专利名称：单唾液酸四己糖神经节苷脂固体脂质纳米粒及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种单唾液酸四己糖神经节苷脂药物制剂，尤其涉及一种单唾液酸四己糖神经节苷脂纳米制剂及其制备方法。
背景技术：
单唾液酸四己糖神经节苷脂(Monosialotetrahexosylganglioside，GM1)是含唾液酸的糖神经鞘脂，是哺乳动物细胞膜的组成成分，对细胞的分化、生长、轴浆运输和再生均起到重要的生理作用，其分子是由一个疏水的神经酰胺部分和亲水的唾液酸寡糖基团组成，分子量为1574道尔顿。GM1具有促进神经重构，加速神经细胞修复；促进神经再生，促进神经轴突生长和突触形成；恢复神经支配功能，改善神经传导，促进脑电活动及其他神经电生理指标的恢复；保护脑细胞膜，促进细胞膜各种酶活性恢复等功能。
目前，GM1在临床上已被广泛用于治疗各种创伤性和心脑血管疾病的神经损伤，各种慢性病后期的神经功能障碍、脑萎缩、阿尔兹海默病、智力障碍等。
外源性GM1具有脂溶性，试验证明进入体内后可以穿过血脑屏障，聚集于受损脑区，嵌入细胞膜内，模仿内源性GM1的功能发挥作用。外源性GM1一般从牛脑或猪脑中提取获得，临床目前应用的为进口注射水针剂型。虽然GM1可以进入脑组织，但是通过对GM1的药物动力学研究证明，外源性GM1注射到动物体内后，大量聚集在肝内，仅有20％进入脑、脊髓、肾脏等脏器，并且血清半衰期较短，进入体内的药物仅有少量发挥作用，使用效率低，在临床上为了达到治疗效果通常用量较大。
中国专利申请00133077.2公开了从动物脑组织中分离纯化高纯度的GM1的工艺方法。该方法主要包括用有机溶剂混合物提取总神经节苷脂，酸水解总神经节苷脂，离子交换柱层析，反相柱层析等四步，所得GM1纯度大于98％。由于GM1已用于临床治疗中枢神经损伤疾病。故本发明所述GM1的制备方法适合于规模化生产。
中国专利ZL02111387.4公开了一种制备GM1制剂的方法。本发明结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads及DEAE Sephadex A-25柱层析，或结合使用超滤膜分离技术、Iatrobeads柱层析、高效液相色谱层析技术，从猪脑中提取、纯化神经节苷脂GM1，纯度达95％以上。本发明减少了传统萃取、纯化方法的环节，降低成本及有害有机溶剂的使用量，制剂过程中保留了神经节苷脂GM1两亲性理化特征，制备过程简单、环保、低成本化，并能提高神经节苷脂GM1制剂的疗效。
中国专利ZL 01132052.4发明涉及GM1的制备方法。本发明采用短杆菌属(Brevibacterium sp.)QL-1株，通过微生物转化方法，将神经节苷脂提取物中的其它组份发酵分解转化成GM1，提供了一种收率高，成本低的GM1的制备方法。
中国专利申请200410018280.5公开了一种GM1的制备方法。本发明制备GM1的发酵菌种为厄菌属(Oerskovia sp.)，溶黄嘌呤厄菌(Oerskoviaxanthineolytica)，是从土壤中自然筛选得到的野生菌株，对无GM1神经节苷脂底物的转化率可以达到60％。诱变菌株交中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC M204032。本发明通过微生物转化方法，将神经节苷脂提取物中的其它组份发酵转化成GM1，较现有方法提取率提高100％。该方法操作简便、成本低廉，为GM1大规模生产提供了可能。
固体脂质纳米粒(solid lipid nanoparticle，SLN)是近年正在发展的一种新型毫微粒类给药系统，是指以生物相容的高熔点脂质为骨架材料制成的纳米球，以固态的天然或合成类脂将药物包裹于类脂核中制成粒径为50～1000nm的固体胶粒给药体系。由于骨架材料在室温时是固体，故SLN既具有聚合物纳米球的物理稳定性高，药物泄漏少、缓释性好，性质稳定，制备简便的特点，又兼有脂质体毒性低、易于大规模生产的优点。常用的高熔点脂质有饱和脂肪酸甘油酯、硬脂酸、混合脂质等。SLN与以磷脂为主要成分的脂质体双分子层结构不同，是由多种类脂材料形成的固体颗粒，其同时具有一定的缓释作用，可以作为靶向定位和控释作用的载体。SLN为一种在药学领域展现出很好应用前景的药物载体，并且已经应用于临床。
