专利名称：糖基超支化抗hiv黏附抑制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于抑制艾滋病的、可作为HIV等病毒附着抑制剂的糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物，属于生物技术领域。
背景技术：
获得性免疫缺陷综合症(AIDS，简称艾滋病)是一种目前世界上对人类健康威胁最严重的疾病之一，它由I型人免疫缺陷病毒(HIV-1)引起。HIV-1侵入人体后，通过其表面的包膜蛋白与辅助性T细胞(宿主细胞)表面的CD4分子以及辅助受体的结合吸附，感染和耗竭辅助性T细胞，进而消弱人体免疫系统。
针对HIV病毒进入并与宿主细胞融合的3个基本步骤(病毒表面的包膜糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合，从而吸附到宿主细胞上；gp120再与宿主细胞表面辅助受体CCR5/CXCR4等相互作用，使病毒与宿主细胞膜更接近；gp41产生一系列构象变化，其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜，导致病毒包膜与细胞膜的最终融合，病毒RNA进入细胞)，目前主要开发了三类病毒进入抑制剂(HIV entry inhibitors)干扰gp120与受体结合的HIV附着抑制剂(Attachment inhibitors)；HIV辅助受体拮抗(Co-receptorantagonists)；阻止gp41核心结构形成的HIV融合抑制剂(Fusion inhibitors)。它们显示出抑制HIV病毒进入宿主细胞的效果，但在制备、生物相容性、细胞靶向性方面还有很多缺陷和不足(D.Christopher Meadows and JacquelynGervay-Hague，Chem.Med.Chem，2006，1(1)16～29)1)HIV辅助受体拮抗剂和部分HIV附着抑制剂是通过结合在宿主细胞表面分子CD4以及趋化因子受体CCR5、CXCR4上，从而干扰HIV表面gp120与受体结合。虽然这些药物具有保护T4细胞CD4的功能，但它们长期结合在正常细胞表面的CD4、CXCR4和CCR5上势必引发宿主细胞中毒，影响人体正常的免疫功能；2)HIV融合抑制剂和部分HIV附着抑制剂是通过直接与病毒HIV刺突上的gp41或gp120结合达到阻止HIV与宿主细胞表面分子CD4以及趋化因子受体CCR5、CXCR4结合，试图实现抗HIV活性；但由于这些试剂均以埋藏在糖蛋白gp120或gp41糖链下面的特定肽段为靶，因此作用效率低，而且这类合成或改性的多肽由于合成困难、造价高等缺点而很难在目前实现临床应用。
因此，需要开发以gp120包膜糖蛋白表面糖链为靶、且与其具有强相互作用的糖基化树枝状聚合物作为HIV病毒附着抑制剂，将HIV病毒抑制在其进入宿主细胞的最初阶段，从而达到预防和治疗HIV病毒对人体的感染和侵蚀1)聚酰胺-胺型树枝状聚合物是以大量表面端基为特征的单分散三维聚合物，能通过调节树枝状聚合物的支化代数(n)以及表面官能团的种类来调整最终聚合物的大小，实现与病毒表面gp120三聚体的体积匹配，从而增强与病毒gp120包膜糖蛋白的相互作用；2)聚酰胺-胺型树枝状聚合物表面的大量端基能为其与HIV病毒间的识别提供多重相互作用；且可以通过改变树枝状聚合物表面基团的种类和数量来调节聚合物在体内的生物相容性；3)糖在生物识别过程中具有重要作用，将单糖或寡糖连接在聚酰胺-胺型树枝状聚合物的末端，不但可以为糖基化树枝状聚合物与病毒gp120包膜糖蛋白的相互作用提供重要的氢键作用，而且避免了制备多糖类抗体及肽类病毒抑制剂的繁琐过程。
发明内容
本发明提供了一种抑制HIV病毒进入人体宿主细胞的附着抑制剂。该附着抑制剂易于合成、生物相容性好、细胞靶向性好。
本发明提供了一种糖基超支化抗HIV黏附抑制剂，其特征在于，该抑制剂为末端带有单糖或寡糖部分的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
所述的聚合物是糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物，它包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核，并通过至少两代扩展。
