喹唑啉衍生物、其制备方法及其作为抗有丝分裂剂的用途以及包含所述衍生物的药物组合物的制作方法

专利名称：喹唑啉衍生物、其制备方法及其作为抗有丝分裂剂的用途以及包含所述衍生物的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及喹唑啉衍生物、其制备方法、包含所述的喹唑啉衍生物的药物组合物以及所述的喹唑啉衍生物作为抗有丝分裂剂从而用于治疗疾病诸如癌症的用途。
干扰有丝分裂的抗癌药例如长春花属生物碱类、紫杉醇和埃坡霉素在恶性疾病的治疗中起着主要作用。它们的主要缺点之一是它们均针对相同的蛋白质——微管蛋白，它是形成有丝分裂纺锤体的微管的亚单位。然而，微管还参与许多其它细胞过程诸如维持细胞器、细胞形状、细胞活力、突触泡和细胞内的转运现象。干扰它们的形成或解聚经常导致剂量限制性的毒性副作用。
蛋白质的新种类、有丝分裂驱动蛋白的发现提供了一种治疗癌症的新方法。这些蛋白质专门涉及有丝分裂纺锤体的形成和功能，其中的一些蛋白质仅仅在增殖的细胞中表达。对它们的抑制作用导致细胞周期停止并最终导致细胞凋亡，但不会干扰其它的微管依赖型过程。
有丝分裂驱动蛋白Eg5(人驱动纺锤体蛋白(KSP)的南非有爪蟾蜍类似物)在有丝分裂的早期阶段起着重要作用。它介导中心体的分离和两极有丝分裂纺锤体的形成。对Eg5的抑制作用导致细胞周期在有丝分裂过程中停止，并且产生具有单极纺锤体的细胞，即所谓的monoasters。在1999年，通过对大量合成化合物的文库进行筛选，发现了第一种小分子的Eg5抑制剂monastrol，即4-(3-羟基苯基)-5-乙氧基羰基-6-甲基-3，4-二氢嘧啶-2(1H)(Mayer，T.U.，Kapoor，T.M.，Haggarty，S.J.，King，R.W.，Schreiber，S.L.和Mitchison，T.J.(1999)。Small Molecule Inhibitor of Mitotic SpindleBipolarity Identified in a Phenotype-Based Screen.Science 289，971-974)。Monastrol是有丝分裂驱动蛋白Eg5的变构抑制剂(Maliga，Z.，Kapoor，T.M.和Mitchison，T.J.(2002)。“Monastrol是有丝分裂驱动蛋白Eg5的变构抑制剂的证据”。Chemistry&Biology 9，989-996)，它的结合位点与蛋白质的核苷酸结合位点相距约12。在结合过程中，monastrol引起了整个运动结构域的局部以及远端的结构改变(Yan，Y.，Sardana，V.，Xu，B.，Homnick，C.，Halczenko，W.，Buser，C.A.，Schaber，M.，Hartman，G.D.，Huber，H.E.和Lawrence，C.K.(2004)。Inhibition of a Mitotic MotorProteinWhere，How and Conformational Consequences.J.Mol.Biol.335，547-554)。同时还公布了Eg5的四种其它抑制剂Terpendole E、S-三苯甲基-L-半胱氨酸、HR22C16和CK0106023，以及其它喹唑啉-4-酮衍生物(Nakazawa，J.，Yajima，J.，Usui，T.，Ueli，M.，Takatsuki，A.，Imoto，M.，Toyoshima，Y.Y.和Osada，H.(2003)。“Terpendole E对有丝分裂驱动蛋白Eg5的运动活性的新作用”。Chem.Biol.10，131-137；DeBonis，S.，Skoufias，D.A.，Lebeau，L.，Lopez，R.，Robin，G.，Margolis，R.L.，Wade，R.H.和Kozielski，F.(2004)。“具有抗有丝分裂和抗肿瘤活性的人有丝分裂驱动蛋白Eg5抑制剂的体外筛选”。Mol.Cancer.Ther.3，1079-1090)；Hotha，S.，Yarrow，J.C.，Yang，J.G.，Garrett，S.，Renduchintala，K.V.，Mayer，T.U.和Kapoor，T.M.(2003)。“HR22C16细胞分裂动力学的有效的小分子探针”。Angew.Chem.115，2481-2484；Sakowicz，R.，Finer，J.T.，Beraud，C.，Crompton，A.，Lewis，E.，Fritsch，A.，Lee，Y.，Mak，J.，Moody，R.，Turincio，R.，Chabala，J.C.，Gonzales，P.，Roth，S.，Weitman，S.和Wood，K.W.(2004)。“驱动蛋白抑制剂的抗肿瘤活性”。Cancer Res.64，3276-3280；WO-A 01/98278)。WO-A 02/078639描述了其它在结构上与Monastrol类似的Eg5抑制剂。
US 6,177,432 B1描述了抑制法尼基转移酶的喹唑啉酮化合物，据说它可用于抑制肿瘤生长。在其6-位上，所述的喹唑啉酮具有可进一步被苯基和咪唑基取代的甲基。
EP 0564397A1描述了作为制备5H-噻唑并[2，3-b]喹唑啉或喹唑啉的硫代烷基化衍生物的合成中间体的喹唑啉类化合物。
DD 251974A1描述了制备喹唑啉衍生物的方法。在其4-位上，这些喹唑啉化合物或者是未取代的，或者具有氯取代基。
Sabitha等人(Tetrahedron Letters 44(2003)6497-6499)提出了用于制备二氢嘧啶-(2H)-酮的氯化钒(III)催化剂的Biginelli缩合。
Moustafa等人(CA数据库[在线]Chemical Abstracts Service，Columbus，Ohio，US；数据库收录号1995782507)描述了烯酮的杂环化。其中提到了3，4，5，6，7，8-六氢-4-(3-羟基苯基)-2(1H)-喹唑啉酮。
Mayer等人(CA数据库[在线]Chemical Abstracts Service，Columbus，Ohio，US；数据库收录号1998454206)描述了4-芳基-4，6，7，8-四氢-1H，3H-喹唑啉-2，5-二酮的电子碰撞诱导的裂解。其中提到了4-(2-氟苯基)-4，6，7，8-四氢-2，5(1H，3H)-喹唑啉二酮。
Daqiang Xu等人(Tetrahedron Asymmetrie，Vol，7，pp.747-754，1996)描述了(R)-3-甲基-5-苯基-5H-噻唑并[2，3-b]喹唑啉的合成。3，4-二氢-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮被用作合成中间体。
本发明的目的是提供另外的可用作抗有丝分裂剂的化合物。
令人惊奇的是，现已发现某些喹唑啉衍生物是用于体外抑制Eg5以及用于使培养的细胞停止有丝分裂的有效的化合物。
因此，本发明涉及式(I)的喹唑啉衍生物或其可药用盐 其中R1表示苯基或6元杂芳基，它们任选地被1-5个相同或不同的选自下列的取代基所取代卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基；X 表示S或O；
A 与它们所连接的碳原子一起形成5-、6-或7-元的、部分不饱和的或芳香族的同素环或杂环，它们可带有最多10个相同或不同的选自下列的取代基卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代(thio)、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基和二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基。
按照一个具体的实施方案，以下化合物不包括在式(I)的喹唑啉衍生物中3，4-二氢-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-氯-3，4-二氢-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-甲基-3，4-二氢-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；7-甲基-3，4-二氢-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-氯-3，4-二氢-4-(2-氯苯基)-2(1H)-喹唑啉硫酮；3，4-二氢-4-(4-氯苯基)-2(1H)-喹唑啉硫酮；6-溴-3，4-二氢-4-(2-氟苯基)-2(1H)-喹唑啉硫酮；7-氯-3，4-二氢-4-苯基-2(1H)-喹唑啉硫酮；3，4，5，6，7，8-六氢-4-(3-羟基苯基)-2(1H)-喹唑啉酮；4，6，7，8-四氢-4-(2-氟苯基)-2，5(1H，3H)-喹唑啉二酮。
按照另一个具体的实施方案，以下化合物也不包括在式(I)的喹唑啉衍生物中7，7-二甲基-4-苯基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(4-甲氧基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(2-硝基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(4-氟苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮；
7，7-二甲基-4-(4-羟基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮；7，7-二甲基-4-(3-苯氧基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮。
按照另一个具体的实施方案，以下化合物也不包括在式(I)的喹唑啉衍生物中可通过氯化钒(III)催化的5，5-二甲基环己-1，3-二酮(二甲基环己二酮)与脲或硫脲和下列醛之一的Biginelli缩合得到的喹唑啉衍生物苯甲醛、4-甲氧基苯甲醛、4-氯苯甲醛、2-硝基苯甲醛、噻吩-2-醛、4-氟苯甲醛、4-羟基苯甲醛、3-苯氧基苯甲醛(参见Sabitha等人，(2003)，上文)。