中国专利申请03101154.3公开了GM1脂质体复合物制剂的组份、制备工艺和应用。在该发明中，所述脂质体复合物是由胆固醇、磷脂和GM1按比例组成。经实验证明脂质体形式的GM1能显著提高体内生物利用度，能快速地进入脑组织中，更有效地治疗急慢性中枢神经损伤。但进一步提高GM1的生物利用度和制剂稳定性，尤其是提高对特定部位的靶向作用仍然是GM1剂型研究需要解决的问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种GM1固体脂质纳米粒，其可以增加GM1的稳定性，提高生物利用度，减少临床使用剂量。本发明提供的GM1固体脂质纳米粒与脂质体相比，具有较好的稳定性。
本发明的另一个目的在于提供该GM1固体脂质纳米粒的制备方法。
本发明的还一个目的在于提供包含GM1固体脂质纳米粒的药物制剂。
根据本发明的一个目的，本发明提供了一种GM1固体脂质纳米粒，其包含单唾液酸四己糖神经节苷脂和可药用的磷脂、脂质材料、乳化剂；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～10∶0.2～50∶1～30∶0.5～80；所述脂质材料为在常温下保持固态，且具有生物相容性的脂质材料。
所述脂质材料为高熔点且具生物相容性，可以在常温下保持固态。当脂质材料为一种室温下为液相的材料时，最终所制得的纳米制剂为纳米乳液；当脂质材料为一种室温下为固相的材料时，最终所制得的纳米制剂为固体脂质纳米粒；当脂质材料为多种材料的混合物时，最终所制得的纳米制剂为纳米结构脂质载体。
优选的，所述脂质材料为12个碳链以上的脂肪酸、脂肪酸甘油酯、类固醇、某些蜡类中的一种或多种。
所述12个碳链以上的脂肪酸可为选自硬脂酸、棕榈酸、二十二碳烷酸、豆蔻酸等的一种或多种；所述脂肪酸甘油酯可为选自单硬脂酸甘油酯、三硬酸甘油酯等的一种或多种；所述类固醇可为胆固醇等，所述蜡类可为选自鲸蜡醇棕榈酸酯、蜂蜡等的一种或多种。
优选的，所述GM1、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～100.2～20∶1～30∶20～80。
优选的，所述GM1、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～8∶0.5～10∶1～15∶1～50。
优选的，所述GM1、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.5～8∶20～50∶2～30∶20～50。
优选的，所述GM1、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～10∶0.2～20∶10～30∶50～80。
更优选的，所述GM1、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～2.5∶1.5～3∶1～5∶3～25，如0.1∶2∶1∶3，0.1∶1.5∶2∶6，1∶3∶5∶25，2.5∶1.5∶1.3∶20等。
所述磷脂可为选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰鞘磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二豆蔻酰磷脂酸等的一种或多种。
优选的，所述乳化剂为非离子型表面活性剂，例如吐温、司盘、硬脂酸聚烃氧酯、泊洛沙姆、去氢胆酸钠等。
优选的，所述GM1固体脂质纳米粒制剂还可进一步包括附加剂。所述附加剂可以为丙三醇、丙二醇、乙醇、甘露醇等的一种或多种。
磷脂、乳化剂、附加剂的作用是形成稳定的乳化剂膜以包裹药物和脂质材料，其中附加剂有时是可以省略的；脂质材料是作为GM1的载体材料。本发明所述附加剂是指起稳定作用和/或辅助乳化作用的制剂辅料，亦可称作稳定剂或者辅助乳化剂，同时在制剂中可以作为赋形剂。
不同的药物成分或组分，需要选用相应的脂质材料作为药物载体，而含不同药物的载体，需要筛选合适的磷脂、乳化剂、附加剂种类，尤其是磷脂、乳化剂、附加剂与脂质材料的比例，是形成稳定GM1固体脂质纳米粒的基础。
根据本发明的另一个目的，本发明提供了所述GM1固体脂质纳米粒的制备方法，其可以采用现有技术中已有的各种制备固体脂质纳米粒的常规方法，例如溶剂乳化法、高压乳匀法、薄膜超声分散法、高速匀浆法、微乳稀释法等一所述制备方法可以为溶剂乳化法，包括下述步骤将GM1、脂质材料、磷脂溶于有机溶剂构成有机相；将乳化剂溶于水中构成水相；
