新结合或复性形成DNA双螺旋。核酸杂交的最高速率发生在约Tm以下25℃。Tm可用下列公式测算Tm＝69.3+0.41(GC)％(Marmur等，(1962)J.Mol.Biol.5109-118)。
本文所用的术语“标记”和“可检测标记”是指能被检测的分子，其中包括而不限于放射性同位素、荧光素、化学发光分子、发光素、酶、酶的底物、酶的复合因子、酶的抑制剂、发光素、染料、金属离子、金属溶液(metal sols)、半导体纳米晶体、配基(如生物素、亲和素、链亲和素或肝素)等。术语“荧光素”是指在可检测范围内可发荧光的物质或其部分。
本文所用的术语“固相支持物”是指固相表面，如磁珠、橡胶珠、微滴定板孔、玻片、尼龙、琼脂、丙烯酰胺等。
本文所用的术语“生物样品”是指从受试者体内分离的组织或液体样品，其中包括而不限于血液、血浆、血清、粪便、尿液、骨髓、胆汁、脊髓液、淋巴液、皮肤样品、皮肤、呼吸道和肠道分泌物、泪液、唾液、乳汁、血液细胞、器官、组织活检标本以及体外细胞培养物样品，其中包括而不限于供细胞和组织生长的培养基来源的条件培养基，如重组细胞和细胞组分。上述的样品并不一定必须是直接得自其来源的形式。例如，样品在使用前可加以处理，如在分析前进行加热、离心等。
“脊椎动物”是指心脏亚门(subphylum cordata)的所有成员，其中包括而不限于哺乳动物，如马、人和鸟类。该术语未限定特定的年龄，因此成年动物和新生动物以及胎儿都包括在内。
II.概述本文提供了用于确定受试者FcγRIII基因型的各种组合物和方法。本发明特地描述了用于确定FcγRIIIa(A基因)的158V/F位点上受试者基因型的新型寡核苷酸(如引物)。本文所描述的分析方法的准确度部分依赖于本文所述的组合物和方法是否能够清楚地区分A基因和B基因。虽然A基因和B基因都位于1号染色体上，但是本说明书的结论证明B基因并不包含158V/F多态性，总是VV纯合的。
本发明还描述了进行FcγRIII基因分型的方法，其中包括利用本文所描述的一种或多种寡核苷酸。FcγRIIIa在158F/V位点上的基因型可通过单次PCR反应(如，一对引物)；多次PCR反应(如，不同的引物组合)；和/或单次或多次PCR反应、然后进行测序或其他核酸分析技术来确定。
利用本文所描述的组合物和方法，可以很容易地对一个特定个体进行基因分型，例如，为了更好地确定治疗方案。因此，对任何患者都可以很容易地进行药物基因学分析。
在详细描述本发明前，应当理解的是本发明并不局限于特定制剂或处理参数，这些参数是可以改变的。还应当理解的是本文所用的方法只是为了描述本发明的特定实施方式，并不意味着对本发明的限制。
虽然与本文所描述的组合物和方法相似或等价的许多组合物和方法都可用于实现本发明，但是本文所描述的都是优选的材料和方法。
III.寡核苷酸本文所描述的是可用于确定个体FcγRIII单体型的新型核苷酸序列。另外，本文所描述的引物序列可用于精确地区分FcγRIIIA(A基因)和FcγRIIIB(B基因)。
为了便于描述，能识别A基因和B基因编码序列(cDNA)的引物按Ravetch和Perussia(1989)J.Exp Med 170481和NCBI登记号NM_000569所描述的方法进行位置编号和排列。另外，能识别基因组DNA的引物的位置编号和排列是相对于外显子4的第一个碱基的。
本文所描述的序列一般用作引物，如PCR引物和/或测序引物。如表1所述，引物可以是A基因或B基因特异性的，也可以是非特异性的，另外，引物还可以是一种或多种多态性特异性的，其中优选158F/V单核苷酸多态性特异性的引物(图1)。在某些实施方式中，寡核苷酸还可用于扩增包含一种或多种其他多态性的序列，如图2所描述的。这种序列的非限定性例子见表1。
表1
因此，本文所描述的寡核苷酸优选包含一个或多个定义多态性(如158F/V多态性)的核苷酸和/或能区分A基因和B基因的核苷酸。所使用的优选引物可扩增至少包含158F/V多态性的序列。在某些实施方式中，所使用的引物可扩增包含多种多态性的序列。例如，如图3所示，引物能扩增的序列包含而不局限于位置121(G/A)、153(T/C)、179(C/T)、207(G/T)和313(C/A)上的多态性，其位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的。前4个位置与位置473(G/A)、505(T/C)、531(C/T)和559(G/T)相对应，后者的位置编号是相对NM_000569而言的。
另外，如下文实施例所详细描述的，本说明书还说明了位置313上单个核苷酸(A/C)的差异对于A基因或B基因来说是高度特异性的，其位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的。更特殊的是，在A基因中，这个位置上的残基总是A，而在B基因中，这个位置上的残基总是C。因此，在某些实施方式中，引物包含这个A基因或B基因特异性的残基。
在某些实施方式中，差异碱基(如多态性和/或A基因或B基因特异性的碱基)都是寡核苷酸序列(引物)的末端碱基。例如，如图2所述，3’引物158-3’A(SEQ ED NO1)的3’核苷酸是158F单体型特异性的(如，位置559上为T)，而3’引物158-3’C(SEQED NO2)的3’核苷酸是158V单体型特异性的(如，位置559上为G)。同样，3’引物5’T(SEQ ED NO3)的5’核苷酸是B基因特异性的(如位置531上为T)，而5’引物5’C(SEQ ED NO5)的3’核苷酸是A基因特异性的(如位置531上为C)。5′引物5′A(SEQID NO4)是A基因和B基因通用的，因为其末端在530位置。
本文所描述的引物还可以包含与A基因或B基因序列错配的一个或多个碱基。在某些情况下，引入错配碱基对可提供对基因的特异性。错配碱基优选位于引物的内部。特别有用的寡核苷酸分别包含所描述的各种寡核苷酸的核苷酸序列，或者与这些序列至少有约80-90％或更高序列相同性的序列，其中包括这些范围内的任意百分序列相同性，如81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99％的序列相同性。如上文所解释，寡核苷酸所来源的区域通常都包含一种或多种多态性。另外，利用本领域技术人员所熟知的方法可以改造寡核苷酸以提高其与靶核酸的结合亲和力。