在以上式(I)给出的符号定义中，使用通常表示以下取代基的集合术语卤素氟、氯、溴或碘；C1-C6-烷基和C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基、二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基的烷基部分含有1-6个碳原子、特别是1-4个碳原子的饱和直链或支链烃基，诸如甲基、乙基、丙基、1-甲基乙基、丁基、1-甲基丙基、2-甲基丙基、1，1-二甲基乙基或戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2，2-二-甲基丙基、1-乙基丙基、己基、1，1-二甲基丙基、1，2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、1，1-二甲基丁基、1，2-二甲基丁基、1，3-二甲基丁基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、3，3-二甲基丁基、1-乙基丁基、2-乙基丁基、1，1，2-三甲基丙基、1，2，2-三甲基丙基、1-乙基-1-甲基丙基和1-乙基-2-甲基丙基；C1-C6-卤代烷基和C1-C6-卤代烷氧基的卤代烷基部分含有1-6个碳原子、特别是1-4个碳原子的直链或支链烷基(如上所述)，其中这些基团中的氢原子可部分地或完全被如上所述的卤素原子所代替，例如C1-C2-卤代烷基、诸如氯甲基、溴甲基、二氯甲基、三氯甲基、氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、氯氟甲基、二氯氟甲基、氯二氟甲基、1-氯乙基、1-溴乙基、1-氟乙基、2-氟乙基、2，2-二氟乙基、2，2，2-三氟乙基、2-氯-2-氟乙基、2-氯-2，2-二氟乙基、2，2-二氯-2-氟乙基、2，2，2-三氯乙基和五氟乙基；5-、6-或7-元的同素环单-或二环烃环；其是不饱和的、包括部分不饱和，例如单不饱和和芳香族的；所述的同素环尤其包括6-元芳环(芳基)，诸如苯(苯基)；5-元碳环(碳环基)、诸如环戊烯(基)、环戊-1，3-二烯(基)；6-元碳环(碳环基)、诸如环己烯(基)、环己-1，3-二烯(基)和环己-1，4-二烯(基)；7-元碳环(碳环基)、诸如环庚烯(基)、环庚-1，3-二烯(基)、环庚-1，4-二烯(基)、环庚-1，5-二烯(基)和环庚-1，3，5-三烯(基)；5-、6-或7-元杂环含有1-4个选自氮原子、氧原子和硫原子的杂原子的单-或二环烃环；其是不饱和的、包括部分不饱和，例如单不饱和和芳香族的；所述的杂环尤其包括5-元芳香族杂环(杂芳基)，其含有1-4个氮原子或1-3个氮原子和1个硫或氧原子除了碳原子之外，5-元杂芳基还含有1-4个氮原子或1-3个氮原子和1个硫或氧原子作为环的成员，例如，呋喃(-2-基)、呋喃(-3-基)、噻吩(-2-基)、噻吩(-3-基)、吡咯(-2-基)、吡咯(-3-基)、异唑(-3-基)、异唑(-4-基)、异唑(-5-基)、异噻唑(-3-基)、异噻唑(-4-基)、异噻唑(-5-基)、吡唑(-3-基)、吡唑(-4-基)、吡唑(-5-基)、唑(-2-基)、唑(-4-基)、唑(-5-基)、噻唑(-2-基)、噻唑(-4-基)、噻唑(-5-基)、咪唑(-2-基)、咪唑(-4-基)、1，2，4-二唑(-3-基)、1，2，4-二唑(-5-基)、1，2，4-噻二唑(-3-基)、1，2，4-噻二唑(-5-基)、1，2，3-三唑(-2-基)、1，2，4-三唑(-3-基)、四唑(基)、1，3，4-二唑(-2-基)、1，3，4-噻二唑(-2-基)和1，3，4-三唑(-2-基)；6-元芳香族杂环(杂芳基)，其含有1-4个氮原子除了碳原子之外，6-元杂芳基还含有1-3个或1-4个氮原子作为环的成员，例如、吡啶(-2-基)、吡啶(-3-基)、吡啶(-4-基)、哒嗪(-3-基)、哒嗪(-4-基)、嘧啶(-2-基)、嘧啶(-4-基)、嘧啶(-5-基)、吡嗪(-2-基)、1，2，3-三嗪(基)、1，3，5-三嗪(-2-基)和1，2，4-三嗪(-3-基)；5-和6-元杂环(杂环基)，其含有1-4个氮原子或1-3个氮原子和1个硫或氧原子例如、吡唑烷(-3-基)、吡唑烷(-4-基)、吡唑烷(-5-基)、2-吡咯烷(-2-基)、2-吡咯烷(-3-基)、3-吡咯烷(-2-基)、3-吡咯烷(-3-基)、哌啶(-1-基)、哌啶(-2-基)、哌啶(-3-基)、哌啶(-4-基)、吡啶(1，2-二氢)-2-酮(-1-基)、哌嗪(-2-基)、吗啉(-4-基)、硫代吗啉(-4-基)。
在式(I)化合物中，R1代表任选取代的苯基或任选取代的6-元杂芳基。苯基或杂芳基可带有最多5个、优选最多3个相同或不同的取代基。根据一个具体的实施方案，苯基或杂芳基在邻位或间位可带有至少一个取代基。特别优选单取代的苯基或杂芳基。
苯基或杂芳基上的取代基选自卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基。尤其优选选自下列的取代基卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、甲基、甲氧基、甲硫基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、乙酰基、甲氧基羰基和甲氧基羰基氧基。甚至更优选的取代基选自卤素、尤其是氟或硝基和羟基。
根据一个具体的实施方案，本发明涉及式(I)的喹唑啉衍生物，其中R1代表取代的苯基。因此，R1在式(I)中表示式(II)的基团 其中L1至L5独立地表示卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基，并且#表示与喹唑啉核连接的键，其中L1至L5中的至少一个不是氢。
尤其优选以下定义的化合物其中在式(II)中L1和L2中的至少一个不是氢。特别优选的是其中在式(I)中R1表示式(IIa)的基团的化合物 其中L2如以上所定义(但不是氢)。
根据优选的实施方案，本发明涉及式(I)的喹唑啉衍生物，其中R1是3-羟基苯基。
在式(I)化合物中，X可以是硫原子或氧原子。因此，本发明涉及3，4-二氢嘧啶-2(1H)-酮或3，4-二氢嘧啶-2(1H)-硫酮衍生物，尤其涉及喹唑啉-2(1H)-硫酮(X＝S)或喹唑啉-2(1H)-酮(X＝O)衍生物。尤其优选硫酮衍生物。
在式(I)化合物中，A形成与3，4-二氢嘧啶-2(1H)-酮或3，4-二氢嘧啶-2(1H)-硫酮部分稠合的环。所述的稠环可以是5-、6-或7-元环，但尤其优选其中的稠环是6-元(喹唑啉)的式(I)化合物。按照一个具体的实施方案，本发明涉及式(Ia)的喹唑啉衍生物 其中R1和X如以上所定义，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基，或者R3与R5一起、R5与R7一起和/或R7与R9一起形成键，或者R2与R3一起、R4与R5一起、R6与R7一起和/或R8与R9一起形成氧代或硫代基基团。
由于3，4-二氢嘧啶部分的双键，所以该稠环是不饱和的。这包括部分不饱和、尤其是单不饱和的和芳香族的环。
根据一个具体的实施方案，本发明涉及式(Ia)化合物，其中R8与R9一起形成氧代基团，即，下式(Ib)的5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-喹唑啉-2(1H)-硫酮或5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢-喹唑啉-2(1H)-酮衍生物 其中R1和X如以上所定义，R2、R3、R4、R5、R6、R7独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基，或者R3与R5一起或R5与R7一起形成键，或者R2与R3一起、R4与R5一起和/或R6与R7一起形成氧代或硫代基团。
根据另一个具体的实施方案，本发明涉及式(Ia)化合物，其中R8是氢且R9是羟基，即下式(Ic)的5-羟基-3，4，5，6，7，8-六氢-喹唑啉-2(1H)-硫酮或5-羟基-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮衍生物
其中R1和X如以上所定义，R2、R3、R4、R5、R6、R7独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基，或者R3与R5一起或R5与R7一起形成键，或者R2与R3一起、R4与R5一起和/或R6与R7一起形成氧代或硫代基团。
根据另一个具体的实施方案，本发明涉及式(Ia)化合物，其中R3与R5一起以及R7与R9一起形成键，即，下式(Id)的3，4-二氢-喹唑啉-2(1H)-硫酮或3，4-二氢-喹唑啉-2(1H)-酮衍生物 其中R1和X如以上所定义，R2、R4、R6、R8独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基。
除了以上所述的其中A形成同素环的式(Ia)、(Ib)、(Ic)和(Id)化合物之外，本发明还涉及其中A与它们所连接的碳原子一起形成杂环的式(I)的喹唑啉衍生物。这包括例如下式(Ie)的化合物
其中Q是O或NH，R1、R2、R3、R4、R5和X如以上所定义。
在式(I)化合物中，稠环可带有最多10个相同或不同的取代基。尤其优选其中的烷基部分具有1-3个碳原子的上述取代基。尤其是所述的取代基选自卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、甲基、甲氧基、甲硫基、甲基氨基、二甲基氨基、三氟甲基、三氟甲氧基、羧基、氨基甲酰基、乙酰基、甲氧基羰基、甲基羰基氧基、甲基氨基羰基、二甲基氨基羰基、甲基亚磺酰基、甲基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、甲基氨基磺酰基和二甲基氨基磺酰基。甚至更优选的是选自卤素、尤其是氟、氯或溴、甲基和甲氧基的取代基。
根据一个具体的实施方案，本发明涉及式(Ia)、(Ib)、(Ic)或(Ie)的化合物，其中R2、R3、R4和R5中的至少一个不是氢。尤其优选其中的R2和R3是氢且R4和R5都是甲基的式(Ib)、(Ic)或(Ie)的化合物。
