专利名称：：一种建立帕金森病动物模型的方法
技术领域：
：本发明涉及生物医学领域，具体涉及生物医学中神经病学、老年医学及转基因
技术领域：
。更具体地，涉及一种帕金森病小鼠模型，建立该帕金森病小鼠模型的方法，以及该帕金森病小鼠模型的用途。
背景技术：
：帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)是由于中脑黑质多巴胺能神经元大量丢失而表现出运动功能障碍的脑疾病，也是第二大中枢神经系统退行性疾病。具有关统计，在65岁以上的人群中，PD的发病率近21随着我国人口老龄化进程的发展，帕金森病病人的人数逐年增多，给家庭和社会带来了沉重的负担。ra的致病因素有多种，既有遗传因素又有环境因素(VilaMandPrzedborskiS.NatureMedicine2004,10S叩pl:S58-62)。有关对PD的研究比较集中的是PD相关基因(包括a-^甜cJe^、parh'/、sjv7/^'"/7-入〃-Z7、/^ese/7/7i仏/、戶7M7、AAVA^、M^么M;/t-/等)、氧化应激和线粒体损伤等，但目前的机制研究还远远不能满足临床治疗的需求。随着对PD的深入研究，研究者发现泛素-蛋白降解系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)的异常同PD有密切的关系，已经发现的帕金森病相关基因中，与UPS相关的就多达三种-Synuclein(与泛素多聚化有直接的关系)，Parkin(—种E3泛素蛋白连接酶)和UCH-L1(泛素C端水解酶L1)，另外在PD病人的脑内存在Lewy小体，该小体含有多种蛋白，主要有a-synuclein、parkin、synphilin-1、UCH-L1、IkB和它的泛素连接酶SCF(eTrCP)等蛋白成分。在正常神经细胞内，错误折叠，功能异常的蛋白通常被泛素化，再经蛋白降解系统被清除掉，而在PD患者的神经细胞内，错误折叠和功能异常的蛋白不能被蛋白降解系统清除，形成了沉积物。现有技术用于研究帕金森病的动物模型有许多种，按照致病的病因可分为两类1)毒素类模型，如6-羟多巴(6-0HDA)、百草枯(Paraquat,某除草剂)、鱼藤酮(Rotenone)、1-甲基-4-苯基-1，2，3,6-四氢吡啶(MPTP)等；2)基因类模型。目甜转基因类帕金森病的动物模型只有过表达野生型或突变型a-synuclein—种，一些基因剔除小鼠如多巴胺D2受体缺失小鼠、同源盒转录因子engrailedl和engrailed2双缺失小鼠、孤儿核受体Nurrl缺失小鼠、转录因子Pitx3缺失小鼠、转录因子Lmxlb缺失小鼠、E3泛素连接酶Parkin缺失小鼠等在不同时间和不同程度地表现出神经元细胞的丢失。以上这些模型都不能准确模拟帕金森病的病理过程，比如MPTP模型中Lewy小体并不出现；ot-synuclein转基因动物，由于受不同启动子的影响，表型上有很大的差异，虽然模型中存在Lewy小体样沉积物，但不具有多巴胺能神经元地进行性丢失过程。上述动物模型存在的不足之处极大地限制了这些模型的应用。本领域迫切需要开发更可靠的帕金森病动物模型。BAG5(6c7-2-associate^/aZ^a加《e/e》是2004年克隆的BAG信号接头蛋白家族的一个新成员(KaliaSKetal.Neuron.2004，44(6):931-45)，通过抑制Parkin的E3酶活性及Hsp70的分子伴侣活^fe'，可以加剧多巴胺能神经元的死亡。Parkin可泛素化oc-synuclein、sy叩hilin-l等许多蛋白，再通过蛋白降解系统，使得这些底物被降解，如果特异地在小鼠多巴胺能神经元中过表达BAG5，在Parkin/a-synuclein上游层面上影响Parkin的功能，是一种更有效的可靠的帕金森病的动物模型，可用于帕金森病的机制研究和药物研发。
发明内容本发明的目的是提供一种帕金森病(Parkinson'sdisease,PD)小鼠模型以及建立该帕金森病小鼠模型的方法。本发明的另一目的是提供上述该帕金森病模型的用途。在本发明的第一方面，提供了一种建立新的帕金森病小鼠模型的方法，包括下述步骤(i)提供一线性化的转基因构建物，该构建物从5'至3'依次含有(a)大鼠酪氨酸羟化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和BAG5-Flag，(c)人生长激素小基因；(ii)将步骤(i)中的线性化的构建物基因引入C57/BL6小鼠受精卵；(iii)将步骤(ii)的受精卵移植到假孕的远交系ICR小鼠的输卵管；(iv)产生转基因的非人哺乳动物，所述的非人哺乳动物的基因组中整合有BAG5-Flag表达盒，所述表达盒含有(a)大鼠酪氨酸羟化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和BAG5-Flag,(c)人生长激素小基因。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(v)对步骤(iv)获得的转基因小鼠进行鉴定。在另一优选例中，所述的鉴定是通过PCR。在另一优选例中，所述的方法还包括步骤(vi)将获得的转基因小鼠与正常的C57/BL6小鼠杂交，以获得子代。在本发明的第二方面，用上述方法获得了帕金森病小鼠模型。