所述的糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物是基于氨基核的聚(酰胺-胺)树枝状聚合物；或者是基于乙二胺核或氨基核的聚(酰胺-胺)树枝状聚合物；或者是聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。
本发明优选方案所述的树枝状聚合物是下列通式I的糖基树枝状聚合物
其中I是聚酰胺-胺型树枝状聚合物的核；Z是聚酰胺-胺型树枝状聚合物的支化单元；n是代表聚酰胺-胺型树枝状聚合物支化代数的正整数，为2-8；A是可以通过任选的连接基团X与内部支化单元Z连接的单糖或寡糖A1、连有聚乙二醇链的单糖或寡糖A2、聚乙二醇单甲醚链A3；A1、A2、A3在聚合物中的摩尔分数为a、b、c，其中a、b、c的范围均为0～1.0，且a+b+c＝1，但a和b不能同时为0；聚合物中引入含有糖基的部分a+b要大于10％；A2和A3结构中聚乙二醇链的分子量范围是44～5000；其中用于连接内部支化单元Z和表面基团A的连接基团X选自如下基团之一 糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物是多支化大分子，可通过从最初的核单元开始，由丙烯酸甲酯和乙二胺通过一系列连续的、步进式的、向外发散的、支链与支链的相加形成有规律的分枝单元层(代，generation)来构建的三维高度有序的聚合物，其具有如下特征1.初始核(I)可以带有一个或多个官能度，并且是点样或具有显著大小以便获得最终的树枝状的聚合物拓扑结构；
2.支化重复单元(Z)层与初始核连接；3.官能端基(如A)通过任选的连接基团(如连接基团X)与树枝状聚合物表面结合。本发明使用树枝状结构作为连接单糖或寡糖部分的构架；本发明并不限于本文具体描述的球形树枝状聚合物，而可以以任意树枝状结构(包括含有结构缺陷的树枝状结构)为基础。各种形状和结构的聚酰胺-胺型树枝状聚合物对本领域技术人员来说是众所周知的。
所用聚酰胺-胺型树枝状聚合物的聚合度n及其最终粒径大小是非常重要的。本发明优选的树枝状聚合物包括且优选通过至少三代扩展的、扩展范围在三代至八代的树枝状聚合物(即n＝3～8)；最终树枝状聚合物的粒径范围在4nm～200nm之间。
最有用的糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物为单分散的形式，即优选的聚合物在单分散溶液中可得到相同的产物，并因此具有均一的大小和形状的树枝状聚合物。
根据本发明，糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物表面上所带基团A主要有三类A1，单糖或寡糖；A2，连有聚乙二醇链的单糖或寡糖；A3，聚乙二醇单甲醚链。树枝状聚合物的分支可以以-NH2、-OH、-SH、-CHO、-COOR(R为H、CH3、C2H5)等封端，随后与含有反应官能团的单糖或寡糖(A1)、连有聚乙二醇链的单糖或寡糖(A2，其中聚乙二醇链的结构式为-(OCH2CH2)m-)、聚乙二醇单甲醚链(A3，-(OCH2CH2)m-OCH3)直接反应，也可采用双官能度的偶联剂将A部分偶联在聚酰胺-胺型树枝状聚合物的表面。
A1和A2中所述的单糖含有3-6个碳原子并且包括醛糖和酮糖。单糖的实例包括甘油醛、赤藓糖、苏糖、核糖、阿糖、木糖、来酥糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、核酮糖、木酮糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖和塔格糖等。优选的单糖含有5或6个碳原子，最优选的单糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖。单糖可以D或L异构体的形式存在；D和L形式及其混合物都属于本发明的范畴之内。但优选的立体异构体是D型异构体。
A1和A2中所述的寡糖是指含有2-10个糖单元，并且优选2-6个糖单元，这些糖单元可以是相同或不同的，其实例包括海藻糖、木二糖、龙胆二糖、麦芽糖、几丁二糖、果糖低聚糖、甘露三糖等。