根据另一个具体的实施方案，本发明涉及式(Id)化合物，其中R2、R4和R6中的至少一个不是氢。尤其优选以下所定义的式(Id)化合物，其中R2是氢、甲基或甲氧基，R4是氢或卤素、尤其是氟或氯且R6是氢或卤素、尤其是氯或溴。
最优选的是下表1所包括的化合物
表1式(Ia)化合物
本发明化合物的盐包括优选与可药用酸或碱所形成的酸加成盐和碱加成盐。尤其优选与无机或有机酸诸如盐酸、氢溴酸和氢碘酸、磷酸、硫酸、硝酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、丙酸、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苯甲酸、马来酸和通常用于形成可药用酸加成盐的其它酸所形成的盐。碱加成盐包括本发明化合物与无机碱诸如碱金属和碱土金属氢氧化物或碳酸盐或与有机碱例如胺诸如一-、二-或三乙醇胺所形成的盐。
如果本发明化合物具有非对称中心，则包括混合物或纯净形式(对映体、非对映体)的外消旋物和旋光异构体。
本发明的喹唑啉衍生物可以互变异构形式存在。该形式(尽管未明确表示在本文所提出的化学式中)也已经被公开并包括在本发明的范围内。例如，本领域技术人员将很容易地意识到3，4-二氢嘧啶-2(1H)-酮或3，4-二氢嘧啶-2(1H)-硫酮部分可产生以下所示的互变异构体。
本发明化合物可按照本领域已知的方式来得到。
根据一个具体的实施方案，式(Ia)化合物(其中R8与R9一起形成氧代基团)、尤其是式(Ib)化合物可通过Biginelli反应通过将适当的醛(IV)、脲或硫脲(V)和适当的1，3-二羰基化合物(III)以及聚磷酸酯(PPE)一起照射、例如在微波炉中照射来得到(Ranu，B.C.，Hajra，A.和Dey，S.S.(2002)。“无需任何溶剂或催化剂的合成二氢嘧啶酮的实用和绿色的途径”。Org.Process Res.Dev.6，817-818；Cava，M.P.，Lakshmikantham，M.V.和Mitchell，M.J.(1969)。“Caseadine甲基醚的合成”。Org.Chem.34，2665-2667；Kappe，C.O.和Falsone，S.F.(1998)。“聚磷酸酯介导的二氢嘧啶的合成。Biginelli反应的改进的条件”。Synlett，718-720；Kappe，C.O.，Kumar，D.和Varma，R.S.(1999)。“利用无溶剂的Biginelli缩合法借助微波高速平行合成4-芳基-3，4-二氢嘧啶-2(1H)-酮的方法”。Synthesis，1799-1803；Kappe，C.O.，Shishkin，O.V.，Uray，G和Verdino，P.(2000)。“有丝分裂驱动蛋白Eg5抑制剂Monastrol的X射线结构、构象分析、对映体分离和绝对构型的确定”。Tetrahedron 56，1859-1862；Sabitha(2003)，同上)。将该合成方法概述在以下方案1中 在所述的方案以及下面的方案中，残基R1*、R2*、R3*、R4*、R5*、R6*、R7*、R8*、X*可以具有关于残基R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、X所示的含义。但是，所述的残基还可具有其它含义，尤其是可以表示通过已知的化学反应诸如保护、脱保护等可转化成基团R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、X的基团。
因此本发明涉及制备式(Ib)的喹唑啉衍生物的方法，该方法包括(i)将式(III′)化合物 其中R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6)烷基氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基，或R3a与R5a一起或R5a与R7a一起形成键，或者R2a与R3a一起、R4a与R5a一起和/或R6a与R7a一起形成氧代或硫代基团，其中R2a、R3a、R4a、R5a、R6a和/或R7a可用适当的保护基进行保护，与式(IV′)化合物反应 其中R1a表示苯基或6元杂芳基，它们任选地被1-5个相同或不同的选自下列的取代基所取代卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基，其中R1a可用适当的保护基进行保护，然后与式(V)化合物在聚磷酸酯的存在下进行反应 其中X表示S或O；(ii)按照本领域已知的方式例如除去保护基将形成的式(Ib′)化合物 其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a和X如以上所定义，任选地转化成所需的式(Ib)的喹唑啉衍生物；然后(iii)回收所需的喹唑啉衍生物。
此外，式(Ib)化合物还可通过还原、例如通过选择性Luche还原5-羰基官能团而转化成相应的式(Ic)的醇(Gemal，A.L.和Luche，J.-L.(1981)。“有机合成中的镧系元素。6.用硼氢化钠在氯化镧的存在下还原α-烯酮合成和机械方面”。J.Am.Chem.Soc.103，5454-5459)。将该转化方法概述在以下方案2中 因此，本发明涉及制备式(Ic)的喹唑啉衍生物的方法，该方法包括(i)将式(Ib′)化合物例如用硼氢化钠在溶剂诸如甲醇中还原 其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a和X如以上所定义，(ii)按照本领域已知的方式例如除去保护基将形成的式(Ic′)化合物 其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a和X如以上所定义，任选地转化成所需的式(Ic)的喹唑啉衍生物；然后(iii)回收所需的喹唑啉衍生物。
此外，其中R3与R5一起且R7与R9一起形成键的式(Ia)化合物、尤其是式(Id)化合物可按照以下方案3所述的方法来得到
因此，本发明涉及制备式(Id)的喹唑啉衍生物的方法，该方法包括(i)将式(VI′)化合物 其中R2a、R4a、R6a、R8a独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基，其中R2a、R4a、R6a和/或R8a可用适当的保护基进行保护，与三氯甲基氯甲酸酯(ClCO2CCl3)在溶剂诸如1，4-二烷中反应；(ii)将形成的式(VII′)化合物 其中R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定义，与N，O-二甲基羟基胺(NH(OCH3)CH3)在溶剂诸如乙醇中反应；(iii)将形成的式(VIII′)化合物 其中R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定义，与下式化合物R1a-Br其中R1a表示苯基或六元杂芳基，它们任选地被1至5个相同或不同的选自下列的取代基所取代卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基，其中R1a可用适当的保护基进行保护，在碱诸如正丁基锂的存在下在溶剂诸如四氢呋喃中反应；(iv)将形成的式(IX′)化合物
其中R1a、R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定义，与还原剂诸如NaBH4反应，随后与硫氰酸盐诸如NH4SCN或者与氰酸盐诸如NH4OCN在酸诸如HCl的存在下反应；(v)按照本领域已知的方式将形成的式(Id′)化合物 其中X、R1a、R2a、R4a、R6a、R8a如以上所定义，任选地转化成所需的式(Id)的喹唑啉衍生物；然后(vi)回收所需的喹唑啉衍生物。
本发明化合物可用作有丝分裂驱动蛋白Eg5的调节剂、尤其是抑制剂。术语“有丝分裂驱动蛋白Eg5”包括但不限于人的蛋白(也被称作KSP)、南非有爪蟾蜍同源物、来自其它物种的其它同源物以及等位变体和功能相关的蛋白。因此本发明还涉及用作Eg5调节剂、尤其是抑制剂的所述化合物。因此，本发明化合物可用于各种应用中，尤其包括治疗上的应用。因此，本发明涉及用于治疗的化合物。
按照一个具体的实施方案，本发明的化合物可用于调节有丝分裂纺锤体的形成，由此引起有丝分裂中延长的细胞周期停止。术语“调节”是指改变有丝分裂纺锤体的形成，包括增加和减少纺锤体的形成。术语“有丝分裂纺锤体的形成”是指微管通过有丝分裂驱动蛋白形成两极结构。因此，本发明化合物可用作抗有丝分裂剂，即，可用作预防或干扰有丝分裂的药物。尤其是，所述的化合物可用作M期的特异性抑制剂，即，它们可用于抑制M期的进展。
本发明化合物尤其可用于治疗细胞增殖性疾病。这些疾病包括但不限于癌症、自身免疫疾病、关节炎、移植排斥、炎性肠疾病和医学处置、包括但不限于手术和血管成形术后引起的增殖。
本发明化合物尤其可用于治疗癌症，包括实体肿瘤诸如癌症。
本发明化合物可以单独的治疗活性化合物的形式或者以与其它治疗活性化合物的混合物的形式给药于需要所述治疗的个体它们可以以自身的形式给药，但它们通常以药物组合物的形式给药，即，以活性化合物与可药用赋形剂、尤其是载体或稀释剂和/或添加剂的混合物形式给药。该化合物或组合物可肠内给药例如口服或直肠给药，或非肠道给药例如皮下、静脉内和肌肉内给药。
药物组合物和药用载体或稀释剂的性质取决于所需的给药方式。口服组合物可以以例如片剂或胶囊的形式存在，并且含有常规赋形剂，诸如粘合剂(例如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、西黄蓍胶或聚乙烯吡咯烷酮)、填充剂(例如乳糖、糖、玉米淀粉、磷酸钙、山梨醇或甘氨酸)、润滑剂(例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇或二氧化硅)、崩解剂(例如淀粉)或润湿剂(例如月桂基硫酸钠)。口服液体制剂可以水性或油性混悬液、溶液、乳液、糖浆、酏剂或喷雾剂等的形式存在，或者以用水或另一种适宜的载体重构的干燥粉末的形式存在。该类型的液体制剂可含有常规添加剂例如助悬剂、矫味剂、稀释剂或乳化剂。对于非肠道给药，可使用含有常规药用载体的溶液剂或混悬剂。
以下实施例用于解释说明本发明而没有限制本发明。
实验方法化学合成该化合物的一般方法。
