专利名称：一种接枝蛋白水凝胶生物材料及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种中枢神经系统损伤修复用的生物材料及其制备方法。
背景技术：
当代医学应用组织工程学方法修复组织损伤，就是在损伤或缺损部位填充生物材料，提供自体细胞向损伤部位迁移生长的三维支架，达到损伤部位形态重建和功能恢复的目的。
对于应用于中枢神经系统的生物材料，除应具备生物相容性、可加工性和可消毒性等一般性能外，还应具有以下性能特点(1)应适时地在体内降解并被机体吸收，即材料的降解速度和代谢吸收速度应与神经再生修复的速度相匹配；(2)应具有大孔结构，以保证神经修复所需的三维空间，使毛细血管和纤维组织可以长入；(3)应保证神经修复所需的营养供应，即提供受损神经再生所需的可起到调节神经细胞生长、分化并促进神经修复和组织再生的神经生长因子。迄今，国内外公开的用于神经修复的组织工程材料有胶原基质、丙烯腈与氯乙烯共聚物、聚碳酸酯、硝化纤维、聚α羟酸果酸或硅树脂等。这些材料可在不同程度上促进神经细胞轴突的再生，但在生物相容性、理化性能、降解速率和缓释性等方面还不能令人满意。
在组织工程学发展史上，透明质酸(Hyaluronic acid，HA)是较早被应用的一种生物材料。1934年Meyer和Palmer自牛眼玻璃体内提取分离到透明质酸，1970年代率先用于眼科作为粘弹性保护剂，之后又被用作治疗骨关节炎的材料。但由于纯的透明质酸凝胶含有大量的聚阴离子，不适合细胞粘附和作为神经生长的基质，导致透明质酸作为组织修复材料没有在中枢神经系统广泛应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种植入脑损伤部位，适于神经细胞的迁移生长，能够为神经细胞提供营养，促进神经组织再生修复的生物材料。
本发明用于中枢神经损伤修复的生物材料，是采用共价交联的方法，将透明质酸和层粘连蛋白(laminin)交联在一起所制成的疏松多孔的水凝胶。它是用透明质酸(HA)在碳二亚胺盐酸盐(EDC)的介导下用己二酸二酰肼(ADH)进行交联的方法制备透明质酸凝胶；采用共价交联的方法，将透明质酸和层粘连蛋白交联在一起，采用冷冻干燥技术，制备具有活性的水凝胶，用作脑组织工程的框架材料。其具体制备方法为1)以去离子水配制质量百分比为0.8～1.2％的透明质酸溶液，以盐酸溶液调溶液pH为酸性，最适宜的pH值为4.75；先后加入己二酸二酰肼和碳二亚胺盐酸盐，搅拌均匀。之后以氢氧化钠溶液调pH值为6～8，得透明质酸水凝胶。将水凝胶用去离子水在超声波中清洗2～3次，冰冻后放入冻干机内冰冻干燥。
2)将溶涨的水凝胶以不同浓度的丙酮梯度脱水，形成干燥凝胶聚合物，加入1，1’-羰基二咪唑(CDI)溶液以激活水凝胶中的羟基基团，使水凝胶能够与层粘连蛋白的结合；用干丙酮洗涤以除去未结合的羰基二咪唑，将羰基二咪唑活化的凝胶用100mM的碳酸钠缓冲溶液洗涤置换水凝胶里的丙酮；将层粘连蛋白溶液在室温下与活化的水凝胶混合搅拌24～48小时；将获得的产物在磷酸盐缓冲液中完全清洗4小时；在pH＝7～9的100mM的碳酸氢钠缓冲溶液封闭2小时；进行冷冻干燥，制成备具有活性的水凝胶，用作脑组织工程的框架材料。
其中，在制备透明质酸凝胶过程中加入己二酸二酰肼越多，交联度越高，凝胶的硬度越高，在体内的降解时间越长。因此，可以通过改变已二酸二酰肼的用量来调节最终产品在体内的降解时间。适宜的己二酸二酰肼质量配比为，己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶4～1∶10；最佳配比为，己二酸二酰肼∶透明质酸＝1∶6。所用碳二亚胺盐酸盐质量配比为，碳二亚胺盐酸盐∶透明质酸＝1∶2.5～1∶5.0。