寡核苷酸引物的长度不是关键，本领域的技术人员可以很容易地设计。寡核苷酸可以包含约5到500个核苷酸的特定保守区，优选约10到100个核苷酸，更优选约10到69个核苷酸，或以下范围内的任意整数，如包含目的保守区来源的18、19、20、21、22、23、24、25、26...35...40等个核苷酸的序列。优选的引物至少有10个核苷酸长，更优选的在约15到30个核苷酸之间(包括15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个核苷酸)，更优选的是在约15到25个核苷酸之间。
本文所描述的寡核苷酸(如引物和探针)利用标准技术可以很容易地合成，如通过磷酰胺化学进行固相合成，见美国专利Nos.4,458,066和4,415,732的描述，本文已完整纳入参考；Beaucage等，(1992)Tetrahedron 482223-2311；以及AppliedBiosystems User Bulletin No.13(1987/04/01)。其他化学合成方法包括Narang等，Meth.Enzymol.(1979)6890所描述的磷酸三酯方法和Brown等，Meth.Enzymol.(1979)68109所描述的磷酸二酯方法。利用相同的方法可将多聚A或多聚C或其他非互补核苷酸延长链连接到探针上。可用本领域熟知的方法将六环氧乙烷突出端偶联到探针上。Cload等，(1991)J.Am.Chem.Soc.1136324-6326；Levenson等的美国专利No.4,914,210；Durand等，(1990)Nucleic Acids Res.186353-6359；以及Horn等，(1986)Tet.Lett.274705-4708。
另外，寡核苷酸上可以偶联标记物以便于检测。已知有几种方式可用于以活性功能基团修饰寡核苷酸从而添加上标记物。例如，现在有几种方法可将探针生物素化从而通过亲和素来连接放射性的、荧光的、化学发光的、酶催化的或高电子密度的标记物。参见Broken等，Nucl.Acids Res.(1978)5363-384所描述的使用铁蛋白-亲和素-生物素标记物的方法；以及Chollet等，Nucl.Acids Res.(1985).131529-1541所描述的通过氨基烷基磷酰胺连接臂生物素化寡核苷酸5’末端的方法。现在有几种方法也可用于合成氨基衍生化的寡核苷酸，从而可以很容易地用氨基活化基团衍生的荧光化合物或其他类型的化合物标记，如异硫氰酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺等，参见Connolly(1987)Nucl.Acids Res.153131-3139，Gibson等，(1987)Nucl.Acids Res.156455-6467以及Miyoshi等的美国专利No.4,605,735。现在已经有方法来合成能与巯基特异性标记物反应的巯基衍生的寡核苷酸，参见Fung等的美国专利No.4,757,141，Connolly等，(1985)Nucl.Acids Res.134485-4502以及Spoat等，(1987)Nucl.Acids Res.154837-4848。对标记DNA片段的方法的全面阐述见Matthews等，Anal.Biochem.(1988)1691-25。
例如，可以通过在探针的非连接端连接一个荧光分子对寡核苷酸进行荧光标记。筛选合适的荧光标记物的方法见Smith等，Meth.Enzymol.(1987)155260-301；Karger等，Nucl.Acids Res.(1991)194955-4962；Haugland(1989)《荧光探针和研究化学物质手册》(Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals)(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)。优选的荧光标记物包括荧光素及其衍生物，如美国专利No.4,318,846和Lee等，Cytometry(1989)10151-164所描述的荧光标记物以及6-FAM、JOE、TAMRA、ROX、HEX-1、HEX-2、ZOE、TET-1或NAN-2等另外，寡核苷酸也可以通过下文所描述的技术用吖啶酯(AE)来标记。目前的技术可以将AE标记物置于探针内的任何位置。参见Nelson等(1995)“通过化学放光来检测吖啶酯”，选自《非同位素探针、杂交和测序》(Nonisotopic of Acridinium Esters byChemiluminescence)，Kricka L.J.(编)Academic Press，San Diego，CA；Nelson等(1994)“杂交保护分析(HPA)在PCR中的应用”，选自《聚合酶链式反应》(The PolymeraseChain Reaction)，Mullis等(编)Birkhauser，Boston，MA；Weeks等，Clin.Chem.(1983)291474-1479；Berry等，Clin.Chem.(1988)342087-2090。AE分子可通过非核苷酸连接臂化学直接连接到探针上，该方法可将标记物置于探针内的任何位置上。参见美国专利Nos.5,585,481和5,185,439。
IV.核酸分析方法本文所描述的一种或多种寡核苷酸被用于一种或多种核酸分析方法中以确定FcγRIII单体型，例如158V/F多态性上的FcγRIIIa单体型。
基因分型可在任何合适的样品上进行。例如，利用标准技术如硫氰酸胍-酚-氯仿提取技术(Chomocyznski等，(1987)Anal.Biochem.162156)可以很容易地从表达FcγRIII的细胞中分离核酸。RNA和/或基因组DNA都可以分离。然后最好将分离的核酸(RNA或DNA)扩增。