所有反应均利用可购买的试剂进行，它们不经进一步纯化即可使用。将溶剂通过标准方法干燥并储存在分子筛上。所有反应均通过薄层色谱(TLC)监测，所述薄层色谱在Merck硅胶60 F254铝板上进行并用UV光观察。快速色谱在Merck硅胶60上进行。示出了用于快速色谱的溶剂混合物以及所有合成的化合物的分析数据。熔点在开口毛细管中利用BüchiMelting Point B-540装置确定，并且没有校正。1H和13C NMR波谱在Varian VXR-200，Varian VXR-300和Bruker DRX-600 NMR波谱仪上于室温下记录。将所述的溶剂用作内标。用7T APEX II质谱仪得到高分辩(HR)质谱。
一般方法A4-(杂)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮或4-(杂)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮(式(Ib)化合物)的合成。
该合成按照以下方案4所述的方法进行 简单地讲，将五氧化磷(150g)加入到无水二乙醚(300ml)和无醇氯仿(150ml)的溶液中。将反应混合物在氩气氛下回流4天。然后将该溶液从少量残余物中滗出，并将该澄清溶液减压浓缩成无色糖浆。通过将该糖浆在40℃下真空加热72小时以除去残余的痕量溶剂，得到所需的聚磷酸酯(PPE)。
将适当的式(III)的β-二酮(6.6mmol)、式(IV)的醛(6.0mmol)、脲或硫脲(18.0mmol)和PPE(900mg)置于50ml玻璃烧杯中并充分混合。然后将该玻璃烧杯置于填充有中性氧化铝(250g)的结晶皿(11.5cm直径)中。将该装置在家用微波炉(Proline SM20S，2450MHz，800 W)的转盘上以满功率(800W)照射15次，每次5-7秒，在每一次的照射循环之间有1-2分钟的冷却时间。然后将乙醇(10ml)和水(5ml)加入到反应混合物中并使固体在超声浴中重新溶解。随后将形成的溶液倒入200ml搅拌着的冰冷的水中，滤出沉淀出的粗产物。将粗产物真空干燥后，将其通过快速色谱纯化。
一般方法B4-(杂)芳基-5-羟基-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮或4-(杂)芳基-5-羟基-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮(式(Ic)化合物)的合成。
该合成按照以下方案5所述的方法进行 简单地讲，向适当的4-(杂)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮或4-(杂)芳基-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-酮(式(Ib)化合物；0.36mmol)和CeCl3·7H2O(0.36mmol)的干燥甲醇(3.6ml)悬浮液中于氩气氛下在室温下一次性加入硼氢化钠(0.36mmol)。然后将该反应混合物在该温度下搅拌30分钟。然后加入水(3ml)并将形成的悬浮液蒸发至干。将粗产物进行快速色谱(CHCl3/CH3OH 20∶1)得到产物。
一般方法C3，4-二氢-4-(杂)芳基-喹唑啉-2(1H)-硫酮的合成a)式(VII)的衣托酸酐式(VII)的衣托酸酐按照M.H.Norman，G.C.Rigdon，W.R.Hall，F.Navas，J.Med.Chem.1996，39，1172-1188所述的方法合成，并且不经分离即可用于下一步骤。该合成概括在以下方案6中
简单地讲，将适当的2-氨基-苯甲酸(式(VI)化合物；6.25mmol)、无水1，4-二恶烷(20mL)和三氯甲基氯甲酸酯(5.0g，25.2mmol，4.0当量)加入到100mL圆底烧瓶中。将该反应混合物加热回流11小时。将反应混合物冷却并在室温下搅拌过夜。用旋转蒸发器除去溶剂得到粗产物。该产物不经进一步纯化即可使用。
b)式(VIII)N-甲氧基-N-甲基酰胺式(VIII)的N-甲氧基-N-甲基酰胺从相应的衣托酸酐按照S.V.Frye，M.C.Johnson，N.L.Valvano，J.Org.Chem.1991，56，3750-3752所述的方法制得。该合成概括在以下方案7中 简单地讲，向N，O-二甲基羟基胺盐酸盐(5.12g，0.053mol)的90％含水乙醇(20mL)溶液中加入三乙基胺(5.3g，0.053mol)，在25℃下搅拌10分钟后，分批加入适当的衣托酸酐(式(VII)化合物；0.035mol)。将该反应液加热回流1.5小时，然后倒在等体积的冰和饱和碳酸氢钠上。然后通过旋转蒸发除去乙醇，将形成的含水混合物用乙酸乙酯萃取(3×20mL)，用硫酸镁和活性炭干燥并浓缩。如果得到油状物，则将其进行硅胶色谱(例如1∶1二乙醚/己烷，然后是丙酮)得到产物。
c)式(IX)的2-氨基二苯甲酮式(IX)的2-氨基二苯甲酮从相应的N-甲氧基-N-甲基酰胺按照S.V.Frye，M.C.Johnson，N.L.Valvano，J.Org.Chem.1991，56，3750-3752所述的方法合成。该合成法概述在以下方案8中 简单地讲，在剧烈搅拌下，向适当的N-甲氧基-N-甲基酰胺(式(VIII)化合物，11.1mmol)和适当的(杂)芳基溴(式R1a-Br化合物；11.1mmol)在无水四氢呋喃(65mL)中的混合物中于-78℃及氮气下以0.6mL/min加入n-BuLi的己烷溶液(13.8mL，1.6M，22.2mmol)。20分钟后，加入盐酸水溶液(1N，20mL)，将该混合物用乙酸乙酯(150mL)萃取，将乙酸乙酯用水和盐水洗涤，用硫酸镁干燥并浓缩。如果得到油状物，则将其进行硅胶色谱(己烷/乙酸乙酯，1∶1)得到产物。
d)式(Id)的3，4-二氢-4-(杂)芳基-喹唑啉-2(1H)-硫酮。
式(Id)的3，4-二氢-4-(杂)芳基-喹唑啉-2(1H)-硫酮按照D.Xu，P.G.Kucerovy，K.Prasad，O.Repic，Tetrahedron Asymmetry 1996，7，747-754所述的方法合成。该合成法概述在以下方案9中 简单地讲，将适当的2-氨基二苯甲酮(式(IX)化合物，1.0mmol)的10ml95％乙醇溶液在氮气氛下加热至65℃。向该混合物中在5分钟内分批加入38mg(1.0mmol)NaBH4并将混合物在65-70℃下搅拌1.5小时。将形成的米白色悬浮液用5ml水稀释，然后滴加92mg(1.2mol)硫氰酸铵(NH4XCN，X＝S)的1ml水溶液。在整个加入过程中将温度保持在65℃。然后将反应混合物用2ml浓盐酸的1ml水溶液处理并在65-70℃下搅拌2小时。将混合物冷却至45℃并过滤。将固体用2ml热水洗涤，然后干燥得到产物。
参考实施例12-氨基-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺方法一般方法C b)起始化合物衣托酸酐该化合物的物理和光谱数据与已经公开于S.V.Frye，M.C.Johnson，N.L.Valvano，J.Org.Chem.1991，56，3750-3752中的数据相同。
参考实施例22-氨基-4-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺方法一般方法C b)起始化合物4-氯衣托酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.30(3H，s)，3.53(3H，s)，4.78(2H，brs)，6.61(1H，dd，J＝1.9，8.2Hz)，6.67(1H，d，J＝1.9Hz)，7.30(1H，d，J＝8.2Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-34.2，61.4，115.3，116.4，117.0，130.9，137.4，148.6，169.5；ESI-HRMS m/zC9H11ClN2O2Na(MNa+)的计算值237.04013，实测值237.03956；油状物。
参考实施例32-氨基-N-甲氧基-N，3-二甲基苯甲酰胺方法一般方法C b)起始化合物3-甲基衣托酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝2.1(3H，s)，3.32(3H，s)，3.57(3H，s)，4.60(2H，brs)，6.60(1H，t，J＝7.1Hz)，7.06(1H，d，J＝7.1Hz)，7.2(1H，d，J＝7.1Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-17.8，34.9，61.3，116.6，117.1，123.4，127.2，132.6，145.1，170.8；ESI-HRMS m/zC10H14N2O2Na(MNa+)的计算值217.09475，实测值217.09468；油状物。
参考实施例42-氨基-5-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺方法一般方法C b)起始化合物5-氯衣托酸酐1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.33(3H，s)，3.57(3H，s)，4.56(2H，brs)，6.63(1H，d，J＝8.6 Hz)，7.12(1H，dd，J＝2.5，8.6Hz)，7.35(1H，d，J＝2.5Hz)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-35.9，63.3，119.9，120.2，123.4，130.7，133.3，147.4，170.6；ESI-HRMS m/zC9H12ClN2O2(MH+)的计算值215.05818，实测值215.05835。
m.p.＝69-72℃。