还可以在透明质酸分子链中引入磺酸基团以延长水凝胶在体内降解时间。
本发明采用1，1’-羰基二咪唑作为多肽交联剂，将凝胶聚合物中的羟基活化，并使多肽的N端和活化位置结合。
本发明采用透明质酸作为框架材料有其独特的优点透明质酸的重复二糖单元在所有物种和组织中都是一致的，因此不导致自身的免疫排斥；透明质酸溶液具有高度的粘弹性，近似于活体生物组织；透明质酸有调节细胞外液的化学组成、润滑和促进创伤愈合、抑制瘢痕组织形成等功能；有调节炎症、促进血管生成的作用。它是一种具有亲水性和水膨胀性的聚合物，随着其多孔结构的产生，具有了对新生组织定向生长的支持和诱导的潜能。
纯的透明质酸凝胶含有大量的聚阴离子，不适合细胞粘附和作为神经生长的基质。而层粘连蛋白是一种高分子量细胞外基质糖蛋白，能促进细胞的粘附、生长、迁移、分化和轴突再生。本发明采用化学接枝的方法，将透明质酸和层粘连蛋白交联就克服了纯透明质酸水凝胶不利于神经元黏附的弊端。发明人通过神经细胞培养的方法检测了这种生物材料的神经细胞相容性，并对该材料在大鼠脑组织中的生物相容性和促进组织修复的能力进行了检测，证实这种生物材料能显著促进神经细胞的贴附性和神经轴突再生，同时还有促进血管再生，抑制胶质瘢痕形成的功效。
具体实施例方式
以下通过实施例对本发明作进一步说明。
实施例1 制备透明质酸水凝胶以去离子水配制质量百分比为1％的透明质酸溶液，将1M盐酸溶液逐滴加入透明质酸溶液，同时搅拌，使二者充分混和，直至其pH值达到4.75；按所用透明质酸量的10％～25％称取己二酸二酰肼加入透明质酸溶液中，充分搅拌；再按所用透明质酸量的20％～40％称取碳二亚胺盐酸盐加入透明质酸溶液中，搅拌10～20分钟；再以氢氧化钠溶液调pH值为6～8，得透明质酸水凝胶；将水凝胶用去离子水在超声波中清洗2～3次，冰冻后放入冻干机内进行冰冻干燥。
实施例2 水凝胶与层粘连蛋白共价交联(1)取溶涨的水凝胶聚合物3～4g，依次用30/70、60/40、80/20的丙酮/DW溶液各洗一次，纯丙酮洗两次，干燥丙酮洗三次，逐步将水凝胶聚合物脱水，最后保存在干燥丙酮中；(2)将5ml 1，1’-羰基二咪唑(CDI)溶液加入到步骤1制备的干燥凝胶聚合物中，在轻微搅拌下活化反应15分钟。CDI用无水丙酮配成150mg/mL；(3)用干丙酮洗5次以上，除去未结合的CDI，将CDI活化的凝胶用100mM的碳酸钠缓冲溶液(PH＝8.5)洗涤5次，置换全部的丙酮溶剂；(4)将CDI活化的水凝胶浸在pH＝8.5的100mM碳酸氢钠缓冲溶液(0.6mg/ml)中；
(5)将层粘连蛋白溶液在室温下与活化的水凝胶混合搅拌24～48小时；(6)将水凝胶在磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)中完全清洗4小时；(7)进一步在室温下pH＝8.5的100mM的碳酸氢钠缓冲溶液封闭2小时；(8)于冷冻干燥机上冻干。
实施例3 水凝胶的表征分析取冷冻干燥后的凝胶在扫描电镜下观察，可见其为一个疏松的多孔框架结构。其孔布满整个凝胶，孔壁很薄，各个孔间有直接或者间接的连接。各孔的孔径约在100～200μm。采用压汞仪对干态下的凝胶的孔隙率和孔径分布进行检测，测定干态下液体汞向孔隙内侵入的体积和压力，结果为该生物材料的孔径在0～1000μm间不均匀分布，大部分的孔集中在20～200μm间，其中孔径在80μm左右的孔最多，平均孔隙率为90％。