扩增靶核酸通常用核酸聚合酶来产生多拷贝的靶核酸或其片段。适用的扩增技术是本领域所熟知的，如转录介导的扩增、聚合酶链式反应(PCR)、复制酶介导的扩增以及连接酶链式反应(LCR)。
A.聚会酶链式反应(PCR)在某些实施方式中，扩增过程包括利用聚合酶链式反应(PCR)为基础的技术如RT-PCR来确定任何生物样品的FcRIII单体型。PCR是一种用于扩增包含在核酸分子或分子混合物中的目的靶核酸序列的技术。在PCR中，使用过量的引物对与靶核酸的互补链杂交。聚合酶以靶核酸为模板使引物各自延伸。延伸产物与起始靶核酸链解离后其自身又成为靶序列。然后新的引物杂交其上，聚合酶使引物延伸，随着循环的重复进行靶序列分子的数目呈几何级数递增。扩增样品中靶核酸序列的PCR方法是本领域所熟知的，已被描述于以下文献中Innis等(编)《PCR手册》(PCRProtocols)(Academic Press，NY 1990)；Taylor(1991)“聚合酶链式反应基本原理和自动化”，选自《PCR试验方法》(PCRA Practical Approach)，McPherson等(编)IRLPress，Oxford；Saiki等，(1986)Nature 324163；以及美国专利Nos.4,683,195，4,683,202和4,889,818，上述文献都已完整纳入本文作为参考。
具体地说，PCR使用相对较短的寡核苷酸引物，引物位于要扩增靶核苷酸序列的两侧，其3’端彼此相对，一个引物向另一个引物延伸。提取多聚核苷酸样品，使之变性，优选通过加热变性，然后与摩尔级过量存在的第一和第二引物杂交。利用引物和模板依赖性的多聚核苷酸多聚化试剂，如能合成引物延伸产物的酶，在四种脱氧核糖核苷三磷酸酯(dNTPdATP、dGTP、dCTP和dTTP)存在的情况下催化多聚化反应，能合成引物延伸产物的酶包括大肠杆菌DNA聚合酶I、DNA聚合酶的Klenow片段、T4 DNA聚合酶、从水生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)(现已有各种来源的酶可用(如Perkin Elmer)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(United StatesBiochemicals)、嗜热脂肪芽胞杆菌(Bacillus stereothermophilus)(Bio-Rad)或海滨热球菌(Thermococcus litoralis)(″Vent″聚合酶，New England Biolabs)中分离的热稳定性DNA聚合酶。多聚化反应的结果是产生了两条“长产物”，其5’端分别含有引物，引物与新合成的起始链的互补链共价连接。然后反应混合物再回到多聚化条件下，如通过降低温度、灭活变性试剂或加入更多的聚合酶，第二轮反应开始。第二轮反应可提供两条起始链、第一轮反应所产生的两条长产物、从起始链复制的两条新的长产物和从长产物复制的两条“短产物”。短产物含有靶序列的序列，其末端为引物。每增加一个循环就会产生两条额外的长产物，以及与上轮反应结束时的长、短产物数目相等的短产物。因此，包含靶序列的短产物数目随着每一循环的进行呈指数增长。优选采用商品化热循环仪如Perkin Elmer进行PCR。
RNA可以通过将mRNA反转录成cDNA来扩增，然后进行PCR(RT-PCR)，如上文所描述。另外，一种酶也可以用于两个步骤，如美国专利No.5,322,770所描述。mRNA还可以反转录成cDNA，然后进行不对称裂隙连接酶链式反应(RT-AGLCR)，如Marshall等，(1994)PCR Meth.App.480-84所描述。特定的PCR条件(如温度、循环时间等)对于实现本发明不是关键的，本领域的技术人员很容易确定PCR条件。
在某些实施方式中，精确的基因分型仅通过引物的正确设计和选择进行PCR反应就可达到。例如，利用引物进行PCR扩增所得到的序列通常都能提供足够的信息来确定158V/F单体型以及区分A基因和B基因，其中的引物可扩增位置559上包含多态性的序列和位置313上多态性特异性的基因(其位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的)。
对于以PCR为基础的技术来说，在某些情况下使用包含多种多态性的引物是优选的。包含多种多态性可提供固有的内对照。所选择的引物只能扩增A基因或B基因，或者从两个基因都可以扩增序列。可用于本发明的单对引物组合的典型例子见图7所示(SEQ ID NO1-11，其中包括SEQ ID NO6、7、8之一与SEQ ID NO9、10、11之一的组合或SEQ ID NO1、2之一与SEQ ID NO3、4、5之一的组合)。
另外，虽然利用表1所示的一对合适引物扩增受试者的DNA样品就足以确定基因型，但是本说明书还提供了其他的分析方法以提高基因分型的精确度，其中包括进行另外的PCR和/或测序。
例如，在某些实施方式中，PCR扩增是用多种引物组合进行的，分析每种组合所得到的扩增条带的模式以便于精确地确定受试者的基因型。在特别优选的实施方式中，每个样品都进行多种不同的PCR试验，例如，利用不同的3’(反向)引物与不同的5’(正向)引物组合进行多个反应。
例如，利用3’引物SEQ ID NOs1、2与5’引物SEQ ID NOs3、4、5的组合(如SEQ ID NOs1和3；SEQ ID NOs2和3；SEQ ID NOs1和4；SEQ ID NOs2和4；SEQ ID NOs1和5；SEQ ID NOs2和5)可进行6种不同的PCR扩增。不同扩增反应所得到的结果进行比较(如通过凝胶电泳)，特定的模式用于确定受试者的单体型。利用引物对可有效而精确地在这个重要的位点上进行基因分型，其中引物对中的一个引物是A基因特异性的、B基因特异性的或A、B基因通用的引物，另一个引物是158V或158F特异性的。
图5显示了多个PCR扩增反应的结果，每个反应所包含的引物组合都是不同的。扩增以后得到的产物用标准的4％琼脂糖凝胶进行电泳(也参见实施例)，然后观察得到的产物。根据PCR反应所使用的不同引物组合标记图5的不同道。图5A和D的模式说明受试者在A基因上是158FF(纯合的)。图5B说明受试者在A基因上是158VV纯合的，而图5C说明受试者在A基因上是158FV(杂合的)。所有部分都包含内对照，其中利用的是5’引物T(B基因特异性的SEQ ID NO3)和3′引物A(158F特异性的，SEQ ID NO1)的组合，这种组合不应该产生PCR产物，因为B基因在559位置上不含多态性。