参考实施例52-氨基-N，3-二甲氧基-N-甲基苯甲酰胺方法一般方法C b)起始化合物3-甲氧基衣托酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.30(3H，s)，3.57(3H，s)，3.82(3H，s)，4.77(2H，brs)，6.61(1H，t，J＝7.9Hz)，6.77(1H，d，J＝7.7Hz)，6.96(1H，d，J＝7.9Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-34.5，55.7，61.1，111.4，115.9，117.0，120.9，137.4，147.5，170.0；ESI-HRMS m/zC10H15N2O3(MH+)的计算值211.10772，实测值211.10776；油状物。
参考实施例62-氨基-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺.
方法一般方法C b)起始化合物4-氟衣托酸酐1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.32(3H，s)，3.55(3H，s)，4.71(2H，brs)，6.32-6.38(2H，m)，7.37-7.41(1 H，m)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-34.2，61.2，102.9(d，J＝24，6Hz)，104.0(d，J＝22.3Hz)，112.8(d，J＝2.3Hz)，131.8(d，J＝10.9Hz)，149.7(d，J＝11.5Hz)，164.7(d，J＝148.5Hz)，169.4；ESI-HRMS m/zC9H11FN2O2Na(MNa+)的计算值221.06968，实测值221.06982；油状物。
参考实施例72-氨基-5-溴-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺.
方法一般方法C b)起始化合物5-溴衣托酸酐1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝3.33(3H，s)，3.58(3H，s)，4.68(2H，brs)，6.61(1H，d，J＝8.8Hz)，7.25(1H，dd，J＝2.6，8.8Hz)，7.49(1H，d，J＝2.6Hz)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝34.0，61.4，108.3，118.7，118.3，131.7，134.2，146.0，168.6ESI-HRMS m/zC9H11BrN2NaO2(MNa+)的计算值280.98961，实测值280.98980；m.p.＝72-74℃。
参考实施例8(2-氨基苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(参考实施例1)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.22(6H，s)，0.99(9H，s)，6.11(2H，brs)，6.57-6.65(1H，m)，6.74(1H，d，J＝8.4)，7.01(1H，m)，7.10(1H，m)，7.19-7.36(3H，m)，7.47(1H，dd，J＝1.5，8.1Hz)13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.2，18.4，25.8，115.6，117.1，118.3，120.7，122.3，123.0，129.3，134.4，134.8，141.6，151.1，155.5，198.9；ESI-HRMS m/zC19H26NO2Si(MH+)的计算值328.17273，实测值328.17280；油状物。
参考实施例9(2-氨基-4-氯苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-4-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(参考实施例2)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.21(6H，s)，0.99(9H，s)，6.20(2H，brs)，6.56(1H，dd，J＝1.9，8.7Hz)，6.73(1H，d，J＝1.9Hz)，6.99-7.07(2H，m)，7.18(1H，d，J＝7.7Hz)，7.26-7.34(1H，m)，7.40(1H，d，J＝8.8Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.1，18.5，25.9，116.2，116.5，116.8，120.7，122.3，123.3，129.6，136.2，140.6，141.4，152.0，155.7，198.2ESI-HRMS m/zC19H25ClNO2Si(MH+)的计算值362.13376，实测值362.13355；油状物。
参考实施例10(2-氨基-3-甲基苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-N-甲氧基-N，3-二甲基苯甲酰胺(参考实施例3)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.22(6H，s)，1.00(9H，s)，2.22(3H，s)，6.21(2H，brs)，6.55(1H，t，J＝7.7Hz)，6.99-7.02(1H，m)，7.11(1H，m)，7.21-7.33(3H，m)，7.38(1H，d，J＝7.4Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.1，18.5，17.6，26.0，115.1，117.8，120.9，122.5，123.0，123.5，129.4，133.1，135.4，142.1，149.7，155.6，199.5；ESI-HRMS m/zC20H27NO2SiNa(MNa+)的计算值364.17033，实测值364.17020；油状物。
参考实施例11(2-氨基-5-氯苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-5-氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(参考实施例4)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.23(6H，s)，0.99(9H，s)，6.04(2H，brs)，6.67(1H，d，J＝8.8Hz)，7.01-7.04(1H，m)，7.07-7.09(1H，m)，7.19-7.26(2H，m)，7.33(1H，t，J＝7.7Hz)，7.44(1H，d，J＝2.5Hz)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.1，18.5，25.9，118.7，119.0，120.2，120.8，122.4，123.7，129.7，133.5，134.5，140.9，149.6，155.8，197.9；ESI-HRMS m/zC19H25ClNO2Si(MH+)的计算值362.13376，实测值362.13381；油状物。
参考实施例12(2-氨基-3-甲氧基苯基)(3′-叔丁基二甲基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-N，3-二甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(参考实施例5)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(200MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.23(6H，s)，1.00(9H，s)，3.90(3H，s)，6.37(2H，brs)，6.50-6.62(2H，m)，6.82-6.90(1H，t，J＝8.1Hz)，6.98-7.02(1H，m)，7.09-7.12(1H，m)，7.20-7.41(2H，m)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.3，18.3，25.8，55.9，113.8，114.0，117.5，120.6，122.2，122.7，122.8，126.1，129.1，141.8，147.4，155.4，198.7；ESI-HRMS m/zC20H27NO3Si(MH+)的计算值358.18330，实测值358.18324；油状物。
参考实施例13(2-氨基-4-氟苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-4-氟-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(参考实施例6)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.21(6H，s)，0.98(9H，s)，6.26-6.40(3H，m)，6.36(1H，d，J＝2.5，10.9Hz)，6.98-7.05(2H，m)，7.17(1H，d，J＝7.4Hz)，7.26-7.33(1H，m)，7.47(1H，dd，J＝6.6，8.8Hz)；13C NMR(50MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.27，18.33，25.8，102.5(d，J＝24.1Hz)，103.8(d，J＝22.9Hz)，115.1，120.5，122.1，123.0，129.4，137.7(d，J＝11.5Hz)，141.6，153.5(d，J＝13.2Hz)，155.6，166.1(d，J＝253.7)，197.8ESI-HRMS m/zC19H25FNO2Si(MH+)的计算值346.16331，实测值346.16336；油状物。