通过本领域技术人员众所周知的标准化学方法可以制备本发明的糖基树枝状聚合物，合适的制备方法如下列实例中的描述。
发明效果如上所述，已经发现本发明的糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物可作为HIV附着抑制剂来抑制HIV病毒对宿主细胞的感染。本文所用的术语“抑制”在最广泛意义上包括对人体内HIV病毒的毒性可完全或部分抑制或压制。最重要的是，该附着抑制剂特异性附着在HIV病毒颗粒以及被HIV病毒颗粒感染的宿主细胞表面，对人体的免疫系统无细胞毒性。
本发明可通过选择表面基团A1、A2、A3的种类和比例，对HIV附着抑制剂的尺寸、亲水性、生物相容性、与HIV病毒的相互作用能力进行调节，使该附着抑制剂的性能可以在很宽的范围内变化，以满足不同医学用途的要求。
本发明的制备方法由于使用均已商品化的化合物为原料，因此有利于进行大规模的生产，容易实现产业化。
具体实施例方式
以下实施例1～5依次制备了末端仅含单一A1的树枝状聚合物；末端仅含单一A2的树枝状聚合物；末端既含A2又含A3的树枝状聚合物；末端同时含有A1、A2、A3的树枝状聚合物；末端同时含不同种类A1的树枝状聚合物。进一步说明本发明，但不限定本发明的范围。在下列实施例中，PAMAM树枝状聚合物指的是以美国专利4507466、4558120、4568737和4587329中具体描述的氨核为基础的聚(酰胺-胺)树枝状聚合物G0.5 PAMAM、G1.0PAMAM、G1.5 PAMAM、G2.0 PAMAM、G2.5 PAMAM、G3.0 PAMAM或更高代；PAMAM(EDM)树枝状聚合物指的是以乙二胺核为基础的聚(酰胺-胺)树枝状聚合物。
实施例1PAMAM(EDM)树枝状聚合物的合成在冰盐浴条件(-5℃～-10℃)及氮气保护下，将23g(0.132mol)丙烯酸甲酯缓慢滴加到20ml溶有1g(0.0165mol)乙二胺的甲醇溶液中，室温避光反应48h。反应结束后，在低于40℃的条件下将溶剂及过量乙二胺减压蒸干，得到淡黄色粘稠液体0.5代PAMAM(EDM)(G0.5)，产率约96％。1H NMR(CDCl3)，δ(ppm)2.45～2.58(4H，-CH2N-)，2.33～2.50(8H，-N-CH2-CH2-)，2.70～2.86(8H，-N-CH2-CH2-)，3.60～3.68(12H，-CH3).
在冰盐浴条件(-5℃～-10℃)及氮气保护下，将溶有1g G0.5PAMAM(EDM)的10ml甲醇溶液缓慢滴加进溶有60g乙二胺的60ml甲醇溶液中，室温避光反应72h。反应结束后，在低于40℃的条件下将溶剂及过量乙二胺减压蒸干，得到淡黄色粘稠液体1.0代PAMAM(G1.0)，产率约98％。1H NMR(D2O)，δ(ppm)2.57～2.62(4H，-CH2-N-)，2.38～2.50(8H，-N-CH2-CH2-)，2.65～2.76(8H，-N-CH2-CH2-)，3.19～3.28(8H，-CH2-CH2-NH2)，2.58～2.63(8H，-CH2-CH2-NH2)。
G1.5、G2.5……G7.5PAMAM(EDM)的制备步骤同G0.5的制备相似，仅随代数增加加成反应时间相对延长(控制在48～96h)、加成温度适当升高(40～60℃)、且乙二胺投料量也随之增加(乙二胺与酯基的摩尔比始终为2∶1)；G2.0、G3.0……G8.0PAMAM(EDM)的制备步骤同G1.0的制备相似，仅随代数增加酰胺化反应时间相对延长(控制在48～96h)、酰胺化反应温度适当升高(40～60℃)、且乙二胺投料量也随之增加(丙烯酸甲酯与氨基的摩尔比始终为2∶1)。
各代树枝状聚合物经红外光谱及核磁共振(1H NMR)分析，整代PAMAM(EDM)为氨基末端的树状分子(G1.0、G2.0、G3.0…)在红外谱图中没有1750cm-1吸收峰，且在核磁谱图中δ3.7处无峰；而半代PAMAM为酯基末端的(G0.5、G1.5、G2.5、G3.5…)在红外谱图中均有1750cm-1吸收峰，且在核磁谱图中δ3.7处有峰。
表1各代PAMAM(EDM)树枝状聚合物在30℃时的特性黏度