所述有机相和水相分别加热至相同温度，在搅拌条件下将有机相注入水相中，形成透明体系；将所述透明体系减压除去有机溶剂进行浓缩，然后混于0～2℃水相中搅拌降温，形成固体脂质纳米粒的混悬液。
优选的，所述有机溶剂为氯仿、甲醇等。
优选制备处方如下原料 重量百分比GM1 0.5～8％磷脂 20～50％脂质材料 2～30％乳化剂20～50％所述制备方法也可以为高压乳匀法，包括下述步骤分别称取一定量的脂质材料和乳化剂，混合后加热到60～80℃，得到液态油相；将一定量GM1加入到制得的液态油相中，搅拌至呈均匀澄清状态；然后加入到一定量的同温度的双蒸水中，采用高压乳匀机在200～500个大气压下，经2～5个循环，冷却后即得GM1固体脂质纳米粒混悬液。
优选制备处方如下原料重量百分比GM1 0.1～10％磷脂0.2～20％脂质材料10～30％乳化剂 50～80％根据本发明的还一个方面，本发明提供了一种治疗神经损伤的药物制剂，其包含治疗有效量的上述GM1固体脂质纳米粒和药学上可接受的载体、赋形剂和/或保护剂。
在所述药物制剂中还可进一步添加其它可以与GM1在治疗神经损伤方面起协同作用的药物，如二氢吡啶类钙离子拮抗剂等，以制成复方制剂。、所述药物制剂可以为注射用冻干粉针剂、口服肠溶制剂、喷雾剂、注射液等，其可以采用本领域常规制剂方法制备得到。
当所述药物制剂为注射用冻干粉针剂时，制备方法可以为将经上述方法之一获得的GM1固体脂质纳米粒混悬液加入一定比例的赋性剂，分装于2ml、5ml西林瓶中，规格分别为20mg、100mg，置于冷冻干燥机中-40℃预冷，设定合适的冻干程序，观察冻干过程中的状态，直到获得白色疏松状粉末。
冻干粉针剂中添加的赋形剂为甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸等的一种或多种。所述冻干粉针剂的单位剂量可以为20～100mg。
当所述药物制剂为口服肠溶制剂时，制备方法可以为将经上述方法之一获得的GM1固体脂质纳米粒混悬液加入一定比例的保护剂，置于冷冻干燥机中-40℃预冷，设定合适的冻干程序，观察冻干过程中的状态，直到获得白色疏松状粉末，该粉末即为制作GM1胶囊剂的中间体，依据含量测定结果，称取适量冻干的GM1固体脂质纳米粒，加入一定比例医用淀粉，混匀过筛后装入肠溶胶囊。
制备胶囊的冻干粉中添加的保护剂为蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇等的一种或多种。所述口服肠溶制剂的单位剂量可以为20～100mg，优选为20～40mg。
形态学考察结果表明，所述纳米粒呈球形，分散状态良好，算术平均径为80～140nm。
包封率考察结果表明，所述纳米粒的包封率为85％以上。
外观及稳定性观察结果表明，所述GM1固体脂质纳米粒为乳白色混悬液，放置于室温6个月后，外观无变化；然后进行常温高速离心5000rpm，10min，无沉淀和分层现象发生。而中国专利申请03101154.3公开的GM1脂质体为乳白色胶体溶液或乳白色溶液，稳定性试验表明，4℃冷藏3个月后，高速离心10min无沉淀和分层发生。因此，本发明的GM1固体脂质纳米粒与脂质体相比，具有更好的稳定性。
相对于普通脂质体制剂，本发明提供的GM1固体脂质纳米粒包封率高，平均粒径更小，吸收快，透过各种生物膜的速度快，药物发挥作用的面积大，药物在体内停留的时间长，增加GM1的生物利用度，减少临床用药剂量和毒副作用；可以改变药物的体内过程，增加对神经组织的趋靶性，提高药物的治疗指数；同时对于这种纳米尺寸范围内的微粒具有较小的抗原性，因而在体内使用具有较好的安全性。
为了更好地理解本发明的本质，下面通过对本发明较佳实施方式的描述，详细说明但不限制本发明。
具体实施例方式
本发明所用试验材料，如无特别说明，均为市售购买产品。
本发明所用GM1可以按照现有技术文献中公开的方法进行制备，或者从商业途径购买得到。
GM1固体脂质纳米粒的制备实施例1溶剂乳化法将10mg GM1和100mg硬脂酸溶于氯仿中，200mg大豆卵磷脂溶于适量乙醇中，两部分混合即成有机相，水浴加热至75℃。将300mg泊洛沙姆F-68溶于双蒸水，即为水相，该水相放在搅拌加热套上，加入磁子进行搅拌并加热至75℃，保持恒温。用胶头滴管将有机相逐滴加入水相中，恒温搅拌至形成透明体系。将该体系转入旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂，并浓缩至1/2体积。将浓缩液快速加入0℃水相中，快速搅拌降温2个小时，形成固体脂质纳米粒的混悬液。