参考实施例14(2-氨基-5-溴苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮方法一般方法C c)起始化合物2-氨基-5-溴-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(参考实施例7)反应物(3-溴苯氧基)(叔丁基)二甲基硅烷1H NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm)＝0.24(6H，s)，0.99(9H，s)，6.10(2H，brs)，6.63(1H，d，J＝8.5Hz)，7.01-7.07(2H，m)，7.19-7.36(3H，m)，7.57(1H，brd)；13C NMR(75MHz，CDCl3)δ(ppm)＝-4.3，18.2，25.7，106.5，118.8，119.3，120.5，122.1，123.4，129.4，136.2，136.8，140.5，149.7，155.5，197.5；ESI-HRMS m/zC19H25BrNO2Si(MH+)的计算值406.08324，实测值406.08343；油状物。
实施例14-(3-羟基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法A起始化合物环己-1，3-二酮反应物3-羟基苯甲醛/硫脲黄色固体；m.p.283℃(分解)；快速色谱CH2Cl2/CH3OH 20∶1；Rf＝0.34(CH2Cl2/CH3OH 15∶1)；1H NMR(200MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝1.71-2.02(m，2H，CH2)，2.21-2.25(m，2H，CH2)，2.41-2.57(m，2H，CH2)，5.08(d，3J＝3.2Hz，1H，CH)，6.59-6.65(m，3H，3x CH芳族)，7.04-7.11(m，1H，CH芳族)，9.35(s，1H，OH)，9.58(br，1H，NH)，10.52(br，1H，NH)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝20.5(CH2)，25.3(CH2)，36.3(CH2)，51.6(CH)，109.1(C-COCH2)，113.2(CH芳族)，114.3(CH芳族)，116.9(CH芳族)，129.3(CH芳族)，144.6(C芳族)，150.5(C-CH2)，157.3(C-OH)，174.4(C＝S)，193.8(C＝O)；HRESIMS C14H14N2O2S [M+H]+的计算值275.0849，实测值275.0851。
实施例27，7-二甲基-4-(3-羟基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法A起始化合物5，5-二甲基环己-1，3-二酮反应物3-羟基苯甲醛/硫脲黄色固体；m.p.220℃(分解)；快速色谱CH2Cl2/CH3OH 20∶1；Rf＝0.31(CH2Cl2/CH3OH 15∶1)；1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝0.92(s，3H，CH3)，1.05(s，3H，CH3)，2.06-2.53(m，4H，2x CH2)，5.10(d，3J＝3.3Hz，1H，CH)，6.64-6.68(m，3H，3x CH芳族)，7.10-7.15(m，1H，CH芳族)，9.46(s，1H，OH)，9.66(br，1H，NH)，10.57(br，1H，NH)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝32.2(CH3)，34.3(CH3)，37.7(CH2)，44.0(C(CH3)2)，55.3(CH2)，57.5(CH)，113.6(C-COCH2)，118.8(CH芳族)，119.9(CH芳族)，122.4(CH芳族)，134.9(CH芳族)，150.2(C芳族)，154.0(C-CH2)，162.9(C-OH)，180.0(C＝S)，199.1(C＝O)；HRESIMS C16H18N2O2S [M+H]+计算值303.1162，实测值303.1164。
实施例34-(3-羟基苯基)-5-羟基-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法B起始化合物4-(3-羟基苯基)-5-氧代-3，4，5，6，7，8-六氢喹唑啉-2(1H)-硫酮(实施例1)黄色固体；m.p.130℃；Rf＝0.34(CH2Cl2/CH3OH 10∶1)；非对映体混合物比率3∶1；主要的非对映体(芳环和羟基在不同侧)1H NMR(600MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝1.40-1.49(m，2H，CH2)，1.52-1.60(m，2H，CH2)，1.96-2.04(m，2H，CH2)，3.63-3.66(m，1H，CHOH)，4.73(d，3J＝6.5Hz，1H，CHOH)，4.93(s，1H，CH)，6.63-6.69(m，3H，3x CH芳族)，7.10-7.14(m，1H，CH芳族)，8.80(s，1H，NH)，9.42(s，1H，OH)，9.47(s，1H，NH)；13C NMR(150MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝17.7(CH2)，25.0(CH2)，31.8(CH2)，54.7(CH)，62.1(CH-OH)，110.0(C-CH(OH))，113.6(CH芳族)，114.4(CH芳族)，117.4(CH芳族)，129.3(CH芳族)，129.7(C-CH2)，144.7(C芳族)，157.5(C-OH)，173.2(C＝S)。
次要的非对映体(芳环和羟基在同侧)1H NMR(600MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝1.65-1.71(m，2H，CH2)，1.73-1.79(m，2H，CH2)，2.11-2.16(m，2H，CH2)，3.70-3.73(m，1H，CHOH)，4.57(d，3J＝3.1Hz，1H，CH)，4.93-4.95(m，1H，CHOH)，6.63-6.69(m，3H，3xCH芳族)，7.10-7.14(m，1H，CH芳族)，8.91(s，1H，NH)，9.44(s，1H，OH)，9.56(s，1H，NH)；13C NMR(150MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝17.6(CH2)，27.0(CH2)，31.9(CH2)，54.7(CH)，63.8(CH-OH)，110.0(C-CH(OH))，113.6(CH芳族)，114.4(CH芳族)，117.6(CH芳族)，129.3(CH芳族)，133.6(C-CH2)，144.2(C芳族)，157.6(C-OH)，173.2(C＝S)；HRESIMS C14H16N2O2S[M+H]+计算值277.1011，实测值277.1012。
实施例43，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)-甲酮(参考实施例8)反应物硫氰酸铵1H NMR(200MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.52(1H，d，J＝3.0Hz)，6.64-6.75(3H，m)，6.97-7.00(2H，m)，7.03-7.20(3H，m)，9.19(1H，brs)，9.50(1H，s)，10.65(1H，brs)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.6，113.1，114.2，114.5，116.8，121.2，123.0，126.9，128.1，129.5，134.1，145.7，157.5，174.4；ESI-HRMS m/zC14H13N2OS(MH+)的计算值257.07431，实测值257.07419；m.p.＝217-219℃。
实施例57-氯-3，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-4-氯苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮(参考实施例9)反应物硫氰酸铵1H NMR(200MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.5(1H，d，J＝2.6Hz)，6.61-6.70(3H，m)，6.96-7.14(4H，m)，9.30(1H，brs)，9.47(1H，s)，10.70(1H，brs)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.2，113.1，113.6，114.7，116.8，120.2，122.7，128.8，129.7，132.4，135.5，145.3，157.7，174.6；
ESI-HRMS m/zC14H11ClN2OSNa(MNa+)的计算值313.01724，实测值313.01700；m.p.＝93-95℃。
实施例63，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)-8-甲基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-3-甲基苯基)(3′-叔丁基-二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮(参考实施例10)反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝2.31(3H，s)，5.49(1H，d，J＝3.3Hz)，6.66-6.68(2H，m)，6.74(1H，d，J＝7.7Hz)，6.93(1H，t，J＝7.4Hz)，7.03-7.16(3H，m)，9.33(1H，brs)，9.49(1H，s)，9.52(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝17.8，57.4，113.9，115.2，117.5，122.6，123.4，123.8，125.5，130.2，130.6，133.1，146.1，158.2，176.0；ESI-HRMS m/zC15H14N2OS(M+)的计算值270.08268，实测值270.08101；m.p.＝255-256℃。