β-D-吡喃半乳糖基-硫醇基丙酸(β-D-Gla-MPA)(A1)的合成 在含有11.7g(30mmol)半乳糖-β-五醋酸盐的60mL无水二氯甲烷(DCM)溶液中，依次加入10.5mL(120mmol)巯基丙酸和5.7mL(45mmol)BF3·Et2O，室温搅拌反应5小时后，再加入TLC(BuOH∶CH3OH∶H2O；2∶1∶1，v/v/v)继续反应5小时。反应结束后，将产物倒入冰水中、分液、转移下层油相，水相部分用无水DCM洗涤三次；收集所有油相部分，依次经蒸馏水洗涤、无水硫酸钠干燥、过滤、减压干燥、硅胶柱分离(DCMCH3OH)，最终得到无色油状产物β-D-Gla-MPA，收率为75％；1H NMR(D2O)δ＝2.50(2H，H-8)，2.90(2H，H-7)，3.52(1H，H-2)，3.61(1H，H-3)，3.66(1H，H-6B)，3.67(1H，H-5)，3.72(1H，H-6A)，3.93(1H，H-4)，4.46(1H，H-1).13C NMR(D2O，25℃)δ＝27.3(C-7)，38.6(C-8)，61.7(C-6)，69.5(C-4)，70.3(C-2)，74.55(C-3)，79.6(C-5)，86.65(C-1)，181.4(C-9).
末端含半乳糖的树枝状聚合物的制备将5mL含有0.1mmol G4.0 PAMAM(EDM)的DCM溶液缓慢滴加到10mL含有6.4mmolβ-D-Gla-MPA的DCM溶液中，室温反应24小时后，减压干燥并进一步冷冻干燥，得到末端为β-D-吡喃半乳糖的树枝状聚合物，其中β-D-吡喃半乳糖(A1)在树枝状聚合物表面基团A中的比例为100％。1H NMR(D2O)，δ(ppm)2.45～2.58(4H，-CH2N-)，2.33～2.50(8H，-N-CH2-CH2-)，2.70～2.86(8H，-N-CH2-CH2-)，3.60～3.68(12H，-CH3)，2.51(2H，H-8)，2.89(2H，H-7)，3.52(1H，H-2)，3.60(1H，H-3)，3.65(1H，H-6B)，3.66(1H，H-5)，3.72(1H，H-6A)，3.92(1H，H-4)，4.47(1H，H-1).
G3.0……G8.0 PAMAM(EDM)的反应步骤同G4.0的制备相似，仅随代数增长，反应时间相对延长(24h～72h)，且β-D-Gla-MPA投料量也随之增加(β-D-Gla-MPA与PAMAM末端氨基的摩尔比为2∶1)。
实施例2
将3.19mmol对β-D-吡喃半乳糖苷-苯胺(4-Aminophenyl-β-D-galactopyranoside)和0.215mmol Fmoc-PEG2000-NHS(San Carlos，CA)溶解在20mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH 7.4，137mM NaCl，10mM H3PO4，2.7mMKCl)中，再加入0.22mmol Sulfo-NHS室温反应6小时，然后加入1.135mmolEDC继续反应48小时。反应结束后，将产物用装有蒸馏水的透析袋(截留分子量为500)反复透析数次，所得溶液经冷冻干燥后得到白色固体，将其加入到50mL哌啶的DMF溶液中(25％)室温反应4小时，再依次经过冷冻干燥、透析、干燥，得到纯半乳糖-PEG5000-胺(A2，Galactose-PEG5000-amine)，产率达52％。
将0.1mmol G4.5 PAMAM(EDM)放入1.5M NaOH溶液中皂化4小时后，将皂化产物用甲醇滴定沉淀并浸泡24hr，然后再依次用丙酮、乙醚将产物洗涤，在40℃下减压烘干，得到端基为羧基的G4.5 PAMAM(EDM)-COOH，收率为98％。G3.5……G7.5 PAMAM(EDM)的皂化反应步骤同G4.5的皂化反应相似。
将0.1mmol G4.5 PAMAM(EDM)-COOH加入到溶有9.6mmol纯半乳糖-PEG5000-胺(A2，Galactose-PEG5000-amine)的硼酸盐缓冲溶液中，室温反应24小时，所得溶液依次经透析、冷冻干燥，最终得到末端为半乳糖-PEG5000链(A2)的树枝状聚合物，其中A2在树枝状聚合物表面基团A中的比例为100％。1H NMR(D2O)，δ(ppm)3.5～3.7(H，-CH2-CH2-O-)，6.8～7.2(H，Ar)，3.4(H，-O-CH3)，2.5～4.4(H，Galactose).