B.测序在其他的实施方式中，本文所述的基因分型还包括对PCR扩增产物进行测序的步骤。本文所描述的任何引物都可以作为测序引物。特别优选作为测序引物的是那些与多态性结合的引物，一旦结合以后，就可以对多态性158V/F相应的基因片段进行测序。典型的测序引物描述于图8中(SEQ ID NOs12-19)。
直接测序可通过化学测序如利用Maxam-Gilbert方法，或者通过酶催化测序如利用Sanger方法来完成。对于后者来说，利用标准方法合成特异性的寡核苷酸作为引物来进行二脱氧核苷酸测序反应。参见Sambrook，同上，以及下面的实施例。
图6显示的是在A基因158V/F位点上的基因分型结果，该结果得自下列试验利用本文所述引物进行PCR，然后进行测序(“PCR-SEQ”)，并与利用上述引物(“Koene”)单独进行PCR所得到的结果进行比较。在所比较的80个样品中，有10个利用Koene等，同上，所描述的引物和PCR方法所得到的基因分型结果不正确。利用上述方法进行基因分型所得结果不正确的样品有A609201、A609372、A610260、A612201、A701320、NCM460、A609203、A701017、Kyse410和肾样品。另外，与本文所描述的分析方法不同，上述方法不能区分A基因和B基因。
C.TaqManTM荧光5’核酶分析，也被称为TaqManTM分析(参见Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)887276-7280)，是一种高效而通用的以PCR为基础的核酸靶位检测系统。因此，本文所描述的引物和探针也可用于TaqManTM分析以确定受试者的FcγRIII基因型。该分析方法通过监测荧光信号的产生与热循环联用。该分析系统需要进行凝胶电泳分析，能够得到大量的数据用于确定靶核酸拷贝数。例如，利用上述分析样品的一系列稀释绘制标准曲线。利用每个标准品的拷贝数对与之比较的未知样品作标准图。
用AmpliTaq GoldTMDNA聚合酶进行荧光5’核酶分析是很方便的，该酶具有内在的5’核酶活性，可以在标记荧光报告染料和淬灭剂的寡核苷酸探针内部将其消化(见，Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)887276-7280；以及Lee等，Nucl.AcidsRes.(1993)213761-3766)。通过测定扩增循环期间荧光探针被消化而产生的荧光信号变化来检测分析结果，其中染料和淬灭剂标记物解离而导致的荧光信号强度的增加是与靶核酸的扩增数目成正比的。
扩增产物可在溶液中检测，也可用固相支持物检测。在这种方法中，所设计的TaqManTM探针可与PCR产物内的靶序列杂交。TaqManTM探针的5’末端含有一个荧光报告染料，其3’末端被封闭以阻止探针延伸，并且含有一个能淬灭5’荧光素荧光的染料。在随后的扩增过程中，如果反应体系中存在具有5’外切酶活性的聚合酶，则5’荧光标记被切下。被切下的5’荧光素可导致被检测到的荧光信号增强。有关TaqManTM分析及其所用的试剂和条件的详细描述可参见Holland等，Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.(1991)887276-7280；美国专利Nos.5,538,848、5,723,591和5,876,930，本文都已完整纳入作为参考。
D.转录介导的扩增试验(TMA)本文所描述的序列还可作为转录介导的扩增(TMA)试验的基础。TMA是一种鉴定生物样品中微量靶核酸序列是否存在的方法。这种序列利用直接检测方法难以检测到。更特别的是，TMA是一种恒温的自动催化核酸靶位扩增系统，产生的靶序列RNA拷贝数可以达到10亿以上。该分析方法可定性而精确地检测生物样品中是否存在靶序列。该分析方法还能够定量地检测靶序列的量，其检测的浓度范围跨越几个数量级。TMA可提供一种自动催化合成多拷贝靶核酸序列的方法而不需要重复地设定反应条件，如温度、离子强度和pH。
一般来说，TMA包括如下步骤(a)从需要确定单体型的目的生物样品中分离核酸，其中包括RNA；以及(b)配制反应混合物(i)分离的核酸，(ii)第一和第二寡核苷酸引物，第一引物含有与RNA靶序列3’末端部分充分互补的复合序列，体系中如果存在靶序列(如(+)链)则与之结合，第二引物含有与靶序列互补链的3’末端部分充分互补的复合序列，体系中如果存在靶序列(如(-)链)则与之结合，其中的第一寡核苷酸还包含一个5’端正对着复合序列的序列，其中的复合序列含有启动子，(iii)反转录酶或RNA和依赖于DNA的DNA聚合酶，(iv)可特异地降解RNA-DNA复合物的RNA链的酶活性(如RNA酶H)，以及(v)可识别启动子的RNA聚合酶。
反应混合物的组分可逐步混合，也可一次性混合。反应混合物在适于寡核苷酸/靶序列形成的条件下孵育，其中包括DNA启动和核酸合成条件(包括核糖核酸三磷酸酯和脱氧核糖三磷酸酯)，以便于在一段时间内合成多拷贝的靶序列。反应优选在适于保持反应组分如组分酶稳定并且在扩增过程中不需要调整反应条件的条件下进行。相应的，反应要在基本恒温并且离子强度和pH基本恒定的条件下进行。反应一般不需要变性步骤来分离第一DNA延伸反应所产生的RNA-DNA复合物。
合适的DNA聚合酶包括反转录酶如禽骨髓瘤病毒(AMV)反转录酶(获自Seikagaku America，Inc)和Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶(获自BethesdaResearch Laboratories)。