实施例76-氯-3，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-氯苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮(参考实施例11)反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.55(1H，d，J＝3.3Hz)，6.68-6.69(2H，m)，6.75(1H，d，J＝7.5Hz)，7.04(1H，d，J＝9.0Hz)，7.14-7.19(1H，m)，7.26-7.29(2H，m)，9.30(1H，brs)，9.56(1H，s)，10.79(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.1，113.0，114.7，115.9，116.7，123.3，126.4，126.5，128.1，129.7，133.1，145.2，157.6，174.5；
ESI-HRMS m/zC14H12ClN2OS(MH+)的计算值291.03534，实测值291.03518；m.p.＝108-110℃。
实施例83，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)-8-甲氧基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-3-甲氧基苯基)(3′-叔丁基二甲基氧基苯基)甲酮(参考实施例12)反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.52(1H，d，J＝3.03Hz)，6.67-6.78(4H，m)，6.93-7.02(2H，m)，7.11-7.16(1H，m)，8.83(1H，brs)，9.38(1H，brs)，9.51(1H，s)；13C NMR(50MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.6，55.9，110.1，113.1，114.5，116.8，118.6，121.8，123.0，123.5，129.5，144.7，145.1，157.5，174.2；ESI-HRMS m/zC15H14N2O2SNa(MNa+)的计算值309.06682，实测值309.06711；m.p.＝254-256℃。
实施例97-氟-3，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-4-氟苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮(参考实施例13)反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.53(1H，d，J＝3.0Hz)，6.66-6.84(5H，m)，7.12-7.20(2H，m)，9.34(1H，brs)，9.51(1H，s)，10.74(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.2，100.9(d，J＝26.3)，109.6(d，J＝21.8)，113.1，114.6，116.8，117.1(d，J＝2.5Hz)，128.9(d，J＝9.7)，129.7，135.6(d，J＝11.5Hz)，145.5，157.6，161.6(d，J＝242.2Hz)，174.5；ESI-HRMS m/zC14H11FN2OSK(MK+)的计算值313.02077，实测值313.02087；m.p.＝85-87℃。
实施例106-溴-3，4-二氢-4-(3′-羟基苯基)喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-溴苯基)(3′-叔丁基二甲基甲硅烷基氧基苯基)甲酮(参考实施例14)反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)5.55(1H，d，J＝3.0Hz)，6.67-6.69(2H，m)，6.74(1H，d，J＝7.7Hz)，6.98(1H，d，J＝8.5Hz)，7.13-7.16(1H，m)，7.37-7.41(2H，m)，9.31(1H，brs)，9.55(1H，s)，10.78(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.7，113.7，115.0，115.5，117.0，117.5，124.4，130.1，130.5，131.7，134.2，146.0，158.4，175.3；ESI-HRMS m/zC14H12BrN2OS(MH+)的计算值334.98482，实测值334.98416；m.p.＝115-117℃。
实施例116-氯-3，4-二氢-4-苯基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-氯苯基)(苯基)甲酮反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.66(1H，d，J＝3.3)，7.05(1H，d，J＝8.4Hz)，7.26-7.41(6H，m)，9.36(1H，s)，10.8(1H，s)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝56.9，116.7，124.0，126.9，127.3，128.5，129.0，129.5，133.9，144.5，175.4；
ESI-HRMS m/zC14H12ClN2S(MH+)的计算值275.04042，实测值275.04086；m.p.＝225-227℃。
实施例126-氯-4-(2′-氟苯基)-3，4-二氢喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物(2-氨基-5-溴苯基)(2′-氟苯基)甲酮反应物硫氰酸铵1H NMR(300MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝5.92(1H，J＝2.8Hz)，7.03-7.07(2H，m)，7.22-7.43(5H，m)，9.23(1H，brs)，10.88(1H，brs)；13C NMR(75MHz，[D6]DMSO)δ(ppm)＝51.5，115.9，116.1(d，J＝5.7Hz)，121.8，124.9(d，J＝3.4Hz)，126.2，126.5，128.5，128.7(d，J＝4.0Hz)，130.2(d，J＝8.0Hz)，130.5(d，J＝13.1Hz)，133.2，159.0(d，J＝246.8)，174.5；ESI-HRMS m/zC14H11ClFN2OS(MH+)的计算值293.03100，实测值293.03101；m.p.＝279-281℃。
实施例133，4-二氢-4-苯基喹唑啉-2(1H)-硫酮方法一般方法C d)起始化合物2-氨基二苯甲酮反应物硫氰酸铵该化合物的物理和光谱数据与已经公开于D.Xu，P.G.Kucerovy，K.Prasad，O.Repic，Tetrahedron Asymmetry 1996，7，747-754的数据相同。试验和药理学数据Eg5487H的表达和纯化将对应于氨基酸1-487的南非有爪蟾蜍Eg5的序列通过聚合酶链反应(PCR)从Eg5的全长克隆来扩增，然后克隆到引入C-末端的(Gly)5(His)6tag的pQE70(SphI/BgIII)内。将该蛋白质在大肠杆菌M15(pREP4)中在18℃下在含有1mM异丙硫基-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG)、100μg/ml氨比西林、25μg/ml卡那霉素和2％(v/v)乙醇的LB中表达5小时。将收获的细胞溶解在含有5mM巯基乙醇(ME)的缓冲液A(50mM KPi、100mM NaCl、0.1mMMgATP蛋白酶抑制剂(Roche)，pH 7.0)中。将澄清的溶解产物负载到HIS-Select Cobalt Affi Gel柱(Sigma)上，用补充有10mM咪唑、2mM ME、10％(w/v)甘油的缓冲液A洗涤，然后用150mM咪唑、50mM KCl、10％(w/v)甘油、10mM ME，pH 7.3洗脱。将缓冲液通过透析转变成50mM3-(N-吗啉代)丙磺酸/KOH、50mM KCl、1mM MgCl2、1mM EGTA、10mM ME、20％(w/v)甘油，pH 7.0。将蛋白质的浓度调节至2mg/ml(通过Bradford试验利用牛血清白蛋白(BSA)作为标准测定)。将Eg5487H在液体乙烷中冷冻并储存在液氮中。
体外微管聚合作用将50μl纯化的猪脑微管蛋白、50μl BRB80(80mM PIPES pH 6.8，1mM MgCl2和1mM EGTA)、42.5mg甘油和1.25μl 100mM GTP的混合物在37℃下保温30分钟。然后将聚合后的微管通过加入1μl 10mM紫杉醇(Sigma)的DMSO溶液进行稳定，然后在37℃下继续保温20分钟。将该悬浮液以70000rpm的转速于30℃下在TLA100转子(Beckman)中离心分离30分钟。将形成的微管颗粒在37℃下重新悬浮在补充有20μM紫杉醇的60μl试验缓冲液(10mM咪唑/乙酸盐、5mM乙酸钾、2mM EGTA和4mM乙酸镁，pH 6.8)中。将该微管悬浮液保存在室温下。通过Bradford法进行测定并用BSA作为标准，测得聚合的微管蛋白的终浓度为80μM。IC50的测定为了确定可抑制Eg5的微管刺激的ATP酶活性达50％的化合物浓度(IC50)，使用EnzChekPhosphate Assay(Molecular Probes)。终浓度为40nM Eg5487H、4μM微管(微管蛋白二聚体的浓度，通过Bradford法利用BSA作为标准测定)和1mM MgATP。通过在室温下测定2小时内在365nm处吸光度的增加来测定ATP酶的活性。在实验开始时以不同的浓度加入1％(v/v)抑制剂的DMSO溶液(或1％(v/v)DMSO作为对照)。在每种条件下均进行至少4次测定，然后将结果平均。Eg5487H的微管-刺激活性通过从含有Eg5487H和微管的测定值中减去背景活性(在不存在Eg5487H的条件下用微管测得)来得到。IC50通过假设的非竞争性酶抑制作用并将酶活性对抑制剂浓度的理论上预期的依赖性拟合为实验性的微管刺激的ATP酶活性来确定。用于拟合的等式是v＝Vmax*IC50/([抑制剂]+IC50)+vres，v是测定的相对ATP酶速率，vmax是最大的ATP酶速率，vres是在高抑制浓度下的残余活性。