上述检测结果表明，按本发明方法制备的水凝胶可以容纳大量细胞迁移进人，特别利于新生血管长入。
实施例4 吸水率测定称取一定重量的干燥水凝胶固体，于pH＝7.2的磷酸缓冲溶液中4℃平衡2小时后，用滤纸将水凝胶表面的水吸干，称重量，根据下式计算吸水率。
H＝(Waq-Wdry)/WaqH吸水率，Waq吸水后重量，Wdry干燥时重量本发明生物材料的吸水率为75-95％。这是反映水凝胶包含水能力的指标，也是反映凝胶的孔隙率的重要指标。这也说明按本发明方法制备的凝胶具有很高的孔隙率。
实施例5 细胞培养和体内移植实验检测本发明将透明质酸水凝胶经过接枝laminin改性后，通过细胞培养证实接枝laminin的水凝胶能显著促进神经细胞的贴附性，并能促进神经轴突的再生。将接枝了laminin的水凝胶植入损伤的成年大鼠大脑皮层中，发现凝胶能够促进血管的再生和胶质细胞的迁移凝胶的内部，并能够抑制胶质瘢痕的形成。在接枝了laminin的水凝胶能够显著促进轴突的长入凝胶的内部，而没有接枝laminin的水凝胶中没有发现轴突长入，只是在凝胶和脑组织的界面处发现了纤维。
体外实验证实，在对照材料(纯透明质酸)的神经细胞经过5天培养没有贴壁和轴突生长的迹象，而在接枝了层粘连蛋白的凝胶上培养的神经细胞贴附很好并生长出轴突。
权利要求
1.一种用于中枢神经损伤修复的生物材料，其特征在于，它是采用共价交联的方法，将透明质酸和层粘连蛋白(laminin)交联在一起，通过冷冻干燥的方法，用水作为造孔剂制备成的具有多孔结构，多数孔径在20～200μm的水凝胶。
2.权利要求1所述生物材料的制备方法，其特征在于，它包括如下工艺步骤1)以去离子水配制0.8～1.2％透明质酸溶液，以盐酸溶液调溶液pH值为酸性，先后加入己二酸二酰肼和碳二亚胺盐酸盐，以氢氧化钠溶液调pH值为6～8，得透明质酸水凝胶，在超声波中用去离子水清洗后冰冻干燥；2)将溶涨的水凝胶进行梯度丙酮脱水，加入1，1’-羰基二咪唑溶液，用干丙酮洗涤，再用碳酸钠缓冲溶液洗涤；将层粘连蛋白溶液在室温下与活化的水凝胶混合搅拌24～48小时，在磷酸盐缓冲液中完全清洗4小时，在pH＝7～9的100mM的碳酸氢钠缓冲溶液封闭2小时，冷冻干燥。
3.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，以盐酸溶液调透明质酸溶液pH值为4.75。
4.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，所用己二酸二酰肼和透明质酸的质量配比为1∶10～1∶4。
5.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，所用碳二亚胺盐酸盐和透明质酸的质量配比为1∶2.5～1∶5.0。
6.根据权利要求2所述生物材料的制备方法，其特征在于，用1’-羰基二咪唑(CDI)作为多肽交联剂，将凝胶聚合物中的羟基活化，并使多肽的N端和活化位置结合。
全文摘要
本发明涉及一种中枢神经损伤后修复用的水凝胶材料。它是采用共价交联方法将具有神经生长活性的层粘连蛋白(Laninin)接枝到透明质酸水凝胶的分子骨架上，制备成用于脑组织工程的水凝胶框架材料，能够促进神经轴突的再生、血管的长入。
文档编号A61L27/52GK1927414SQ200610076649
公开日2007年3月14日 申请日期2006年4月28日 优先权日2006年4月28日
发明者徐群渊, 候少平, 刘丙方, 崔福斋, 马军, 田维明, 张进禄, 杨慧, 段德义 申请人:首都医科大学北京神经科学研究所