G3.5……G7.5 PAMAM (EDM)的反应步骤同G4.5的制备相似，仅随代数增长，反应时间相对延长(24h～72h)，且半乳糖-PEG5000-胺(A2，Galactose-PEG5000-amine)投料量也随之增加(Galactose-PEG5000-amine与PAMAM末端羧基的摩尔比为2∶1)。
实施例3按实施例2中的方法首先制备纯半乳糖-PEG3400-胺(A2，Galactose-PEG3400-amine)，再将0.1mmol G4.5 PAMAM(EDM)-COOH加入到溶有3.2mmol纯半乳糖-PEG3400-胺(A2，Galactose-PEG3400-amine)和3.2mmol甲氧基聚醚胺(A3，MeO-PEG3400-amine)的硼酸盐缓冲溶液中，室温反应24小时后，按实施例2中的方法后处理，最终得到末端为半乳糖-PEG3400链(A2)和甲氧基聚醚链(A3)的树枝状聚合物，其中A2和A3在树枝状聚合物表面基团A中的比例各占50％。G3.5……G7.5 PAMAM(EDM)的反应步骤同G4.5的制备相似，仅随代数增长，反应时间相对延长，且半乳糖-PEG3400-胺(A2，Galactose-PEG3400-amine)和甲氧基聚醚胺(A3，MeO-PEG3400-amine)投料量也随之增加。
实施例4按实施例2中的方法首先制备纯半乳糖-PEG450-胺(A2，Galactose-PEG450-amine)，再将0.1mmol G4.5 PAMAM(EDM)-COOH加入到溶有2.1mmol对甘露糖基苯胺(A1，NH2-Ph-Mannose)、2.2mmol半乳糖-PEG450-胺(A2，Galactose-PEG450-amine)和甲氧基聚醚胺(A3，MeO-PEG450-amine)的硼酸盐缓冲溶液中于室温反应48小时。按实施例2中的方法后处理，最终得到末端为甘露糖基(A1)、半乳糖-PEG450链(A2)和甲氧基聚醚链(A3)的树枝状聚合物，其中A1、A2和A3在树枝状聚合物表面基团A中的比例分别为33％、34％和33％。
实施例5将0.1mmol G4.5 PAMAM(EDM)-COOH加入到溶有1.6mmol对甘露糖基苯胺(A1，NH2-Ph-Mannose)、1.6mmol对乳糖基苯胺(A1，NH2-Ph-Lactose)和3.2mmol对葡萄糖基苯胺(A1，NH2-Ph-Glucose)的硼酸盐缓冲溶液中，室温反应48小时后，最终得到末端为甘露糖基、乳糖基和葡萄糖基的树枝状聚合物，三种糖基在树枝状聚合物表面基团A中的比例分别为25％、25％和50％。
在实施例1～5中，随聚合物支化代数及表面基团(A1、A2、A3)组成的不同，聚合物显示的结合抑制百分率范围介于5％至75％之间，半数抑制浓度IC50在10～175μmol/L之间。
本发明聚合物的药理研究(抑制HIV-1复制体外实验)
将生长状态良好的MT4细胞配制成浓度为60×105个/mL的细胞悬液，以每孔100mL加入96孔板中。将待测聚合物过滤除菌，用RPMI1640培养液进行系列稀释(1.0μM、0.5μM、0.25μM、0.125μM、0.0625μM、0.03125μM)，每孔50μL加入96孔板中。再加滴度分别是100TCID50和1000TCID50的50μLHIV-1，每种聚合物浓度和病毒滴度组合做4复孔。设阳性对照(AZT+MT4细胞+HIV-1)、阴性对照(水+MT4细胞+HIV-1)、聚合物毒性对照(聚合物+MT4细胞)和空白对照(MT4细胞+HIV-1)。在37℃、5％CO2条件下培养7天。每天定时观察细胞生长情况，培养第三天每孔补加50μL新鲜培养基，第六天观察细胞病变(CPE)。全部实验按照操作规程在生物安全3级(BSL-3)实验室内完成，重复三次。计算抑制率和半数抑制浓度IC50。