适于掺入到引物内的启动子或启动子序列是能被RNA聚合酶识别的核酸序列(天然的、合成的或限制性内切酶消化产物)，其中的RNA聚合酶能识别并结合该序列，并且开始转录从而合成出RNA转录子。序列内还可以包含RNA聚合酶实际识别位点之外的核苷酸碱基，这些碱基的加入可影响对降解过程的稳定性或敏感性，或者增强转录效率。有用的启动子的例子包括那些能被某些噬菌体聚合酶如来自噬菌体T3、T7或SP6的聚合酶识别的启动子，或者大肠杆菌的启动子。这些RNA聚合酶可以很容易地从商业途径获得，如New England Biolabs和Epicentr。
适用于本文方法的某些反转录酶具有RNA酶H活性，如AMV反转录酶。但是，在使用AMV反转录酶时最好再添加额外的RNA酶H，如大肠杆菌RNA酶H。RNA酶H可从公司购买，如Bethesda Research Laboratories。
通过这些方法制备的RNA转录子可作为模板通过上述机制制备更多拷贝的靶序列。系统是自动催化的，扩增自动进行，不需要重复调整或改变反应条件，如温度、pH、离子强度等。
检测可使用各种方法进行，其中包括直接测序、与序列特异性的寡聚物杂交、凝胶电泳和质谱。这些方法可使用异源的或同源的形式、同位素或非同位素标记，或者根本不标记。
有关TMA的详细描述见美国专利No.5,399,491，其内容本文已完整纳入作为参考。在一个典型分析方法的实施例中，从需要进行基因分析的受试者体内分离的核酸样品与缓冲液混合，缓冲液内含有缓冲物质、盐、镁、核苷三磷酸、引物、二巯基乙醇和亚精胺。这个反应体系可在约100℃孵育约2分钟使其中的所有二级结构变性。冷却到室温后加入反转录酶、RNA聚合酶和RNA酶H，混合物在37℃孵育2到4小时。然后通过如下步骤分析反应产物使产物变性、加入探针溶液、在60℃孵育20分钟、加入可特异性水解未杂交探针的溶液、反应物在60℃孵育6分钟、然后用发光计测定剩下的化学发光强度。
如上所述，利用上文所描述的两个或多个试验就可以确定基因型。例如，第一个试验利用转录介导的扩增(TMA)来扩增核酸用于检测，然后通过上文所描述的PCR扩增、RT-PCR等进行另一个核酸检测(NAT)试验。因此，来自于任何患者的任何样品都可以被特异地确定单体型。
很容易理解的是，本文所描述的试验的设计可以有很多变化，这种变化的许多形式都是本领域所熟知的。上面的描述只是提供了一个指导，本领域的技术人员利用本领域熟知的技术可以很容易地修改所描述的操作指导。
E.试剂盒上述的试验试剂，包括引物、PCR缓冲液、测序试剂等都可以提供在试剂盒中，试剂盒内还可以包含合适的说明书和其他必须的试剂以便于进行上述试验。通常来说，试剂盒包含不同的容器，分别装有引物和探针(已经结合在固相基质上，或与将其结合到基质上的试剂分开)、对照试剂(阳性和/或阴性)、试验操作步骤需要相同时的标记试剂、以及标记物不能直接产生信号时的信号产生试剂(如酶底物)。指导试验操作的说明书(文字的说明书、磁带、VCR、CD-ROM等)也可以包括在试剂盒内。根据特定试验的不同，试剂盒还可以包含其他试剂和材料(如洗涤缓冲液等)。标准的试验，如上文所描述的那些试验，都可以用这些试剂盒来完成。
F.应用如上所述，本发明的基础在于发现了用于精确确定脊椎动物FcγRIII单体型，特别是在两个FcγRIIIa的158F/V位点上的单体型的组合物和方法。精确确定FcγRIII基因型有多方面的用途，其中包括而不限于药物基因学。药物基因学是指确定特定个体的基因型以便于确定适宜的治疗方案的科学。如上所述，具有158F/F基因型的患者对抗体治疗(如ritubimab)的反应弱于具有158V/F或158V/V基因型的患者。另外，试验证明通过预先用细胞因子处理(如IL-2)可增强患者对抗体介导的治疗措施的反应。参见2004年3月10日提交的题为“Fc受体多态性作为诊断因子在免疫反应障碍治疗措施中的应用”(USE OF FC RECEPTOR POLYMORPHISMS ASDIAGNOSTICS FOR TREATMENT STRATEGIES FOR IMMUNE-RESPONSEDISORDERS)的共享临时专利申请，本文已完整纳入作为参考。
因此，利用本文所描述的组合物和方法，那些需要治疗其免疫障碍的患者可以被有效而精确地确定基因型，相应的，这些患者也被认为是本发明的合适候选者，可利用本发明的一种或多种免疫治疗方法来治疗，该方法可介导FcγRIII激发的ADCC通路(如IL-2)。IL-2蛋白和突变蛋白是本领域熟知的。参见美国专利No.4,752,585；No.4,766,106；No.4,931,543；No.5,700,913；2004年7月7日提交的题为“组合的白细胞介素-2突变蛋白”(Combinatorial Interleukin-2Muteins)的美国专利序列号No.60/585,980；以及2004年3月5日提交的题为“改进的白细胞介素-2突变蛋白”(Improved Interleukin-2Muteins)美国专利序列号No.60/550,868，本文都已完整纳入作为参考。IL-2突变蛋白可以购买到，在下列文献中也有描述国际公开号WO91/04282；WO 99/60128；WO 00/58456；WO 00/04048；欧洲专利(EP)公开号EP136,489；1983年10月13日提交的欧洲专利申请No.83306221.9(1984年5月30日公开，公开号为EP 109,748，该专利与比利时专利No.893,016以及共有美国专利No.4,518,584等价)；欧洲专利公开号EP 200,280(出版日为1986年12月10日)；欧洲专利公开号EP 118,617，上述所有专利和专利申请都已完整纳入本文作为参考。
在某些专利申请中，基因分型的对象是患有免疫障碍特别是癌症的患者，以便于确定能与抗肿瘤单克隆抗体联合使用的适宜辅助治疗药措施(如单独的IL-2免疫治疗)。如本文所述的基因分型有助于设计治疗方案的肿瘤包括而不限于下文所列的B细胞淋巴瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、黑色素瘤、肾细胞癌、急性髓细胞样白血病(AML)以及慢性淋巴细胞性白血病(CCL)。
实施例下文描述的是用于实现本发明的特殊实施方式的实施例。实施例的提供只是为了说明的目的，并不意味着以任何方式限定本发明的范围。