测定了实施例1至3的化合物的IC50值。实施例1和3的化合物的IC50为2μM，即，与monastrol(其IC50为30μM)相比，它们作为Eg5抑制剂的效力要强10倍以上。实施例2化合物的IC50为0.2μM，因此比monastrol的效力强100倍以上。所有这三种化合物在远大于IC50的浓度下均可完全抑制Eg5活性。在对照实验中，未观察到这三种化合物对常规驱动蛋白、蟾蜍驱动蛋白样蛋白1(Xklp1)或蟾蜍Kid(XKid)的抑制作用，显示对Eg5的抑制作用是特异性的。
细胞培养和FACS分析然后测试所述化合物对于呈指数生长的人组织培养细胞的作用效果。
将Hela细胞在补充有10％(v/v)FCS的DMEM培养基中培养至60％汇合。然后将培养基更换为含有不同抑制剂或DMSO的新鲜培养基，并且将细胞在37℃下在5％CO2中放置18小时。溶于DMSO的抑制剂在培养基中的终体积通常等于或小于0.1％(v/v)。对于洗除实验，将细胞按照以上所述的方法进行处理。18小时后，将该细胞用磷酸盐缓冲的盐水(PBS)洗涤，用新鲜培养基覆盖，然后在37℃下在5％CO2中继续培养24小时。
在用抑制剂处理前后以及在化合物洗除之后，通过表面荧光(配备有CCD照相机的Zeiss Axioscope 2)或通过共焦显微镜方法(Zeiss LSM 510)观测细胞。对于表面荧光显微镜法，将细胞在-20℃下用甲醇固定，然后进行免疫荧光。将微管蛋白用一级小鼠单克隆抗-α微管蛋白抗体DM1A(Sigma)和次级兔多克隆Alexa 488-结合的抗小鼠抗体(Molecular Probes)进行染色。将DNA用Hoechst 33342染色。对于共焦的显微镜方法，将细胞与XX％的戊二醛混合并进行免疫荧光处理。将DNA依次用一级多克隆兔抗磷酸组蛋白H3抗体(Upstate Biotechnology)和二级多克隆Alexa 546结合的抗兔抗体染色。将微管按照以上所述的方法染色。
将HeLa细胞在补充有各种浓度的三种化合物之一、monastrol或DMSO的培养基中保温18小时。然后将细胞固定并通过FACS和免疫荧光法分析。
对于FACS分析，在抑制剂处理之后或洗除之后将细胞从培养板上剥离，并通过在Heraeus Megafuge 1.0R中以1200rpm离心分离5分钟来收集。将细胞颗粒用5ml PBS洗涤1次，然后重新悬浮在0.5ml PBS中。将细胞通过加入4ml 70％(v/v)乙醇进行固定并在-20℃下保温过夜。将固定的细胞在1200rpm下离心分离5分钟，用5ml PBS洗涤并重新悬浮在1ml PI溶液(10μg/ml碘丙锭、100μg/ml RNAse A、0.05％Triton X100的PBS溶液)中。在37℃下在黑暗中30分钟后，将细胞通过荧光活化的细胞分类法(FACS)进行分析。
FACS分析表明，monastrol在100μM下可以有效地将细胞封闭在G2/M(74％)。较低的浓度(10μM)仅促进非常弱的G2/M细胞的增加(31％，在对照中为23％)。这与前面的报告相一致。三种待测化合物也可以将细胞封闭在G2/M，但起作用的浓度却远小于monastrol。事实上，10μM实施例1或实施例3的化合物的效果与100μM monastrol的效果相同，促进了77％G2/M细胞的累积。惊人地是，仅1μM的实施例2的化合物就足以累积75％的G2/M细胞。在用0.1μM实施例2的化合物处理过的细胞中未观察到细胞周期分布的异常。因此，研究了该化合物的中间浓度的效果，并且发现0.5μM所述的化合物导致47％G2/M细胞的累积。有丝分裂停止所需的浓度类似于体外抑制Eg5活性所需的浓度。这意味着细胞周期停止的机理是通过Eg5抑制作用特异性地介导的。
Monastrol的一个有用的特性是当短暂应用时对细胞是无毒的；一旦洗除，细胞便重新开始有丝分裂。因此，测试这三种新化合物是否也具有这些性质。将HeLa细胞与各种浓度的不同化合物一起保温，如前面的实验所述的那样。18小时后，将化合物洗除，并将该细胞在新鲜培养基中保温24小时，然后分析。在所有的试验条件下，细胞均重新进入细胞周期，表明这三种新化合物与monastrol一样也可以从细胞中洗除并且是无毒的。
然后，我们通过免疫荧光用抗微管蛋白抗体和Hoechst研究用不同化合物处理的细胞的形态学。对于monastrol和这三种化合物发现了相同的表型细胞停止了有丝分裂并且微管和染色体径向排列。
蟾蜍卵提取物最后，测试实施例1-3的化合物在蟾蜍卵提取物中是否会产生与在人组织培养细胞中相同的效果。
按照文献中描述的方法制备用细胞抑制因子(CSF)-停止的南非有爪蟾蜍卵提取物。按照描述用精核和四甲基罗丹明标记的微管蛋白在周期提取物中进行纺锤体组装实验。在纺锤体组装前，将溶于DMSO的1％(v/v)(或更少)抑制剂加入到提取物中。作为对照，将1％DMSO加入到提取物中。将纺锤体固定并离心到盖玻片上。将DNA用DAPI染色。然后通过表面荧光显微法(配备有Roper CoolSnap HQ照相机的Zeiss Axiovert 135)观察结构。然后对纺锤体和异常微管结构进行计数。
将100μM monastrol、10μM实施例1或3的化合物或1μM实施例2的化合物加入到蟾蜍卵提取物中。监测其中的纺锤体组装，结果发现所有化合物均抑制两极纺锤体的形成并促进通过微管和染色体的径向排列所形成的周期图的形成，就象以前关于monastrol所描述的以及在组织培养细胞中所观察到的那样。
权利要求
1.式(I)的喹唑啉衍生物或其可药用盐 其中R1表示苯基或6元杂芳基，它们任选地被1-5个相同或不同的选自下列的取代基所取代卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基和C1-C6-烷基羰基氧基；X表示S或O；A与它们所连接的碳原子一起形成5-、6-或7-元的、部分不饱和的或芳香族的同素环或杂环，它们可带有最多10个相同或不同的选自下列的取代基卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基和二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基。
2.权利要求1所述的喹唑啉衍生物或其盐，其中在式(I)中，R1表示式(II)的基团 其中L1至L5独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基，并且#表示与喹唑啉核连接的键，其中L1至L5中至少有一个不是氢。
3.权利要求1或2所述的喹唑啉衍生物或其盐，其中在式(I)中，R1是3-羟基苯基。
4.权利要求1至3中的任何一项所述的喹唑啉衍生物或其盐，其中在式(I)中，X是S。
5.权利要求1至4中的任何一项所述的喹唑啉衍生物或其盐，其中在式(I)中，A与它们所连接的碳原子一起形成6-元的、部分不饱和的或芳香族的同素环，它可以具有最多8个相同或不同的选自权利要求(1)所定义的基团的取代基。
6.权利要求5所述的喹唑啉衍生物或其盐，它是式(Ia)的喹唑啉衍生物或其盐 其中R1和X如权利要求1至5中的任何一项所定义，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、氧代、巯基、硫代、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基，或者R3与R5一起、R5与R7一起和/或R7与R9一起形成键，或R2与R3一起、R4与R5一起、R6与R7一起和/或R8与R9一起形成氧代或硫代基团。
7.权利要求6所述的喹唑啉衍生物或其盐，其中在式(Ia)中，R8和R9与它们所连接的碳原子一起形成羰基，并且R2、R3、R4、R5、R6、R7如权利要求6所定义。
8.权利要求6所述的喹唑啉衍生物或其盐，其中在式(Ia)中，R8是氢、R9是羟基，R2、R3、R4、R5、R6、R7如权利要求6所定义。
9.权利要求5所述的喹唑啉衍生物或其盐，它是式(Id)的喹唑啉衍生物或其盐 其中R1和X如权利要求1至5中的任何一项所定义，R2、R4、R6、R8独立地表示氢、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、C1-C6-烷基、C1-C6-烷氧基、C1-C6-烷硫基、C1-C6-烷基氨基、二-(C1-C6-烷基)氨基、C1-C6-卤代烷基、C1-C6-卤代烷氧基、羧基、氨基甲酰基、C1-C6-烷基羰基、C1-C6-烷氧基羰基、C1-C6-烷基羰基氧基、C1-C6-烷基氨基羰基、二-(C1-C6-烷基)氨基羰基、C1-C6-烷基亚磺酰基、C1-C6-烷基磺酰基、羟基磺酰基、氨基磺酰基、C1-C6-烷基氨基磺酰基或二-(C1-C6-烷基)氨基磺酰基。
10.权利要求1所述的喹唑啉衍生物或其盐，它是以下化合物或其盐
11.用于治疗的权利要求1至10中的任何一项所述的喹唑啉衍生物或其盐。
12.包含一种或一种以上权利要求1至10中的任何一项所述的喹唑啉衍生物或其盐和任选的一种或多种可药用赋形剂的药物组合物。
13.权利要求1至10中的任何一项所述的喹唑啉衍生物或其盐用于治疗癌症的用途。
全文摘要
本发明涉及式(I)的喹唑啉衍生物或其可药用盐，其中R
文档编号A61P35/00GK101094839SQ200580045832
公开日2007年12月26日 申请日期2005年11月4日 优先权日2004年11月4日
发明者T·萨瑞, G·阿萨纳修斯, I·韦尔诺斯, M·加特纳, N·松德尔－普拉斯曼, S·瓦希里基, T·迈尔, S·许默 申请人:欧洲分子生物学实验室, 莱比锡大学, 马克思－普朗克公司