在本发明的第三方面，提供了一种用本发明上述方面获得的帕金森病小鼠模型的用途，它被用于泛素-蛋白降解系统参与帕金森病的病理进程机制的研究和药物开发。本发明将BAG5cDNA融合Flag小标志物(以利于蛋白的鉴定及区别于内源性BAG5蛋白)克隆在多巴胺能神经元特异性的转基因载体中，经转入技术获得了转基因小鼠，建立了一种帕金森病小鼠模型；在此基础上完成了本发明。在本发明中BAG5cDNA来自小鼠，编码447个氨基酸残基，包括4个BAG结构域和第五个推测的短的BAG结构域，在蛋白的羧基末端融合了Flag小标志物(8个氨基酸残基)；在本发明中采用了多巴胺能神经元特异性的酪氨酸羟化酶的启动子，启动子来源大鼠，人源的酪氨酸羟化酶的启动子也可以采用。在本发明的产生转基因动物的方法中，首先构建一转基因构建物，该构建物从5'至3'依次含有(a)大鼠酪氨酸羟化酶的启动子，(b)-globin基因的一部分和BAG5-Flag,(c)人生长激素小基因；在获得了构建物之后，可用常规方法将线性化的构建物转入受精卵中，待小鼠出生后用PCR检测鉴定BAG5-Flag是否整合入其基因组，从而获得转基因小鼠。本发明帕金森病小鼠模型的主要用途包括:用于研究泛素-蛋白降解系统与帕金森病的病理进程的机制，用于开发延缓、治疗帕金森病的药物。本发明的主要优点在于BAG5通过抑制Parkin的E3酶活性及Hsp70的分子伴侣活性，可以加剧多巴胺能神经元的死亡。Parkin可泛素化a-synuclein、sy叩hilin-l等许多蛋白，再通过蛋白降解系统，使得这些底物被降解，特异地在小鼠多巴胺能神经元中过表达BAG5，在Parkin/oc-synuclein上游层面上影响Parkin的功能，是一种更有效的可靠的帕金森病的动物模型。图1显示MSCV-BAG5-Flag转染SH-SY5Y细胞株后，通过WesternBlot检测到约52KD的BAG5-Flag蛋白。图2是多巴胺能神经元特异性的转基因构建物prTH-globin-hGH，该构建物从5'至3'依次含有(a)大鼠酪氨酸羟化酶的启动子(长度为6.8kb，可在人多巴胺能细胞株SH-SY5Y中引导增强型绿色荧光蛋白的表达，见图2a)，(b)-globin基因的一部分(l.Okb)，(c)人生长激素小基因(提供PolyA尾)，见图2b。图3是建立的多巴胺能神经元特异性过表达BAG5-Flag的转基因构建物prTH-globin-BAG5_Flag-hGH(图3a)，转基因质粒prTH-globin-BAG5-Flag-hGH用限制性内切酶NotI线性化后(14.7kb)，胶回收纯化(图3b),图3c显示了对BAG5-Flag转基因阳性小鼠鉴定。具体实施例方式实施例l克隆小鼠的BAG5cDNA抽提8周龄C57/BL6小鼠脑的总RNA，5ugRNA在20ul体系中逆转录，取lul为模板，在20ul体系中，利用引物Primerl:5'ACCTG^77tGTGAAACTGAACACAGAAGTATG3'(SEQIDNO:3)和Primer3:5'CGATCAAGCCCTGCAGCTCTGTC3'(SEQIDN0:4)经PCR扩增BAG5cDNA5，端，利用引物Primer2:5'GACAGAGCTGCAGGGCTTGATCG3'(SEQIDN0:5)和Primer4:5'IDN0:6)经PCR扩增BAG5cDNA3，端；再取lulBAG5cDNA5'端PCR产物和lulBAG5cDNA3'端PCR产物混合，利用引物Primerl和Primer4经PCR扩增全长BAG5cDNA。Primer4中含有Flag标记序列(引物中下划线部分)，以利于蛋白的鉴定及区别于内源性BAG5蛋白；Primer1和Primer4中含有限制性内切酶EcoRI的切点(引物中斜体部分)，全长BAG5cDNAPCR产物经EcoRI酶切后胶回收纯化，克隆至质粒载体pBluescriptIISK中(Stratagene,EcoRI酶切后用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)脱磷，胶回收纯化)，重组质粒命名为pBluescriptBAG5-Flag，经DNA序列测定其序列完全正确(SEQIDN0:1),相应的氨基酸序列见SEQIDN0:2;用限制性内切酶EcoRI将BAG5-Flag片段从质粒pBluescriptBAG5-Flag中切下，克隆至逆转录病毒载体MSCV-EGFP(来自HarinderSingh博士实验室，芝加哥大学分子遗传与细胞生物学系)的EcoRI位点，鉴定方向，重组质粒命名为MSCV-BAG5-Flag，转染人多巴胺能SH-SY5Y细胞株(AmericanTissueCultureCollection),采用Flag抗体(F3165,Sigma,U.S.A.)，图1显示MSCV-BAG5-Flag转染SH-SY5Y细胞株后，通过WesternBlot检测到约52KD的BAG5-Flag蛋白。实施例2prTH-globin-BAG5-Flag-hGH质粒的构建建立多巴胺能神经元特异性的转基因构建物prTH-globin-hGH，该构建物从5'至3'依次含有(a)大鼠酪氨酸羟化酶的启动子(长度为6.8kb，可在人多巴胺能细胞株SH-SY5Y中引导增强型绿色荧光蛋白的表达，见图2a)，(b)-globin基因的一部分(l.Okb)，(c)人生长激素小基因(提供PolyA尾)，见图2b;用限制性内切酶EcoRI将BAG5-Flag片段从质粒pBluescriptBAG5-Flag中切下，克隆至步骤3转基因载体-globin基因中的EcoRI位点，鉴定方向，建立多巴胺能神经元特异性过表达BAG5-Flag的转基因构建物prTH-globin-BAG5-Flag-hGH(图3a)。