我们已作了大量努力来确保所使用数据(如数量、温度等)的准确性，但是某些试验误差和偏差也是允许存在的。
在下面的实施例中，所用的酶是购买的，按照厂家的说明书来使用。
在分离DNA片段时，除非特地指明，所有的DNA操作都是按照标准程序进行。参见Sambrook等，同上。限制性内切酶、T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶I、Klenow片段以及其他生物试剂也都是购买的，并且按照厂家的说明书来使用。双链DNA片段在琼脂糖凝胶上分离。
实施例1从样品中提取DNA全血样品来自患者。按照厂家的说明书将样品收集于PreAnalytiX′s PAXgeneTMBlood DNA Tubes(Qiagen Inc.，产品编号为#769989)。按照厂家的说明书利用PreAnalytiX′s PAXgeneTMBlood DNA Kit(Qiagen Inc)从全血中分离基因组DNA。
实施例2基于PCR的基因分型A.PCR扩增PCR试验按如下步骤进行。简言之，PCR在96孔板上进行，仪器为GeneAmp PCRSystem 9600 Perkin Elmer(Perkin Elmer，Boston，MA)。
主混合物制备方法如下。在1.5ml Eppendorf管中加入如下试剂作为主混合物300μl 10×Stoffel Buffer(Applied Biosystems)；600μl 25mM MgCl2溶液；300μl dNTP混合液(Applied Biosystems，产品编号为#0032 003.109)；以及270μl水，于-20℃储存。所有的缓冲液都按照厂家的说明储存。
取出含有主混合物的试管使液体融化，加入30μl AmpliTaq DNA PolymeraseStoffel Fragment(Applied Biosystems，产品编号为#N808-0038)。试管内加入不同的引物组合(如6管)，每个试管含9μl正向引物、9μl反向引物、225μl主混合物和117μl水。
如图9所述，每个管中的液体加入到96孔板的两列孔中，每孔20μl(如，对于6种引物组合来说，每种组合占2列，每列8个孔)。按实施例1所描述的方法分离的基因组DNA稀释到10ng/μl，在含不同引物组合的孔中分别加入5μl基因组DNA(如，如果有6种不同的引物组合则加入到1-6列中，图10)。96孔板中也包括对照。
封上培养板，然后置于GeneAnp PCR system 9600中进行PCR。PCR条件为在95℃孵育5分钟，1个循环；在94℃孵育循环30秒，64℃孵育30秒，在72℃孵育30秒，共35个循环；在72℃孵育8分钟，1个循环。在将样品加到琼脂糖凝胶上之前将96孔板冷却到4℃。
B.电泳利用标准技术对A部分的PCR产物进行TAE凝胶电泳。50×浓缩的凝胶缓冲液储存液(终浓度为40mM Tris-Acetate，1mM Na2EDTA，pH 8.0)含有242g Tris碱；57.1ml冰醋酸；100ml 0.5M Na2EDTA。凝胶加样缓冲液含0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯蓝FF和15％Ficoll(400型；Pharmacia)，溶于水中。还使用购自BoehringerMannheim(产品编号为#1498037)的分子量标记(0.07-12.2kbp)。
在TAE缓冲液中制备含10μg/ml溴化乙啶的标准4％琼脂糖水平凝胶。每5μlPCR反应液混合1μl标准的6×加样缓冲液，加到相邻的凝胶的中，顺序为反应1到反应6，见图5。凝胶在100伏特的恒定电压下电泳15-20分钟，用标准的紫外透视灯在紫外灯下观察凝胶并拍照。
典型的结果显示在图5中。这些结果表明在位置158上FCGR3A是多态性的缬氨酸(V158)或苯丙氨酸(F158)。FCGR3B在这个位置上是非多态性的，只编码缬氨酸。利用本文所描述的引物可对FCGR3A 158V/F位点进行基因分型，这些引物有鉴定该位点的引物(如SEQ ID NOs1-2)以及非特异性引物(SEQ ID NO4)和能鉴定A基因和B基因之间在位置531上单个核苷酸差异的引物(SEQ ID NOs3和5)。位置531不会导致氨基酸的差异。
如上所述，利用5′引物C(SEQ ID NO5)和3′引物C(SEQ ID NO2)所得到的PCR产物证明是V基因型。如果一个个体的样品可以观察到这个产物，而利用5′引物C(SEQ ID NO5)和3’引物A(SEQ ID NO1)所得到的PCR产物看不到，则这个结果说明该个体是V纯合的。参见图5B。同样，如果利用5′引物C(SEQ ID NO5)和3’引物A(SEQ ID NO1)所得到的PCR产物是可以看到的，而利用5′引物C(SEQ IDNO5)和3’引物C(SEQ ID NO2)所得到的PCR产物看不到，则这个个体在A基因上是F纯合的。参见图5A和5D。如果这两个反应的产物都可以看到则说明该个体是F和V杂合的。参见图5C。反应还需要内部对照的存在，因为B基因不是多态性的，并且5’引物T和3’引物A应该不会产生可见的产物。
因此，利用本文所描述的方法可以精确地确定158F/V多态性的FcγRIIIa基因型。
实施例5PCR测序对于基因分型来说，需要进行的试验还有扩增样品DNA(PCR)和利用本文所述的寡核苷酸引物对扩增产物进行测序。
A.PCR基因组DNA的PCR利用BD AdvantageTM2PCR试剂盒(产品编号为#639206或#639207)根据厂家的说明书进行。每个反应含5μl 10×BD Advantage 2PCR Buffer；1μl 5uM/每个引物混合(引物总浓度为10uM)；1μl 50×dNTP Mix(每种10mM)；1μl50×BD Advantage 2 Polymerase Mix；终浓度为10-100ng的样品DNA；以及一定体积的水使反应混合物的最终体积为50μl。循环条件是95℃5分钟；95℃30秒，62℃30秒，72℃40秒，30个循环；然后在4℃孵育。循环完成后利用Qiagen的MinElutePCR纯化试剂盒(产品编号为28004或28006)纯化PCR反应产物，按照厂家推荐的说明书操作，只是最终的洗脱体积为50μl。