实施例2溶剂乳化法将10mg GM1和200mg硬脂酸溶于氯仿中，150mg大豆卵磷脂溶于适量乙醇中，两部分混合即成有机相，水浴加热至75℃。将600mg泊洛沙姆F-68溶于双蒸水，即为水相，该水相放在搅拌加热套上，加入磁子进行搅拌并加热至75℃，保持恒温。用胶头滴管将有机相逐滴加入水相中，恒温搅拌至形成透明体系。将该体系转入旋转蒸发仪减压蒸发除去有机溶剂，并浓缩至1/2体积。将浓缩液快速加入0℃水相中，快速搅拌降温2个小时，形成固体脂质纳米粒的混悬液。
实施例3高压乳匀法称取500mg硬脂酸、300mg大豆卵磷脂，加热到75℃，充分搅拌混匀获得液态油相。称取100mg GM1加入到液态油相中，充分搅拌至澄清均匀。称取2500mg硬脂酸聚烃氧酯S-40，加入100ml双蒸水，置搅拌加热套上加热并恒温于75℃即为水相。用胶头滴管将75℃的含GM1的澄清溶液逐滴加入到水相中，同时采用磁子进行搅拌。混合均匀后采用高压乳匀机乳化5分钟，冷却至室温即得GM1的固体脂质纳米粒。
实施例4高压乳匀法称取130mg硬脂酸、150mg大豆卵磷脂，加热到75℃，充分搅拌混匀获得液态油相。称取250mg GM1加入到液态油相中，充分搅拌至澄清均匀。称取2000mg硬脂酸聚烃氧酯S-40，加入100ml双蒸水，置搅拌加热套上加热并恒温于75℃即为水相。用胶头滴管将75℃的含GM1的澄清溶液逐滴加入到水相中，同时采用磁子进行搅拌。混合均匀后采用高压乳匀机乳化5分钟，冷却至室温即得GM1的固体脂质纳米粒。
GM1固体脂质纳米粒制剂的制备实施例5注射用冻干粉针剂将经实施例1、2、3或4获得的GM1固体脂质纳米粒混悬液1000ml加入一定质量的甘露醇使其终浓度为3％，分装于2ml、5ml西林瓶中，规格分别为20mg、100mg，置于冷冻干燥机中-40℃预冷，设定冻干程序，观察冻干过程中的状态，直到获得白色疏松状粉末。
实施例6口服肠溶制剂将经实施例1、2、3或4获得的GM1固体脂质纳米粒混悬液1000ml加入30g蔗糖，置于冷冻干燥机中-40℃预冷，设定合适的冻干程序，观察冻干过程中的状态，直到获得白色疏松状粉末，该粉末即为制作GM1胶囊剂的中间体，依据含量测定结果，称取适量冻干的GM1固体脂质纳米粒，加入医用淀粉使其终浓度为5％，混匀过100目筛后装入肠溶胶囊，规格分别为20mg、40mg。
GM1固体脂质纳米粒性质考察实施例7纳米粒外观及稳定性观察制得的GM1固体脂质纳米粒为乳白色混悬液。分别取经实施例1、2、3或4获得的GM1固体脂质纳米粒及空白的SLN混悬液样本各10份，其中5份放置于室温，另外5份放置于4℃冰箱内，放置24小时、1个月、3个月、6个月观察其外观，发现无外观变化；然后进行常温高速离心4000rpm、5000rpm、10000rpm、15000rpm离心10min，无沉淀和分层现象发生。
实施例8纳米粒形态学考察分别取经实施例1、2、3或4制得的GM1固体脂质纳米粒混悬液适量，加双蒸水稀释，然后滴加在覆盖碳膜的铜网上，以2％的磷钨酸钠液负染，在透射电镜下照片。照片显示，纳米粒呈球形，分散状态良好，算术平均粒径分别为108nm(实施例1)，102nm(实施例2)，90nm(实施例3)，95nm(实施例4)。
实施例9纳米粒包封率考察分别取经实施例1、2、3或4制得的GM1固体脂质纳米粒混悬液适量置离心管中，100000rpm离心15min，吸取上清，用蒸馏水补足体积，再次100000rpm离心15min，吸取上清。合并两次上清，用HPLC法测定其中GM1含量，按下式计算包封率分别为87.31％(实施例1)和92.28％(实施例2)、88.66％(实施例3)和89.02％(实施例4) 以上对本发明较佳实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
权利要求
1.一种单唾液酸四己糖神经节苷脂固体脂质纳米粒，其特征在于，包含单唾液酸四己糖神经节苷脂和可药用的磷脂、脂质材料、乳化剂；所述单唾液酸四己糖神经节苷脂、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～10∶0.2～50∶1～30∶0.5～80；所述脂质材料为在常温下保持固态，且具有生物相容性的脂质材料。