实施例3BAG5-Flag经显微注射引入小鼠受精卵以及转基因阳性鼠的产生转基因质粒prTH-globin-BAG5-Flag-hGH用限制性内切酶NotI线性化后(M.7kb)，胶回收纯化(图3b)。将线性化的DNA(约500拷贝)注射至小鼠受精卵的雄原核中，注射后的受精卵移植给假孕小鼠。约20天后，小鼠出生。小鼠出生3周后，剪尾提取DNA,用两套PCR反应检测，引物如表l所示，分析是否有转基因整合。两套引物名称TH-1(SEQIDN0:7)和B5-6(SEQIDN0:9)、Globinl(SEQIDN0:8)和B5-6(SEQIDNO:9)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>图3c显示了对BAG5-Flag转基因阳性小鼠鉴定。转基因阳性出现870bp(TH-1和B5-6)和551bp(Globinl和B5-6)带，野生型或阴性小鼠无特异带扩增。以质粒DNA为阳性对照。结果，共获得转基因阳性小鼠4只，经交配繁育建系，建立了转基因小鼠系。在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式落于本申请所附权利要求书所限定的范围。.序列表<110>复旦大学<120>—种建立帕金森病动物模型的方法<130>11<160>9<170〉Patentlnversion3.1<210>1<211>1464<212>DNA<213>动物<400>1acctgaattcagatctcccggtgaccatgatagtgtttgtcaggttcaactccagctatg60gcttcccagtggaggtcgattctgacaccagcatcttgcagctcaaggaagtggttgcta120agcgacagggggttccagctgaccagctgcgtgtgatttttgccgggaaggagcttccga180atcacctgacggttc雄actgtgacctggaacaacagagtattgtacacatagtacaga240gaccacggaggagaagtcatgaaacaaatgcatctggaggggacgaaccccagagcacct300cagagggctccatatgggagtccaggagcttgacacgagtggacctgagcagccataccc360tgccggtggactctgtggggctggcggtcattctggacacagacagtaagagggattcag420aagcagccagaggtccagcagttaaacccacctacaacagc纖catctactgcaaag480gcccctgccacaaggtccagcctggaaagctccgagttcagtgtggcacctgcaaacaag540caaccctcaccttggcccagggcccatcttgctgggacgatgtcttaattccaaaccgga600tgagtggtgagtgccagtctccagactgccctggaaccagagctgaatttttctttaaat660gtggagcacacccaacctcagacaaggacacgtcggtagctttgaacctgatcaccagca720acaggcgcagcatcccttgcatagcgtgcacagatgtcaggagccctgtcctggtcttcc780agtgtaaccaccgtcacgtgatctgtttggactgtttccacttgtattgtgtcacaagac840tcaacgatcggcagtttgtccacgatgctcaacttggctactccctgccgtgtgtagctg900gctgtcccaactccctgattaaagagctccatcacttcaggatccttggagaagagcagt960.acactaggtaccagcagtatggggccgaggaatgcgtgctgcaaatgggaggtgtgctgt1020gcccccgtcctggctgtggagctggactgctacctgaacagggccagaggaaagtcacct1080gcgaagggggcaacggcctgggctgcgggtttgttttctgccgggactgtaaggaagcat1140accatgaaggggattgcgactcactgctcgaaccctcaggagccacttctcaggcctaca1200gggtggacaaaagagccgctgagcaagctcgctgggaggaggcctccaaggaaaccatca1260agaagaccaccaagccttgtcctcgctgcaacgtgccaattgaaaaaaacggaggatgta1320tgcacatgaagtgtcctcagccccagtgcaagctg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