试验中还包括对照。阳性对照是已知FcγRIII基因型的基因组DNA(例如，A基因在158VF多态性上是G、T、和G/T)，而阴性对照一般包含除基因组DNA之外的所有试剂(该反应将产生阴性PCR和测序结果)。
B.测序对按上述方法进行PCR所得到的产物进行测序可利用BigDye terminator v3.0在3100或3730x1平台(Applied Biosystems)上进行。每个测序反应包含2μl BigDyeTerminator v3.0 Ready反应混合物(产品编号4390246)、1μl 5×Buffer(产品编号4336699)、1μl PCR产物(约0.02μl/μg)、2μl 2μM引物(SEQ ID NOs12-19的各种组合)和4μl水。
每个反应都进行30个循环95℃10秒；50℃5秒；和60℃3分钟。循环完成后反应液在4℃孵育。
通过将45μl来自于Amersham的干燥的Sephadex G-75 Resin(产品编号为#17-0051-01或17-0052-03)加入到含multiscreen Column Loader(Millipore产品编号#MCLO9645)的干燥过滤板(Millipore产品编号#MAHV N45 10)中来纯化反应产物。随后每个孔内加入300μl水，将板盖住，在室温下至少孵育30分钟。
过滤板上叠加一个96孔微滴定板(Nunc产品编号#12565263)，在具有A-4-62悬桶式转子的Eppendorf Model 581OR上以1650RPM的速度旋转3分钟。然后将过滤板放在干净的96孔PCR板(Sorenson Bioscience Inc.，产品编号#12565263或类似产品)和96孔基座(Applied Biosystems，产品编号为#N801-0531)上。所有样品都转移到过滤柱中央，在具有A-4-62悬桶式转子的Eppendorf Model 5810R上以1800 RPM的速度旋转5分钟。用高压灭菌的无菌纯化水将样品的终体积调整到约15μl。
然后按照说明书(3100使用手册或3730x1使用手册)将板组装起来。设定的参数为3100平台以POP6为分离介质，默认模式为“StdSeq50_POP6”，3739平台以POP7为分离介质，默认模式为“LongSeq50_POP7_1”。默认模式的运行时间为6500秒(3100平台)和5640秒(3730平台)。对于少于约300个碱基的靶核酸来说，如果在同一次运行中没有较长阅读长度的其他样品，默认模式的运行时间可以缩短到4000秒(3100平台)和3600秒(3730平台)。
C.分析测序数据转移到台式计算机上并导入到SequencerTM程序。每个个体样品的FCGR3A特异性引物序列(表1和图8)都与参考序列(图11)排列对比。每个个体样品的FCGR3B特异性引物序列和PCR反应中所使用的引物序列也都与参考序列(图11)排列对此。超过参考序列的序列在编辑时删除。
随后，按如下方法进行基因分型。如果位置121、153、179和313上分别出现A、C、T和/或C(位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的)，则反应被认为是非A基因特异性的，需要重复。如果这些位置上的信号只和A基因的参考序列信号相匹配，那么样品被认为是FCGR3A，要进一步分析位置207(位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的，在cDNA上为位置559)上的信号。如果位置207上的信号只有G，那么该个体是158VV纯合化的。如果位置207上的信号只有T，那么该个体是158FF纯合的。如果位置207上的信号为G和T，那么该个体是158VF杂合的。
同样，FcγRIIIb基因型按如下规则确定。如果位置121、153、179和313上分别出现G、T、C、A信号(位置编号是相对于外显子4的第一个碱基而言的)，则反应被认为是非B基因特异性的，需要重复。如果这些位置上的信号只和B基因的参考序列信号相匹配，那么样品被认为是FCGR3B。被确定为B基因的样品不具有158VF多态性，在相应的核苷酸位置上为G信号。
如本文所述，共检测了136个样品，其中135个的FcγRIII基因型被精确确定。一种情况是样品不含B基因。在受试者基因组不含A基因或B基因的情况下，需要利用PCR引物进行测序。利用PCR引物测序可以使我们根据A基因和B基因121、153、179、313位置上的信号来估计FCGR3A和FCGR3B基因的比例。
基因分型分析的结果总结在图6中，并且与Koene等(同上)所描述的方法作了比较。本文所描述的PCR-测序方法确定了所有80个样品的基因型，而上面所述的方法误差率超过10％(10个样品)。
因此，PCR-测序方法是高灵敏度的，能够精确确定FcgRIII基因型。
相应的，本文描述了新型序列以及利用这些序列进行基因分型的方法。从上面所描述的内容中可以看出，虽然本文为了说明的目的描述了本发明的特殊实施方式，但是应当肯定的是，在不背离本发明精神和范围的情况下可以对本发明作出各种修改。
权利要求
1.一种包含长度为10-60个核苷酸的核苷酸序列的分离的寡核苷酸，该核苷酸序列包含(a)选自SEQ ED NO1-19的序列；(b)与(a)的核苷酸序列有80％序列相同性的核苷酸序列；或者(c)(a)和(b)的互补序列。
2.如权利要求1所述的分离的寡核苷酸，其还包含可检测标记。
3.如权利要求2所述的分离的寡核苷酸，其特征在于，所述可检测标记是荧光标记。
4.如权利要求3所述的分离的寡核苷酸，其特征在于，所述荧光标记选自6-羧基荧光素(6-FAM)、四甲基罗丹明(TAMRA)和2’，4’，5’，7’，-四氯-4-7-二氯荧光素(TET)。