权利要求
1.一种糖基超支化抗HIV黏附抑制剂，其特征在于，该抑制剂为末端带有单糖或寡糖部分的聚酰胺-胺型树枝状聚合物。
2.根据权利要求1所述的抑制剂，其特征在于，其中所述的聚合物是糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物，它包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核，并通过至少两代扩展。
3.根据权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，其中所述的糖基化聚酰胺-胺型树枝状聚合物是基于氨基核的聚(酰胺-胺)树枝状聚合物。
4.根据权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，其中所述的树枝状聚合物是基于乙二胺核或氨基核的聚(酰胺-胺)树枝状聚合物。
5.根据权利要求2所述的抑制剂，其特征在于，其中所述的树枝状聚合物是聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。
6.根据权利要求1-5之一所述的抑制剂，其特征在于，其中所述的树枝状聚合物是下列通式I的糖基树枝状聚合物 其中I是聚酰胺-胺型树枝状聚合物的核；Z是聚酰胺-胺型树枝状聚合物的支化单元；n是代表聚酰胺-胺型树枝状聚合物支化代数的正整数，为2-8；A是可以通过任选的连接基团X与内部支化单元Z连接的单糖或寡糖A1、连有聚乙二醇链的单糖或寡糖A2、聚乙二醇单甲醚链A3；A1、A2、A3在聚合物中的摩尔分数为a、b、c，其中a、b、c的范围均为0～1.0，且a+b+c＝1，但a和b不能同时为0；聚合物中引入含有糖基的部分a+b要大于10％；A2和A3结构中聚乙二醇链的分子量范围是44～5000；其中用于连接内部支化单元Z和表面基团A的连接基团X选自如下基团之一
7.根据权利要求6所述的所述的抑制剂，其特征在于，所述的A1和A2单糖中含有3-6个碳原子。
8.根据权利要求6所述的所述的抑制剂，其特征在于，所述的A1和A2单糖以D或L异构体的形式存在，或为D和L形式及其混合物的形式存在。
9.根据权利要求6所述的所述的抑制剂，其特征在于，所述的A1和A2中寡糖含有2～10个糖单元。
全文摘要
一种糖基超支化抗HIV黏附抑制剂，属于生物技术领域。现有三类HIV病毒进入抑制剂在制备、生物相容性、细胞靶向性方面存在不足。本发明的抑制剂为末端带有单糖或寡糖部分的聚酰胺－胺型树枝状聚合物。所述的聚合物是糖基化聚酰胺－胺型树枝状聚合物，它包括与至少两个树枝状分支共价结合的多价核，并通过至少两代扩展。所述的糖基化聚酰胺－胺型树枝状聚合物是基于氨基核的聚(酰胺－胺)树枝状聚合物；或者是基于乙二胺核或氨基核的聚(酰胺－胺)树枝状聚合物；或者是聚(丙烯亚胺)树枝状聚合物。通过本领域技术人员众所周知的标准化学方法可以制备本发明的糖基树枝状聚合物，该附着抑制剂易于合成、生物相容性好、细胞靶向性好。
文档编号A61P31/18GK1957945SQ20061011425
公开日2007年5月9日 申请日期2006年11月3日 优先权日2006年11月3日
发明者张腾, 金日光 申请人:北京化工大学