2.权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述单唾液酸四己糖神经节苷脂、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～10∶0.2～20∶1～30∶20～80。
3.权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述单唾液酸四己糖神经节苷脂、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～8∶0.5～10∶1～15∶1～50。
4.权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述固体脂质纳米粒进一步包括附加剂，所述附加剂为选自丙三醇、丙二醇、乙醇、甘露醇中的一种或多种。
5.权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述脂质材料为选自硬脂酸、棕榈酸、二十二碳烷酸、豆蔻酸、单硬脂酸甘油酯、三硬酸甘油酯、胆固醇、鲸蜡醇棕榈酸酯、蜂蜡的一种或多种。
6.权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述磷脂为选自大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二月桂酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二豆蔻酰磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰鞘磷脂、1-硬脂酰-2-棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰甘油、二豆蔻酰磷脂酸的一种或多种。
7.权利要求1所述的固体脂质纳米粒，其特征在于，所述乳化剂为非离子型表面活性剂。
8.权利要求1所述固体脂质纳米粒的制备方法，包括下述步骤将单唾液酸四己糖神经节苷脂、脂质材料、磷脂溶于有机溶剂构成有机相；将乳化剂溶于水中构成水相；所述有机相和水相分别加热至相同温度，在搅拌条件下将有机相注入水相中，形成透明体系；将所述透明体系减压除去有机溶剂进行浓缩，然后混于0～2℃水相中搅拌降温，形成固体脂质纳米粒的混悬液。
9.权利要求1所述固体脂质纳米粒的制备方法，包括下述步骤分别称取脂质材料和乳化剂，混合后加热到60～80℃，得到液态油相；将单唾液酸四己糖神经节苷脂加入到制得的液态油相中，搅拌至呈均匀澄清状态；然后加入到一定量的同温度的双蒸水中，采用高压乳匀机在200～500个大气压下，经2～5个循环，冷却后即得GM1固体脂质纳米粒混悬液。
10.一种治疗神经损伤的药物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的单唾液酸四己糖神经节苷脂固体脂质纳米粒和药学上可接受的载体、赋形剂和/或保护剂。
11.权利要求10所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂为注射用冻干粉针剂或口服肠溶制剂。
12.权利要求11所述的药物制剂，其特征在于，当药物制剂为注射用冻干粉针剂时，所述赋形剂为甘露醇、右旋糖酐、甘氨酸中的一种或多种；当药物制剂为口服肠溶制剂时，所述保护剂为蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖、山梨醇中的一种或多种。
全文摘要
本发明公开了一种单唾液酸四己糖神经节苷脂(GM1)固体脂质纳米粒及其制备方法，所述固体脂质纳米粒包含GM1和可药用的磷脂、脂质材料、乳化剂，GM1、磷脂、脂质材料、乳化剂的重量比依次为0.1～10∶0.2～50∶1～30∶0.5～80；所述脂质材料为12个碳链以上的脂肪酸、植物油、脂肪酸甘油酯、类固醇、某些蜡类中的一种或多种。所述GM1固体脂质纳米粒与脂质体相比，可以提高药物稳定性，增加GM1的生物利用度，减少临床用药剂量。
文档编号A61P25/00GK1939315SQ20051008653
公开日2007年4月4日 申请日期2005年9月28日 优先权日2005年9月28日
发明者马骉, 张宁, 姜桂荣, 薛印革, 宋梦薇 申请人:北京赛生药业有限公司