5.一种确定受试者FcγRIII基因型的方法，该方法包括如下步骤(a)从得自受试者的生物样品中分离核酸；(b)利用权利要求1-4中任一项所述寡核苷酸的至少第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸；以及(c)检测利用每一种寡核苷酸组合扩增后是否存在扩增的核酸，其中是否存在扩增的核酸预示着受试者的FcγRIII基因型。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，至少有一种寡核苷酸是FcγRIII多态性特异性的。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，至少有一种寡核苷酸对于至少一种FcγRIII多态性是通用的。
8.如权利要求5所述的方法，该方法还包括利用再一种其他寡核苷酸引物组合来重复步骤(b)和(c)。
9.如权利要求5-8中任一项所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸的第一组合和第二组合都包含一种通用引物。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，FcγRIIIa第158V/F位的基因型被确定。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物的第一组合包含SEQ ID NO5和SEQ ID NO2。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述寡核苷酸引物的第二组合包含SEQ ID NO5和SEQ ID NO1。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增存在扩增产物，而利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增不存在扩增产物，说明是158VV基因型。
14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增不存在扩增产物，而利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增存在扩增产物，说明是158FF基因型。
15.如权利要求12所述的方法，其特征在于，利用寡核苷酸引物的第一组合进行的扩增存在扩增产物，利用寡核苷酸引物的第二组合进行的扩增也存在扩增产物，说明是158FV基因型。
16.如权利要求5-10中任一项所述的方法，其特征在于，受试者其他核苷酸位置的FcRIII基因型被确定。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述其他核苷酸位置选自位置121、153、179、207、313及其组合。
18.如权利要求5-17中任一项所述的方法，其特征在于，所述核酸通过PCR、RT-PCR、转录介导的扩增(TMA)、TaqManTM及其组合扩增。
19.一种确定受试者FcγRIII基因型的方法，该方法包括如下步骤(a)从得自受试者的生物样品中分离核酸；(b)扩增分离的核酸；(c)利用权利要求1-4中任一项所述寡核苷酸的至少一种合适的组合作为测序引物对扩增的核酸产物进行测序；以及(d)确定一种或多种FcγRIII多态性上的核苷酸残基，从而确定受试者的FcγRIII基因型。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括至少利用权利要求1所述寡核苷酸的第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，FcγRIIIa第158V/F位的基因型通过确定位置207上的核苷酸来确定。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在位置207上只有核苷酸G说明是158VV基因型。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在位置207上只有核苷酸T说明是158FF基因型。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，在位置207上有核苷酸G和T说明是158FV基因型。
25.一种区分FcγRIIIa和FcγRIIIb的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)利用权利要求1-4中任一项所述寡核苷酸的至少第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸，其中每一组合中的至少一种寡核苷酸引物是FcγRIIIa或FcγRIIIb特异性的；以及(c)利用每一种寡核苷酸组合检测是否存在扩增的核酸，其中扩增的寡核苷酸是否存在是FcγRIIIa和FcγRIIIb的区别。
26.一种区分FcγRIIIa和FcγRIIIb的方法，该方法包括如下步骤(a)从来自于受试者的生物样品中分离核酸；(b)扩增分离的核酸；(c)利用权利要求1-4中任一项所述寡核苷酸的至少一个合适组合作为测序引物对扩增出的核酸进行测序；以及(d)确定121、153、179和313位上的核苷酸，从而区分FcγRIIIa和FcγRIIIb。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，步骤(b)包括利用权利要求1-4中任一项所述寡核苷酸的至少第一和第二组合作为正义和反义引物扩增分离的核酸。
28.一种用于FcγRIIIa基因分型的试剂盒，该试剂盒包含一对或多对如权利要求1-4所述的寡核苷酸引物对；以及对生物样品进行FcγRIIIa基因分型的文字说明书。
29.如权利要求28所述的试剂盒，该试剂盒还包含测序引物。
全文摘要
本发明提供了FcγRIII多态性的特异性寡核苷酸。本发明还提供了以核酸为基础的基因分型方法，该方法利用本文所描述的寡核苷酸作为扩增和/或测序引物。
文档编号A61K38/17GK1976942SQ200480042843
公开日2007年6月6日 申请日期2004年12月22日 优先权日2004年4月7日
发明者P·G·加西亚, S·E·威尔逊, G·G·张 申请人:希龙公司